Plos ONE: Casticin okrepi TRAIL-inducirane apoptoze želodca raka celic skozi Endoplazemski Retikulum Stress

Povzetek

Ozadje

Casticin je eden od glavnih aktivnih sestavin, pridobljenih iz fructus Viticis
in so poročali, da izvaja anti-rakotvoren učinek na različnih rakavih celic, vendar natančen mehanizem temelji ta dejavnost še vedno ni jasno.

materiali in metode

Apoptotsko dejavnosti casticin (1,0 mol /l) in TRAIL (25, 50 ng /ml), samostojno ali v kombinaciji v želodčnega raka celičnih linij BGC-823, SGC-7901 in MGC-803 smo zaznali z uporabo celično apoptozo kompleta za odkrivanje ELISA, pretočna citometrija ( FCM) s propidijevim jodidom (PI) obarvanja in aktivnosti kaspaze-3, -8 in -9 ELISA in cepitev polyADP-riboza polimeraze (PARP) proteina ob uporabi western analizo blot. Death receptorji (DR) stopnje izraženosti so ovrednotili s pomočjo analize FCM in metodo Western blot. 2 'je 7'-diklorofluresceina diacetat (DCFH-DA) uporabimo kot sondo za merjenje porast reaktivnih kisikovih (ROS) ravneh v celicah. Več posegov, kot siRNA transfekciji in farmakoloških inhibitorjev so bili uporabljeni za raziskovanje mehanizmov teh ukrepov.

Rezultati

Subtoxic koncentracije casticin znatno potencira-TRAIL povzroča citotoksičnost in apoptozo v BGC-823, SGC-7901 in MGC-803 celic. Casticin dramatično molekul izraz DR5 receptorjev, vendar ni vplival na DR4 ali umetnih receptorje. Izbris DR5 ga siRNA bistveno zmanjšala apoptozo s sočasnim uporabo TRAIL in casticin inducirano. Gene utišanje CCAAT /ojačevalec vezavo proteinov homologne beljakovin (CHOP) in predobdelavo s salubrinal, endoplazemski retikulum (ER) stres inhibitor, oslabljen izraz casticin inducirane DR5 receptorja in apoptozo in proizvodnjo ROS. Casticin navzdol reguliranih ravni izražanja proteinov preživetja celica cFLIP, Bcl-2, XIAP, in survivin. Poleg tega casticin povzroča tudi izraze DR5 beljakovin v drugih želodčnih rakavih celic (SGC-7901 in MGC-803).

Zaključek /Pomen

Casticin krepi-TRAIL inducirano apoptozo preko downregulation preživetja celic beljakovin in uravnavanjem DR5 receptorje z ukrepi na ROS-ER stres-CHOP poti

Navedba. Zhou Y, Tian L, Long L, Quan M, Liu F, Cao J (2013) Casticin okrepi TRAIL-inducirane apoptoze želodca raka celic skozi Endoplazemski retikulum stres. PLoS ONE 8 (3): e58855. doi: 10,1371 /journal.pone.0058855

Urednik: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, Združenih držav Amerike

Prejeto: 11. junij, 2012; Sprejeto: 8. februar 2013; Objavljeno: 11. marec 2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprla projekt NSFC (številka 30760248), projekta za znanstveno raziskovanje v provinci Hunan predsedstva uprava tradicionalne kitajske medicine (številka 2010081), projekta za znanstveno raziskovanje v provinci Hunan, Oddelek za izobraževanje (število 10C0975), major projekt točka znanstvenega raziskovanja provinci Hunan ministrstva za izobraževanje (število 09A054) in projekta za znanstveno raziskovanje v Changsha mestnega urada za znanost in tehnologijo (število K1104060-31). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

fructus Viticis
( Manjingzi
je kitajsko ime), in sicer sadež VITEX trifolia L.
(družina Verbenaceae
) da je tradicionalna kitajščina zdravilo uporabimo kot protivnetno sredstvo. Casticin je ena izmed aktivnih sestavin, ki izhajajo iz fructus Viticis
[1]. Številne študije so pokazale, da casticin izvaja proti rakotvoren učinek pri dojke [2], materničnega vratu [3], prostate [4], pljuč in debelega črevesa [5] [6], kakor tudi pri raka želodca [7] vitro
. Ugotovljeno je bilo tudi, da casticin zavira rast človeških mieloično levkemijo celic [8] in povzroči smrt celice levkemije indukcija bodisi apoptoze ali mitotićni katastrofe [9].

