PLoS ONE: Laskua ilmentäminen AZGP1 liittyy huonon ennusteen Ensisijainen Mahalaukun Cancer

tiivistelmä

Background

2-sinkki-glykoproteiinin 1 (AZGP1) on monitieteinen proteiini, joka on mukana useissa tärkeitä tehtäviä ihmiskehossa kuten lannoitus, immunoregulaatio ja rasva-liikkeelle. Viime aikoina on osoitettu, että AZGP1 on mukana myös syövän synnyssä ja kasvaimen erilaistumiseen. Tässä tutkimuksessa tutkimme ekspressiotasot ja ennusteen arvioinnissa on AZGP1 perusterveydenhuollossa mahasyövistä.

Menetelmät ja tulokset

tarkasteltiin ilmentymisen AZGP1 35 pariksi syöpä- ja sovitettu viereisen noncancerous mahalaukun limakalvo kudokset reaaliaikaisella kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) ja western-blottauksella. Lisäksi olemme analysoineet AZGP1 ilmentymistä 248 potilasta joille tehtiin resektio menettelyjä vuosien 2005 ja 2007 käyttäen immunohistokemia. Väliset suhteet AZGP1 ilmaisun tasoilla, kliinis tekijät, ja potilaiden eloonjäämisen tutkittiin. AZGP1 ilmentyminen väheni merkittävästi sekä mRNA ( P
= 0,023) ja proteiini tasoilla ( P
= 0,019) kasvaimen kudosnäytteistä, verrattuna ilmaisun Hyväksytty vieressä ei ollut kasvainta kudosnäytteistä . Immuunihistokemialliset värjäys tietojen mukaan AZGP1 ilmentyminen väheni merkittävästi vuonna 52,8% (131/248) mahalaukun adenokarsinoomaa tapauksista. Kliinis-analyysi osoitti, että alennettu ilmentyminen AZGP1 korreloi merkitsevästi kasvaimen sijainti ( P
= 0,011), histologinen arvosana ( P
= 0,005) ja T vaiheessa ( P
= 0,008). Kaplan-Meier selviytymisen käyrät paljasti, että alennettu ilmentyminen AZGP1 liittyi huonon ennusteen mahalaukun adenokarsinooman potilailla ( P
= 0,009). Coxin monimuuttuja-analyysi tunnistaa AZGP1 ilme oli itsenäinen ennustetekijä varten eloonjäämisaste mahalaukun adenokarsinooman potilaista (HR = 1,681, 95% CI = 1,134-2,494, P
= 0,011).

Johtopäätökset

Tutkimuksemme osoittaa, että AZGP1 voisi toimia ehdokkaaksi tuumorisuppressoriproteiinia ja mahdollinen ennustetekijöiden biomarkkereiden sisään mahasyövän.

Citation: Huang Cy, Zhao Jj, Lv L, Chen Yb, Li Yf, Jiang ss, et ai. (2013) Vähentynyt ilmentyminen AZGP1 liittyy huonon ennusteen Ensisijainen syöpään. PLoS ONE 8 (7): e69155. doi: 10,1371 /journal.pone.0069155

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu 5 maaliskuuta 2013 Hyväksytty: 5. kesäkuuta 2013. Julkaistu: 23 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Jatko Fund opetusministeriön Kiina (20100171110084). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on toiseksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolleisuus kaikkialla maailmassa, jossa 988000 uutta tapausta ja 736000 kuolemantapausta vuodessa [1] - [2]. Kiinassa, mahasyöpä ennustettiin kolmanneksi yleisin syöpä vuonna 2005 0,4 miljoonaa uutta tapausta ja 0,3 miljoonaa kuolemantapausta raportoitu [3]. Hoitoon mahasyöpä sisältää yhdistelmän leikkauksen, kemoterapian, sädehoidon. Mutta lähes 60% vaikuttaa potilaista kuolevat syöpään jälkeen parantavaa resektiota yksin tai jälkeen parantava resektiota myöhempien adjuvanttihoidon [4]. Mahalaukun syöpä on heterogeeninen sairaus sekä histologian ja genetiikan; siten, potilas lopputulos on vaikea ennustaa käyttäen klassista histologisia luokituksia. Mahasyövän on monitekijäinen ja monivaiheinen prosessi, johon liittyy aktivoimalla onkogeenien ja inaktivoimalla tuumorisuppressorigeeneille eri vaiheissa mahalaukun syövän etenemisessä. Viime aikoina useita uusia onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille liittyy mahasyöpä on tunnistettu. Siksi on kliinisesti tärkeää löytää tehokas uudet tavoitteet varhaistoteamiseen ja tehokas hoito mahasyövän.