Pred kratkim je prejšnja dela iz naš laboratorij je pokazala, da je učinek casticin na apoptozo človeških hepatoceličnih celic karcinoma vključeni v DR5 poti neodvisnega statusa p53 [10]. Dokazano je, da CCAAT /ojačevalec veznega proteina homologne proteine ​​(CHOP), znan tudi kot rastni aretacijo in gena poškodbe DNA 153 (GADD153) neposredno regulira DR5 izražanje skozi CHOP vezavnim mestom na 5-obdajajoče regiji gena DR5 [11] [12]. Mi, in drugi, so poročali, da nekatera zdravila, kot so 5, 7-dimethoxyflavone in dimetil-celekoksib, inducira DR5 ekspresijo s CHOP odvisni transaktivacije gena DR5 [13] - [15]. Poleg tega so številne študije pokazale, tesen odnos med endoplazemski retikulum (ER), stresa in DR5 izražanja. ER stres je povzročil, ko razpletla proteini kopičijo v ER svetlino [16]. Zdi se, da je to odgovor aktivacijo določenih apoptotičnih poti k odpravi hudo poškodovanih celic, v katerih ni mogoče rešiti zložljivi beljakovin pomanjkljivosti [17], [18]. Različne ER stres induktorji, kot so MG132 [12], Tunicamicin [19] in thapsigargin [20], se je vedno izkazalo, da povzroči DR5 izraz na površini celic. Čeprav bi molekularne mehanizme za DR5 beljakovin izražanja zer stres induktorjev spreminja z dražljaji in tipe celic, ER stres inducirajo transkripcijski faktor, CHOP, je zagotovil povezavo med ER stresa in DR5. Vendar, ali casticin inducira DR5 izražanje v želodčnih rakave celice, in če je tako, narava molekularni mehanizem, ki sodeluje, ni znano.

Nedavna študija je pokazala, da je učinkovit dejavnik tumorske nekroze-povezane z α-apoptoza indukcijo ligand ( TRAIL), ki temelji kombinirano zdravljenje je mogoče doseči z navzgornje regulacije DR4 in DR5 izraz, in se neposredno ciljanje tumorskih celic mitohondrije za spodbujanje svojih-apoptoza indukcijo lastnosti [21]. Sposobnost mitohondrijev posredovati apoptozo je strogo nadzorovana s člani naddružine Bcl-2 [22]. Zatiranja anti-apoptotske izražanja proteinov, s protismiselna RNA ali siRNA, se je pokazalo, da senzibilizirati rakave celice TRAIL [23]. Kot rezultat, sredstva, ki upocasnjujejo take anti-apoptotične beljakovin v survivina, celični FADD podobnega interlevkin-1β-ACE inhibitorno beljakovin (cFLIP), Bcl-2 in X-vezano inhibitor apoptoze beljakovin (XIAP) lahko potencialno senzibilizirati raka celice k apoptotska učinkov TRAIL [23], [24].

v tej raziskavi, zato smo se osredotočili na preverjanje, ali casticin okrepi-TRAIL povzroča raka apoptozo celic, in če je tako, kako casticin okrepi ta učinek. Ugotovili smo, da casticin potencira apoptozo-TRAIL induciran z navzgornje regulacije DR5 preko ROS-ER stresa CHOP poti in downregulating izražanje proteinov preživetja celica Bcl-2, XIAP, cFLIP in survivin v želodčnih rakavih celic.

Rezultati

Subtoxic koncentracije casticin selektivno poveča-TRAIL povzroča citotoksičnost v rakavih celicah želodca

citotoksičnost casticin in TRAIL, samostojno ali v kombinaciji, je bilo pregledanih v človeške želodčne raka linij BGC- 823, SGC-7901 in MGC-803, ki ga je MTT testom določiti. Casticin in TRAIL sam povzročil citotoksičnost želodčnih rakavih celic, v koncentracijsko odvisni način (sliki 1A in B). Rahlo citotoksičnost (< 20%) smo opazili pri nižjih koncentraciji casticin (1,0 mol /l, slika 1A). Zdravljenje želodčnih rakavih celic pri 25-50 ng /ml TRAIL 24 ur induciranih omejen citotoksičnost (< 20%). Vendar pa co-zdravljenje želodčnih rakavih celic z casticin (1,0 mol /l) in pot (25 ng /ml ali 50 ng /ml) opazno povečala citotoksičnih učinkov v primerjavi z zdravljenjem z casticin ali TRAIL samo (slika 1C).

Zato, ker smo ugotovili, da je kombinirano zdravljenje z casticin in TRAIL močno inducirane citotoksičnosti v želodčnih rakavih celic, smo poleg preučil učinke zdravljenja na ovekovečil človeške želodčne sluznice epitelijskih celic skladu ges-1. Zanimivo je, da kombinacija casticin in TRAIL ni povzročil citotoksičnost v celicah ges-1 (Slika 1D) .Ti rezultati kažejo, da subtoxic koncentracije casticin selektivno občutljivi na človeške rakave želodca celice TRAIL-inducirano citotoksičnost.

koncentracije Subtoxic od casticin dovzetnost želodčne rakave celice na-TRAIL inducirane apoptoze

da bi raziskali, ali je apoptozo sodeluje pri zaviranju rasti celic po sočasnem zdravljenju z casticin in TRAIL, moramo najprej preučiti apoptozo pomočjo analize pretočno citometrijo zaznati povečanje hypodiploid celici populacije. Rezultati so pokazali, da je stopnja apoptoze 3,78 ± 1,3%, 4,69 ± 1,7% in 37,1 ± 4,9% (povprečje ± SD, n
= 3) za casticin (1 mol /l), TRAIL (50 ng /ml) in casticin plus TRAIL, oziroma (slika 2A). sub-G1 populacija BGC-823 celicah se je znatno povečal v 12 urah in dosegla vrh 24 ur po predhodnem zdravljenju z 1 mol /l casticin sledilo 50 ng /ml TRAIL (Slika 2B). Mi Naslednja določeno raven fragmente histonov /DNK želodčnega raka celičnih linijah BGC-823, SGC-7901 in MGC-803 z uporabo ELISA komplet za zaznavanje celične apoptoze. 2C kaže, da kombinirana obdelava casticin in TRAIL sinergistično povzroča razdrobljenost histonov /DNA. Ravni histonov /DNA fragment BGC-823 so bile povišane po 12 urah in dosegel najvišjo vrednost 24 ur po sočasnem zdravljenju z casticin (1 mol /l) in pot (50 ng /ml, slika 2D).

Naslednja preučila, ali so kaspaze dejansko aktivira med indukcijo apoptoze celične smrti ob sočasnem zdravljenju z casticin in TRAIL v želodcu rakavih celic. Zdravljenje gastic rakavih celic s samo 24 ur 1 mol /L casticin ni povzročil nobene aktivnosti kaspaze-3, -8 in -9. V odgovor na pot (50 ng /ml), aktivnosti kaspaze-3, -8 in -9 niso spremenile. Vendar pa kombinirano zdravljenje casticin in TRAIL inducirano aktivacije kaspaze-3 in -8 in rahlo aktivira kaspaza-9 (slika 2 E, F in G).

Proučili smo tudi kateri je kaspaza posebej aktivira odziv na casticin in zdravljenje TRAIL uporabo zaviralcev kaspaze, vključno z zaviralcem pan-kaspaze zVAD-fmk, zaviralcem kaspaze-3 zDEVD-fmk, je kaspaze-8 zaviralcev zIETD-fmk in kaspaze-9 zaviralcev zLEHD-fmk. Kot je prikazano na sliki 2E, zVAD-fmk, zDEVD-fmk in zIETD-fmk znatno zmanjšal nivo aktivnosti kaspaze-3 s kombinirano zdravljenje casticin in TRAIL inducirane, vendar zLEHD-fmk imela majhen učinek. zVAD-fmk in zIETD-fmk lahko hkrati povsem blokirati kaspaze-8 aktivacijo in zDEVD-fmk delno blokirana aktivacije kaspaze-8; Vendar pa je zLEHD-fmk malo vpliva na stanje aktivacije kaspaze-8 (Slika 2F). Ustrezno smo ugotovili, da je kaspaza-9 nekoliko aktivirajo v celicah, obdelanih s casticin in TRAIL ne pa v celicah, obdelanih s casticin in TRAIL v prisotnosti z-IETD-fmk, zVAD-fmk in zLEHD-fmk (Slika 2G). Kolektivno, ti rezultati kažejo, da casticin z dodatkom TRAIL povzroča kaspaze-8 aktivacijo gorvodno od kaspaze-9 aktivacijo [10].

Končno smo raziskali, ali bi casticin povečati-TRAIL povzroča PARP dekolte in ugotovila, da casticin okrepljeno TRAIL-povzroča povečanje PARP cepitev v BGC-823 in SGC-7901 celic (Slika 2H). Ti rezultati jasno kažejo, da je subtoxic koncentracija casticin povečuje-TRAIL inducirano apoptozo želodčnih rakavih celic.