AZGP1 (2-sinkki-glykoproteiini 1, Zn-alfa 2-glykoproteiini) on 41 kDa liukoinen proteiini joiden major histocompatibility complex-1 (MHC-1) -kuten kertaiseksi sen rakenne, ja se oli alun perin tunnistettu ja puhdistettu ihmisen seerumista 1961 [5]. Geeni AZGP1, osoitetaan kromosomiin 7q22.1 kautta fluoresenssihybridisaatiokoettimia karyotyping, koostuu neljästä eksonia ja kolme intronia [6], [7]. Käyttäen immunohistokemiallista tutkimuksissa on todettu, että AZGP1 saadaan pääasiassa epiteelisolujen rinnan, eturauhasen, maksan ja muiden maha-suolikanavan elimiin [8]. Mukaisesti tuotantoaan erittävien epiteelisolujen AZGP1 löytyy useissa kehon nesteiden [9], [10], [11].

AZGP1 on monitieteinen proteiini, joka osallistuu monia tärkeitä toimintoja ihmiskehon kuten lannoitus [11], immunoregulaatio [12] ja lipidien mobilisointi [13], [14], [15]. AZGP1 liittyy myös syöpään kakeksia. AZGP1 on korkea aminohapposekvenssin homologia kasvain- lipidi-käyttöön tekijä [14], ja hiirimallissa AZGP1-tuottavien kasvainten, AZGP1 stimuloi lipolyysiä rasvasoluissa johtaa kakeksian [16]. Viime aikoina on osoitettu, että AZGP1 on mukana myös syövän synnyssä ja kasvaimen erilaistumiseen. Proteiini ja mRNA: n ilmentymisen määrityksissä ovat osoittaneet suhde AZGP1 tasojen ja histologinen rintasyövän kasvaimia [17], [18]. Lisäksi monet tutkimukset viittaavat siihen, että AZGP1 on mahdollinen seerumin markkeri eturauhassyövän [9], [19]. Lisäksi on osoitettu, että AZGP1 toimii uutena tuumorisuppressori haimasyövän [20]. Kuitenkin toistaiseksi ilmaisun tilan AZGP1 ja ennusteen arvioinnissa tämän proteiinin ensisijainen mahasyövistä ei ole raportoitu.

Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet AZGP1 ekspressiotaso mahasyövistä käyttämällä reaaliaikaisella kvantitatiivisella RT -PCR (qRT-PCR), western blotting ja immunohistokemia. Lisäksi tunnistimme suhdetta AZGP1 ilmaisun ja kliinis-mahasyöpä, ja arvioimme ennustetekijöiden arvon AZGP1 ilmaisun jälkeisen resektio selviytymisen mahasyöpäpotilaista.

Tulokset

AZGP1 mRNA Expression Analysoitiin qRT-PCR

transkription tasot AZGP1 määritettiin qRT-PCR-määrityksissä käyttäen 35 paria resektoitiin yksilöt (kasvain kudosnäytteitä ja sovitettu viereisen ei-kasvain kudosnäytteitä) mahalaukun syöpäpotilailla. AZGP1 mRNA-tasot olivat vähentyneet huomattavasti 28 (80%) kasvain kudosnäytteitä verrattuna sovitetun viereisen ei-kasvain kudosnäytteistä ( P
= 0,023, kuvio 1).