Casticin izzove ekspresijo DR5 v rakavih celicah želodca

Apoptoza hepatoceličnih celic karcinoma povzročenih s casticin je bila vključena v DR5 uravnavanjem [10]. Zato obdelan BGC-823 celic z casticin za 24 ur in nato uporabimo zahodni analizo blot preučiti celice za izražanje TRAIL receptorjev. Casticin povečala DR5 ekspresijo v odvisnosti od koncentracije, vendar ni imel nobenega vpliva na DR4 izražanja niti DcR1 ali DcR2 indukcijo (slika 3A). Indukcija DR5 izražanja casticin prišlo na 6 ur in dosegla 24 ur (slika 3b). Te ugotovitve kažejo, da je DR5 Povecanje mehanizem kandidat, prek katerega casticin povečuje apoptotične učinke TRAIL v BGC-823 celic.

Da bi ugotovili, ali je bil DR na površini celic, vključenih v indukcijo apoptoze s casticin, celične površinske izražanje z dne DR5 in DR4 opazili z uporabo citometrija toka. Po izpostavitvi celičnega casticin (1,0 mol /l) je bila stopnja DR5 na celični površini povečal (slika 3C). Vendar casticin ne vplivajo na raven DR4 izražanja (slika 3D). Kolektivno, ti rezultati kažejo, da casticin upregulates izražanje DR5 na površini celice.

Ali je Povecanje od DR5 s casticin značilne za BGC-823 celic, ali se pojavlja tudi v drugih želodčnih raka celičnih linijah, so raziskovali tudi. Casticin povzroča DR5 izraz na raka želodca SGC-7901 in MGC-803 celičnih linijah, vendar ni imel očitne učinke na svojem izrazu v imortalizacije želodčne sluznice GES-1 celične linije (Slika 3E). Skupaj, te ugotovitve kažejo, da je Povecanje od DR5 s casticin ni specifičen za določeno vrsto želodčne celice raka.

zahteva DR5 indukcija z casticin za izboljšanje-TRAIL inducirane apoptoze v BGC 823 celic

za določitev vloge DR5 receptorjev pri izboljšanju-TRAIL inducirane apoptoze ga casticin smo uporabili siRNA posebno za DR5 da upocasnjujejo njegovo izražanje. Transfekciji celic z siRNA za DR5 vendar ne z siRNA nadzora zmanjša casticin inducirane DR5 izraz.

Če želite preveriti, ali DR5 Povecanje vključuje casticin-večjo-TRAIL povzroča želodca apoptozo celic, pretočna citometrična analiza je bila uporabljena za preučitev, ali zatiranje DR5 izražanja, ki ga siRNA lahko zmanjšajo učinek casticin on-TRAIL inducirane apoptoze. Slika 4B kaže, da je bil učinek casticin on-TRAIL inducirano apoptozo učinkovito zmanjšal v celicah transfekciji s DR5 siRNA, medtem ko so celice transficirane s kontrolnimi siRNA nespremenjena. Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da indukcija DR5 je ključnega pomena za preobčutljivost tumorskih celic na učinke casticin v-TRAIL inducirane apoptoze.

Casticin inducirane DR5 Povecanje je posredovana skozi indukcijo CHOP v 823 BGC celic

CHOP posredovano Povecanje od DR5 Dokazano je, [11] - [15]; Zato bomo naslednjič raziskovali, kako bi se to transkripcijski faktor vključen v-casticin povzroča DR5 uravnavanjem. Slika 5A kaže, da casticin povzroča CHOP izraz, ki se je zgodila vzporedno s povečanjem DR5 izražanja.

Za testiranje vlogo CHOP v-casticin povzroča uravnavanjem DR je bil uporabljen gen utišanje CHOP s siRNA. Transfekciji s CHOP siRNA bistveno zatreti casticin povzročeno DR5 uravnavanjem (slika 5B), medtem ko casticin molekul izražanje DR5 v ne-transfekcije in kontrolo transfektirali (umešana RNA) celice.

Naslednja uporablja citometrična analiza pretoka za preučiti, ali je odprava CHOP ga siRNA oslabljen učinke preobčutljivost za casticin na-TRAIL inducirane apoptoze. Transfekciji s CHOP siRNA znatno zmanjša učinke (iz 37,1 ± 5,3% na 13,5 ± 1,3%, povprečje ± SD, n
= 3) na casticin plus-TRAIL inducirano apoptozo (slika 5C), medtem ko je zdravljenje z nadzorom siRNA imela nobenega učinka (slika 5C). Ti rezultati kažejo, da je CHOP vključen v DR5 pozitivni vpliv in prispeva k učinka, ki povzroča preobčutljivost za casticin on-TRAIL inducirane apoptoze v našem eksperimentalnem modelu.