AZGP1 Expression Analysoitiin Western blotting -tekniikalla

AZGP1 proteiinin tasot resektoitua mahasyövän näytteet määritettiin western blottauksella. Tulokset osoittivat bändi AZGP1 41 kDa, ja määrä AZGP1 olevan proteiinin mitattiin densitometrisesti ja korkeus. Yhdenmukainen qRT-PCR-tuloksiin, väheneminen AZGP1 ilmentymistä havaittiin 25 (71,4%) ja mahakasvaimen kudoksiin verrattuna sovitetun viereisen ei-tuumorikudoksista ( P
= 0,019, kuva 2A). Kahdeksan paria edustajan mahakasvaimen kudosten ja vastaavan viereisen ei-tuumorikudokset kuvassa 2B.

immunohistokemiallinen analyysi AZGP1 Expression mahasyövän Tissue Näytteet ja sen Suhde kliinis-

sen vahvistamiseksi molekyyli- biologisia havaintoja ja tutkimaan kliinispatologiset ennustetekijöiden roolit AZGP1 ilmaisun, suoritimme immunohistokemiallinen analyysi 248 parafinoidut mahasyövän kohdat. Positiivinen ekspressio AZGP1 paikallistettiin sytoplasmaan (kuvio S1). Niistä 248 mahasyövän näytteitä, 117 (47,2%) oli korkea AZGP1 lauseke (AZGP1 ++ tai AZGP1 +++), kun taas loput 131 tapausta (52,8%) näkyy pieni AZGP1 lauseke (AZGP1- tai AZGP1 +) (kuvio 3, taulukko 1). Normaali mahan kudoksissa voimakkaimmin AZGP1 positiivista värjäytymistä (kuvio 3A).

Perustuu luokat että me määritelty edellä mainituista menetelmistä, tiedot osoittivat, että alhainen ilmentyminen AZGP1 korreloi merkitsevästi kasvaimen sijainti ( P
= 0,011), histologinen arvosana ( P
= 0,005) ja T vaiheessa ( P
= 0,008), mutta ei iän, sukupuolen, kasvaimen koon, radikaali resektio , imusolmukestatuksesta (N vaihe) tai etäpesäkkeiden tila (M vaihe). Mikrovalokuvissa on esitetty kuvassa 3.

Korrelaatio AZGP1 Expression Perustuu immunohistokemia ja Patient Survival

Keskimääräinen elinaika on 248 mahasyöpäpotilaista oli 45 kuukautta (vaihteluväli 2-89 kuukautta) . Yleinen eloonjääneitä ja 5 vuoden pysyvyys paranivat merkitsevästi korkea AZGP1 ilmentymisen ryhmässä kuin alhaisen ilmentymisen ryhmässä [64,2% vs. 49,5% (yleinen eloonjääneitä) ja 65,1% vs. 50,4% (5 vuoden pysyvyys), vastaavasti, P
= 0,009, kuva 4].

yhden ja usean analyysit

yhden ja usean analyysit tehtiin verrata vaikutusta AZGP1 ilmaisun ja muut kliinispatologiset parametrit ennuste. Perustuu yhden muuttujan analyysiin, joka sisältää kaikki 248 potilasta, 8 tekijöitä todettiin olevan tilastollisesti merkitsevä yhdistysten kokonaiselossaolo. Tarkastelussa otettiin seuraavat seikat huomioon: kasvaimen sijainti, kasvaimen koon, histologinen luokka, AZGP1 ekspressiotasot, TNM (7. painos TNM luokittelu) ja onko radikaali resektio suoritettiin (taulukko 2). Kaikki 8 tekijät sisällytettiin monimuuttuja Coxin suhteellisten riskien mallia sopeuttaa vaikutuksia kovariaattien. Perustuen tähän malliin, kasvaimen sijainti, AZGP1 ekspressiotasot, T vaihe ja N vaiheessa kasvain vahvistettiin riippumattomina ennustavat tekijät (taulukko 2).

Keskustelu

Mahasyöpää edelleen yksi tappavin ihmisen syöpäsairauksia. Vaikka edistysaskeleet diagnosoinnissa ja hoidossa, ennuste mahasyövän on edelleen synkkä [1], [21]. Kliininen tulos mahasyövän riippuu useiden kasvaimen ominaisuuksia, kuten kasvaimen kasvua, erilaistumista, invaasio ja etäpesäkkeiden, jotka säätelevät erilaisia ​​liittyviä geenejä. Näin ollen, se on yleisesti katsotaan, että geneettisten muutosten johtaa aktivoinnin onkogeenien ja inaktivointi tuumorisuppressoreilla ovat syitä syövän synnyssä. Peräkkäinen vahvistus onkogeenien ja menetys tuumorisuppressoreita tarjota tarvittavat perusta portaittain etenemistä kiinteiden kasvainten aloittamisesta transformaatioon ja syövän etenemistä [22], [23], [24]. Aiemmin AZGP1 on raportoitu olevan kasvaimen suppressiivinen ominaisuuksia rintasyövän, eturauhassyövän, haimasyövän ja joitakin muita pahanlaatuisia kasvaimia [17], [20], [25]; mutta rooli AZGP1 perusterveydenhuollossa mahasyövässä ei ole vielä arvioitu. Tutkimuksemme osoitti, että AZGP1 ilmentyminen oli merkitsevästi pienempi sekä mRNA ja proteiini tasoilla kasvaimen kudosnäytteistä, verrattuna ilmaisun Hyväksytty viereisen ei-kasvain kudosnäytteistä. Yhdenmukainen Tutkimuksessamme Brysk MM et al. osoittivat myös, että AZGP1 tasot ovat korkeampia normaaleissa suun kudoksiin kuin suun kasvaimista [26]. Gagnon S et ai. osoitti myös, että AZGP1 oli läsnä hyvänlaatuinen hyperplastic rauhaset 91,1% tapauksista, mutta vain 40,7% (huonosti eriytetty komponentti) 48,5% (no eriytetty komponentti) ja eturauhasen adenokarsinooman ja vain 8% etäpesäkkeiden [27]. Nämä tutkimustulokset tukevat hypoteesia, että AZGP1 voi toimia tuumorisuppressori joidenkin syöpien.

edelleen vahvistaa tätä vähentäminen AZGP1 ilmentymisen ensisijaisen mahasyövän, suoritimme immunohistokemiallinen analyysi kanin anti-hAZGP1 vasta-aine. Havaitsimme pienempi ilmentyminen AZGP1 immunovärjääminen proksimaalisessa tai yhteensä mahasyövän verrattuna kaukaisiin mahasyövän kudoksiin. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että proksimaalinen mahasyövän potilailla on elinajan kuin kaukainen mahasyöpäpotilaista [28]. Nämä tiedot osoittivat, että alhainen ilmentyminen AZGP1 mahasyövän liittyy enemmän pahanlaatuisia fenotyyppejä. Lisäksi olemme havainneet, että vähentynyt ilmentyminen AZGP1 liittyi huonosti eriytetty adenokarsinoomat (G3 vs. G1 /G2), mikä osoittaa, että AZGP1 voivat aiheuttaa erilaistumista mahasyövän. Nämä tulokset ovat sopusoinnussa havaintojen Diez et al. [17], [18], joka on kuvattu yhdistyksen välillä korkea AZGP1 ilme ja korkea eriyttäminen rintasyövän. Samanlaisia ​​havaintoja on raportoitu myös eturauhassyövän [19], rintasyöpä ja haimasyövän [26]. Lisäksi olemme havainneet, että alhainen ilmentyminen AZGP1 liittyi kehittynyt T vaiheessa. Nämä tulokset ymmärtää, että alhainen ilmentyminen AZGP1 saattaisi edistää kasvaimen kasvua. Mukaisesti Tutkimuksessamme Irmak S et al. ehdotti, että AZGP1 on sukua kehittämiseen pinnallisen virtsarakon syövän ja sen muuttamiseen invasiivisen fenotyypin [29]. Nämä havainnot yhdessä osoittavat merkittävä rooli AZGP1 erilaistumiseen ja kasvuun mahasyövän.

Käyttämällä Kaplan-Meier selviytymisen analyysin potilaiden tutkimuksessamme alhaisen AZGP1 ilme oli huomattavasti lyhyempi kokonaiselossaoloaikaa kuin ne, joilla on korkea ekspressiotasot. Univariate analyysit osoittivat, että vähentynyt ilmentyminen AZGP1 mahasyövän kudoksissa merkittävästi liittyvät yleiset eloonjääneitä ja 5 vuoden pysyvyys. Monimuuttuja-analyysi osoitti, että AZGP1 ilmaisua, yhdessä joitakin perinteisiä ennustetekijöiden kuten kasvain sijainti, T vaihe ja N vaiheessa olivat riippumattomia riskitekijöitä ennustetta mahalaukun syöpäpotilailla. Nämä tulokset viittaavat siihen, AZGP1 voisi toimia uutena ennustaja ennusteen mahasyöpäpotilaista jälkeen kirurgisen resektion.