Casticin povzroča endoplazemski retikulum (ER), stres v želodčnih rakave celice

znano je, da ER povzroča ER stresne označevalne proteine ​​(kot GRP78 in fosfo-eIF2α), ki upregulates izražanje CHOP [12], [19], [20]. V tej študiji so preiskovali učinek casticin na izražanje ER stresnih markerskih beljakovin. Naši rezultati kažejo, da se je casticin dejansko inducira vseh teh označevalcev ER stresa v BGC-823 celic (slika 6A). Da ugotovi, ali je ER stres vpleten v potenciranja casticin o apoptoze s TRAIL, salubrinal, zaviralec ER stresom povzročene bila uporabljena. Salubrinal (50 umol /l) v veliki meri zavarovana BGC 823-celice apoptoze s sočasnim uporabo casticin in TRAIL (slika 6B) inducirane.

Preverili smo, ali je zdravljenje 823 BGC celic z endoplazemski retikulum (ER) stres induktor, Tunicamicin [25], bi povzdignil raven DR5 beljakovin in poveča-TRAIL povzroča apoptotske celične smrti. Ugotovili smo, da Tunicamicin (3,0 mol /L) časa v odvisnosti od povečana raven beljakovin za DR5, p-eIF2α, GRP78 in CHOP, v BGC-823 celic (slika 6c). Sočasnim zdravljenjem z tunicamicina (3,0 mol /L) in TRAIL (50 ng /ml), znatno povečal delež celic v sub-G1 fazi, v primerjavi z tunicamicina ali TRAIL samo (slika 6d). Ti rezultati potrjujejo hipotezo, da ER stres sodeluje pri potencira učinek casticin na apoptoze s TRAIL inducirane.

Casticin inducirane DR5 Povecanje in apoptoza povečanjih so ROS bilo odvisno od BGC-823 celic

Pred kratkim smo dokazali, da 5, 7-dimethoxyflavone selektivno poveča-TRAIL inducirano apoptozo s ROS stimulirati ER-stres sproži-CHOP posredovana DR5 uravnavanjem v hepatocelularnim karcinomom celic [15]. Tako smo raziskovali, ali casticin povzroča nastajanje ROS. 2 '7'-diklorofluresceina diacetat (DFCH-DA), smo uporabili kot sondo za merjenje povečanja ravni ROS v celicah. Čas poskusi seveda pokazala, da so bile ravni ROS na

1 h sprva povečala, dosegla vrhunec na 3 ure in je trajal do 24 ur po zdravljenju z 1,0 mol /l casticin (slika 7A). Casticin povzroča nastajanje ROS v odvisnosti od koncentracije način (slika 7B).

Če želite dešifrirati razmerje med proizvodnjo ROS in indukcije DR5 CHOP-odvisni, smo pregledali, ali ROS ureja casticin-inducirane TRAIL receptorje in CHOP v prisotnosti in odsotnost N
-acetylcysteine ​​(NAC), ki je lovilec kisika prostih radikalov. Ugotovili smo, da predobdelava celic z NAC zmanjšala-casticin povzroča uravnavanjem DR5 in CHOP izraz (slika 7c).

Nato smo raziskovali, ali ROS igra vlogo pri-casticin povzroča TRAIL okrepitve. Kot je prikazano na sliki 7D, casticin znatno okrepljena-TRAIL inducirano apoptozo v BGC-823 celic, in predobdelava celic z NAC izrazito znižal casticin-inducirane apoptoze izboljšanje celične smrti iz 52,4 ± 3,3% na 8,2 ± 0,8% (povprečje ± SD, n = 3), kar pomeni, da ima ROS ključno vlogo pri posredovanju učinke casticin v-TRAIL inducirane apoptoze.

casticin zmanjša število izražanje različnih proteinov preživetja celic v-823 BGC celic

It poročali so, da so številni antiapoptozne proteini, kot survivina, cFLIP, XIAP, Bcl-2 in Bcl-xL regulira-TRAIL inducirano apoptozo [25], [26]. V tej študiji smo raziskovali, ali so bile nekatere ugotovljene beljakovine preživetja celic, vključenih v potencira učinek casticin na apoptoze s TRAIL inducirane. BGC-823 celice so bile izpostavljene različnim koncentracijam casticin 24 ur in nato pregledamo Bcl-XL, Bcl-2, survivin, XIAP, cFLIP, cIAP-1 (celično zavira apoptozo beljakovin 1) in TRAF1 (TNF receptor-povezana faktor 1) izraz. Casticin inhibira Bcl-XL, Bcl-2, survivina, cFLIP in XIAP izraz (slika 8a). Učinki casticin za izražanje Bcl-XL, Bcl-2, survivin, XIAP in cFLIP bilo dramatično, medtem ko je downregulation od cIAP-1 ni bil zelo izrazita. Ti rezultati kažejo, da je downregulation preživetja celic beljakovin eden od mehanizmov, ki poganjajo Okrepljeni učinek casticin na apoptoze s TRAIL povzročeno.