molekyylitason mekanismeja AZGP1 kasvain tukahduttava ominaisuudet ovat vielä epäselviä. AZGP1 kuuluu makroglobuliinissa perhe, vanha ja evolutionistisesti konservatiivinen lenkki immuunijärjestelmää. Zorin NA et ai. ehdotti, että kapasiteetti makroglobuliinit sitovia hydrolaaseja tekee inhibitio entsyymin välittämän tuumori-invaasio on mahdollista [30]. Samaan aikaan, ylimäärä makroglobuliini /hydrolaasin kompleksit voidaan aktivoida apoptoosin [31]. Hän N et al. raportoitu, että AZGP1 myös alas-säätelee sykliini-riippuvaisen kinaasin, joka on vastuussa säännellä G2-M-siirtymävaiheessa, nopeutta rajoittava vaihe solusyklin. Tämä viittaa siihen, että AZGP1 välillisesti on rooli estää syövän etenemisen [32]. AZGP1 ehdotettiin tuumorisuppressorina haiman syövän Kong B. et ai. Niiden tutkimus ehdotti, että AZGP1 geeni aiheuttaa mesenkymaalisten-to-epiteelin transdifferentiation estämällä TGF-b-välitteisen ERK signalointi [20]. Toiminnallista roolia ja mekanismeja AZGP1 mahasyövän tarvitsevat lisätutkimuksia.

Yhteenvetona ensin tutkineet ekspressiotasot ja ennusteen arvioinnissa on AZGP1 perusterveydenhuollossa mahasyövistä tässä tutkimuksessa. Tutkimuksemme tulokset viittaavat siihen, AZGP1 voisi toimia ehdokkaaksi tuumorisuppressoriproteiinia sekä varoituksia biomarkkereiden perusterveydenhuollossa syöpien ja olla potentiaalinen kohde terapeuttiselle väliintulolle; kuitenkin, molekyylitason mekanismit sääntelyn AZGP1 mahasyövän optio lisätutkimuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksyttiin eettinen komitea Sun Yat-sen University Cancer Center, ja kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan mukana tutkimuksessa.

ihmiskudosnäytekokoelmien s

yhteensä 35 pariksi syöpä ja sovitettu viereisen noncancerous mahan limakalvon kudokset kerättiin mahalaukun syöpäpotilailla gastrectomy Sun Yat-sen University Cancer Center vuodesta 2010 vuoteen 2011. sen jälkeen kirurgisen resektion, raikas kudokset upotettiin välittömästi RNAlater (Ambion, Inc., USA), jotta vältetään RNA: n hajoamisen, säilytettiin 4 ° C: ssa yön yli, jotta perusteellisen tunkeutumisen RNAlater kudokseen ja jäädytettiin sitten -80 ° C: ssa, kunnes RNA: n ja proteiinin uutto suoritettiin. Toinen 248 parafinoidut ensisijainen mahakarsinoo- näytteitä, jotka oli kerätty vuosien 2005 ja 2007 saatiin Sun Yat-sen University Cancer Center. Kukaan näistä potilaista ei ollut saanut sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen leikkausta. Histopatologisen tyyppi ja vaihe mahasyövän määritettiin kriteerien mukaan Maailman terveysjärjestön luokitus ja TNM esitetyt unionin kansainvälisen Cancer Ohjaus.