Naslednja preučila, ali bi casticin uravnavajo izražanje pro-apoptotskih proteinov. Ugotovili smo, da casticin dramatično molekul ekspresijo Bax v koncentracijsko odvisni način (slika 8B). Casticin povečala tudi cepitev ponudbe v odvisnosti od koncentracije, kot je razvidno iz zmanjšanja izražanja proteina ponudb (slika 8B). Te ugotovitve kažejo, da casticin lahko hkrati aktivirati notranjo-mitohondrije posredovano pot in ekstrinzični DR-inducirano poti, kot je razvidno okrnjene pro-apoptoze beljakovin ponudb.

Pogovor

V tej preiskavi, smo raziskovali sposobnost casticin, je polymethoxyflavone izhaja iz fructus Viticis
, da se spremeni TRAIL signalizacije v želodčnih rakave celice, in naše ugotovitve kažejo, da casticin okrepi-TRAIL inducirano apoptozo v raka želodca BGC-823, SGC-7901 in MGC-803 celic po (1), indukcijskega DR5 izražanja in (2) downregulatin preživetja celic proteinov, povezanih z odpornosti tumorskih celic na sled. Zdi se Casticin Povecanje od DR5, da je posredovano z aktivacijo ROS-ER stres-CHOP steze (slika 9).

smo dokazali, da je casticin inducirane DR5 izraz v želodcu rakavih celic. Ti rezultati so v soglasju s tistimi iz našega preteklega dela [10], smo poročali, da je apoptotske učinek casticin v človeških karcinomom jetrnih celic, vključenih v DR5 uravnavanjem vendar pa ni obravnavala vprašanja, ali lahko casticin povečati-TRAIL inducirano apoptozo ali mehanizem senzibilizaciji. Tukaj smo pokazali, da je DR5 Povecanje ključnega pomena za senzibilizaciji celic TRAIL, so gensko utišanje receptorje (DR5) oslabljenim-TRAIL inducirane apoptoze. Tako lahko DR5 up-regulacija dovzetnost celic za-TRAIL inducirane apoptoze [27]. Številni mehanizmi so opisani za indukcijo DR, vključno z generacijo ROS, indukcijo p53 in NF-κB, DDIT3 (DNA poškodbe inducibilen Prepis 3), peroksisomskega aktiviranim s proliferatorjem receptorsko-y in MAPK aktivacijo [27], [28] . V tej raziskavi smo ugotovili, da casticin povzroča CHOP in da gen utišanje CHOP ga siRNA blokira učinek casticin na indukcijo DRS in on-TRAIL inducirane apoptoze. Naše ugotovitve so podobne tistim iz druge študije, ki je pokazala, da CHOP veže na promotor DR5 in upregulates ta izraz receptorjev [12], [29].

Znano je, da je CHOP tipičen ER stresa urejeno protein sodeluje pri ER-stres povzroča apoptozo [11]. Naša ugotovitev indukcije CHOP ga casticin kažejo, da casticin lahko sproži ER stres in poveča raven izražanja GRP78 in eIF2α, ki so dodatne beljakovine nabrane ali povečana med ER stresa [17]. Zato se zdi verjetno, da casticin povzroča ER stres. Salubrinal je selektivni inhibitor ER-stres povzroča apoptoza [30]. Prisotnost salubrinal očitno zaščiten želodčne rakavih celic casticin plus-TRAIL inducirano apoptozo. Tako se zdi, da casticin inducira apoptozo potenciranje z vključevanjem mehanizmov ER stres.

Ugotovili smo, da je najbolj pomemben predhodni signal, povezan z casticin modulacijo pot receptorjev je morda ROS. Naši rezultati kažejo nedvoumno, da casticin inducirano produkcijo ROS, in da je ohlajanje ROS s strani antioksidant N
-acetylcysteine ​​oslabljen učinek casticin na indukcijo CHOP in DR5. Ugotovili smo, da za gašenje ROS tudi oslabljen casticin potenciranja-TRAIL inducirane apoptoze. Naše ugotovitve so v soglasju s tistim v predhodnih študijah, ki uporabljajo sulforafan zerumbone in celastrol za indukcijo DR5. Rezultati sedanjih in predhodnih študij močno kažejo, da ima ROS pomembno vlogo pri modulaciji TRAIL receptorske DR5 [31], [32]. Naši rezultati so v soglasju s tistimi iz prejšnjega dela, smo poročali, da casticin povzroča kopičenje sub-G1 celic in povečano nastajanje ROS v HeLa, CaSki in celičnih linij SiHa, vendar ne v PBMC [33]. Vendar pa smo pokazali, da casticin zmanjšali vsebnost GSH ( P < 0,05
), ki pa ni vplivala na raven znotrajcelično ROS v PLC /PRF /5 in Hep G2 celic [10]. Verjetne razlage za navidezni konflikt podatkov je, da obstajajo razlike v modalnosti, ki urejajo ukrepe na različne tipe celic.

Ugotovili smo tudi, da je drugi mehanizem senzibilizacije vključuje ureditev anti-apoptotskih proteinov. Casticin navzdol reguliranih izrazu elevels za Bcl-2, Bcl-XL, XIAP in survivin, vsi, ki so bili povezani z odpornosti tumorskih celic na TRAIL [34], [35]. Dejansko je bilo downregulation za XIAP, Bcl-2 in Bcl-XL izražanja pokazala senzibilizirati tumorske celice TRAIL [36], [37]. Wang et al.
(2005) [8], je pokazala, da casticin zmanjšala Bcl-2 nivoja izražanja in navzdol reguliranih razmerje Bcl-2 /Bax izražanja v K562 celicah. Naši rezultati so tudi v skladu s predhodnimi študijami, ki je pokazala, da je etanol ekstrakt posušenih zrelih plodov Vitex Agnus-Castus
znižala raven Bcl-2, Bcl-XL in ponudb beljakovin in povečala v stopnja Bax proteina [7]. Poročilo Chen et al.
(2011) je pred kratkim pokazala, da je Bax molekul, medtem ko so stopnje izraženosti Bcl-XL in XIAP navzdol reguliranih s casticin [33].

Kobayakawa et al. poročali, da casticin izrazito zaviral rast KB celic, vendar pa ne zavira proliferacijo A431 celic, ki je podobno kot pri običajnih celičnih linij 3T3 švicarski Albino in TIG-103 [38]. V tej raziskavi smo pokazali, da casticin specifično inducira apoptozo v človeške želodčne rakave celice, vendar ne v celicah GES-1, čeprav ni bila ugotovljena mehanizem za selektivno indukcijo apoptoze. Naši rezultati kažejo, da lahko casticin posebno Antitumorsko sredstvo z nizko toksičnostjo.

Na kratko, naši rezultati kažejo, da casticin prispeva k občutljivosti tumorskih celic na stezi z uporabo več mehanizmov. Casticin najprej spodbuja nastajanje ROS in sproži ER stres nato sproži DR5 uravnavanjem z aktivacijo CHOP kar posledično povečuje-TRAIL povzroča aktiviranje DR5 inducirane in mitohondrije posredovano apoptoze poti. Hkrati casticin olajšuje-TRAIL povzroča apoptotično celično smrt z zaviranjem anti-apoptoze beljakovin izražanja in aktiviranje pro-apoptoze proteinov. Prihodnje raziskave bi morale biti usmerjene v celoti uresničiti potencial kombinacije casticin in TRAIL terapije za zdravljenje bolnikov z rakom želodca. Zato bodo potrebne dodatne študije ukrepov casticin v živalskih modelih.

Materiali in metode

Reagenti

Casticin (čistost ≥ 98%) je bila kupljena od Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd (Chengdu, Kitajska), prisotna v obliki rumenih kristalov (molekulska masa, 374,3). Casticin raztopimo v dimetil-sulfoksidu (DMSO), da bi 10 mmol raztopino /l zaloge in razredčili v mediju celične kulture na želeno koncentracijo tik pred uporabo. Naslednji reagenti so bili kupljeni od Hunan Clonetimes Biotech Co Ltd (Changsha, Kitajska): topne rekombinantni humani TRAIL (Pepro Tech), apoptoza celic ELISA Detection Kit (Roche), 2 ', 7'-diklorofluresceina diacetat (DCFH-DA; molekulska Sonde Inc), salubrinal (EMD Chemicals, Inc. San Diego, CA), N-acetilcistein (NAC, Sigma), Tunicamicin (Sigma), propidijevim jodidom (PI, Sigma), kaspazne 3 Activity Detection Kit (Millipore), kaspazne 8 Kolorimetrijska Activity Test Kit 25 (Millipore), kaspazne 9 Kolorimetrijska Activity Test Kit (Millipore), protitelesa proti DR5 (ProSci Inc). Protitelesa proti DR4, PARP, Bcl-2, Bax, ponudba, survivin, CHOP, GRP78 in ATF4 so bili pridobljeni iz Santa Cruz Biotechnology. Anti-XIAP protiteles je bila kupljena od signalizacijo med celicami tehnologijo, Danvers, ZDA. inhibitorji kaspaze, kot zVADfmk, zDEVD-fmk, zIETD-fmk in zLEHD-fmk so bile kupljene pri R & D Systems (Minneapolis, MN)

celične kulture

BGC-823, SGC. -7901 in MGC-803 človeških želodca rakave celice smo pridobili iz Kitajske centra za Type Culture Collection (CCTCC; Wuhan, Kitajska) in ges-1 celic iz Onkološkega inštituta na Univerzi v Pekingu. Celice smo vzdrževali v spremenjenem mediju Dulbeccovem Eagle je (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY), dopolnjenem z 10% fetalni goveji serum (FBS) (Invitrogen), 100 U /ml penicilina in 100 ie /ml streptomicina v vlažni atmosferi s 5% CO _{2 pri 37 ° C. Celice smo obdelali z različnimi koncentracijami casticin ali TRAIL ali oboje za MTT testu. Casticin (1,0 mol /l) in TRAIL (25, 50 ng /ml), samostojno ali v kombinaciji so bile uporabljene za celice BGC-823, ki se uporabljajo za odkrivanje apoptoze.
Smo zasejali}

MTT testu

Celice v ploščo s 96 vdolbinami z gostoto 0.5104 celic /jamico in inkubiramo 24 ur, čemur sledi obdelava z različnimi koncentracijami casticin in TRAIL za 24 ur ali obdelanem z casticin 12 ur, čemur sledi obdelavo z TRAIL za nadaljnjih 24 ur. MTT kolorimetrična analiza je bila izvedena kot prej [10] opisano. IC _{50 vrednost, pri kateri 50% zaviranja rasti celic v primerjavi z dimetilsulfoksid (DMSO) nadzor, je bila izračunana z nelinearno regresijsko analizo s GraphPad Prism programske opreme (San Diego, CA).}

Flow citometrijo uporabo PI obarvanje

Celice smo zasejali z gostoto 4 x 10 ^{6 celic /ml v sodih 100 ml kulture za 24 ur, nato pa se zdravijo z medijem, ki vsebuje različne koncentracije casticin ali TRAIL ali oboje skupaj za navedene čase. Apoptoza celic so odkrili s pomočjo pretočno citometrijo. (FCM, ameriški BD Company, FACS 420)}

histon /DNA fragment ELISA

Komplet za odkrivanje apoptoza celic ELISA je bil uporabljen za odkrivanje apoptozo v celicah, zdravljenih s casticin po protokolu proizvajalca. Na kratko smo celice zasejali v 96 vdolbinicami z gostoto 1 x 10 ^{4 celic /jamico za 24 ur, in medij, ki vsebuje različne koncentracije casticin dodano kot je potrebno. Po 24 h smo citoplazmo kontrolne skupine in skupine zdravljenja prenese na ploščo s 96 vdolbinami, ki jih streptavidinom peridiumed, inkubiran z biotiniliranega histon protitelesa in peroksidaza označijo miške anti-humani DNK za 2 uri pri sobni temperaturi. Absorbanco pri 405 nm smo merili z EXL-800 tipa encimskim imunskim aparata.}

Analiza kaspaze-3, -8 in -9 dejavnosti

Dejavnosti kaspaze-3, -8 in -9 so ovrednotili s 3 Activity Detection Kit kaspaze, kaspaze 8 Kolorimetrijska Aktivnost Analiza Kit 25 in kaspaze 9 Kolorimetrijska Aktivnost Analiza Kit oz. Na kratko, smo pripravili celične lizate po njihovem zdravljenju z eksperimentalnimi sredstvi. Teste smo izvedli v 96 vdolbinami z inkubacijo 20 ug celičnih lizatov v 100 ul iz reakcijskega pufra (1% NP-40, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 137 mM NaCl, 10% glicerol), ki vsebuje 5 um od kaspaze-3 podlago Ac-DEVD- p
nA, kaspaze-8 substrat Ac-IETD- p
nA ali kaspaze-9 substrat Ac-LEHD- p
NA.

• Plos ONE: Faza II študija Vrednotenje 2 shemah odmerjanja peroralnega Foretinib (GSK1363089), cMet /VEGFR2 Inhibitor, pri bolnikih z metastatskim Rak želodca
• Plos ONE: Zveza med Zmanjšanje Plasma adiponektina nivojev in tveganja za bakterijske okužbe po želodca raka kirurgijo