uutto Kokonais-RNA ja Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) valmistajan protokollan. Kokonais-RNA: n konsentraatio arvioitiin mittaamalla absorbanssi 260 nm: ssä käyttäen NANO DROP spektrofotometriä (ND-1000, Thermo Scientific, USA). Käänteistranskriptio (RT) syntetisoimiseksi ensimmäisen juosteen cDNA tehtiin käyttämällä 2 ug kokonais-RNA: ta käsiteltiin M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega, USA) valmistajan suositusten mukaisesti. Saatu cDNA altistettiin sitten reaaliaikaisella kvantitatiivisella RT-PCR arviointiin suhteellista mRNA tasoja AZGP1 ja GAPDH (glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi, sisäisenä kontrollina) ja seuraavia alukkeita: AZGP1 eteenpäin: 5'-GGAAGCAGGACAGCCAACTT -3 ', ja reverse: 5'-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3'; GAPDH eteenpäin: 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ', ja reverse: 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'. Gene-spesifinen amplifikaatio suoritettiin käyttäen ABI 7900HT reaaliaikainen PCR-järjestelmää (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA), jossa on 15 ul: n PCR-seosta, joka sisälsi 0,5 ui cDNA: ta, 7,5 ui 2 x SYBR Green master mix (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA), ja 200 nM sopivia oligonukleotidialukkeita. Seos esikuumennettiin 95 ° C (10 min) ja monistettiin sitten 95 ° C: ssa (30 sekuntia) ja 60 ° C (1 min), 45 sykliä. Resoluutio käyrä mitattiin 95 ° C 15 sekuntia, 60 ° C 15 sekuntia ja 95 ° C 15 sekuntia. Ct (raja-sykli) arvo kunkin näytteen laskettiin kynnyksen syklien laitteen ohjelmisto (SDS 2,3), ja suhteellinen ilmentyminen AZGP1 mRNA normalisoitiin GAPDH-arvoa. Aineisto analysoitiin käyttämällä vertailevan kynnyssykli (2 ^{-ΔCt) menetelmää seuraavan kaavan mukaisesti: Suhteellinen ekspressiotaso = 2 -ΔCt = 2 -Ct (GAPDH) - 2 -Ct (AZGP1), jossa Ct (GAPDH) tarkoittaa Ct-arvo GAPDH ja Ct (AZGP1) tarkoittaa Ct-arvo AZGP1.}

Western-blottaus-analyysi

homogenoitiin mahasyöpä näytteitä, mukaan lukien kasvain- ja ei-kudokset, lyysattiin RIPA lyysipuskuria, ja lysaatit kerättiin sentrifugoimalla (12000 rpm) 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Noin 20 ug proteiinia jälkeen näytteet erotettiin elektroforeesilla 12% natriumdodekyylisulfaattia polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvoja. Sen jälkeen, kun esto ei-spesifisiä sitoutumiskohtia 60 min 5% rasvatonta maitoa, kalvoja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa kanin monoklonaalinen vasta-aine AZGP1 (PTG Company, USA, klo 1:200 laimennus). Kalvot pestiin sitten kolme kertaa TBST: llä (Tris-puskuroitu suolaliuos, jossa Tween-20) 10 minuutin ajan, ja koettimena piparjuuren peroksidaasiin (HRP) konjugoitua vuohen anti-kani-lgG-vasta-ainetta (Immunology Consultants Laboratory, USA, klo 1: 2000-laimennos) 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Kolmen pesun jälkeen membraanit kehitettiin parannetun kemiluminesenssi-järjestelmän (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA). Bändi intensiteetti mitattiin densitometrian käyttäen Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, USA). Proteiini tasot normalisoitiin että GAPDH havaittiin käyttämällä hiiren anti-ihmisen GAPDH monoklonaalinen vasta-aine (Shanghai Kangchen, Kiina, klo 1:10000 laimennus).

immunohistokemia Analyysi

kudosleikkeiden parafiinista kanssa dimetyylibentseenin ja rehydratoitiin kautta 100%, 95%, 90%, 80% ja 70% etanolia. Kolmen pesun jälkeen PBS: ssä (fosfaattipuskuroitu suolaliuos), levyt keitettiin antigeenin haku, joka sisälsi 0,01 M natriumsitraatti-suolahappoa (pH = 6,0) 15 minuutin ajan mikroaaltouunissa. Huuhtelun jälkeen PBS: llä, kudos leikkeitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen ja objektilasit huuhdeltiin sitten 3% peroksidaasia sammutusta liuos (Invitrogen) endogeenisen peroksidaasin salpaamiseksi. Sitten leikkeitä inkuboitiin kaniinin monoklonaalinen vasta-aine AZGP1 (PTG Company, USA, klo 1:200 laimennus) 4 ° C: ssa yön yli ja sitten niitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) huoneenlämpötilassa 30 min. Pesun jälkeen PBS: ssä, visualisointi signaali kehitettiin 3, 3'-diaminobentsidiini (DAB) liuos, ja kaikki leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Negatiivisina kontrolleina vierekkäisten osioiden käsiteltiin kuten edellä on kuvattu, paitsi että niitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa blokkausliuoksessa ilman primaarista vasta-ainetta.

Näytteet analysoitiin kolme tarkkailijaa (Chunyu Huang, Lin Lv, ja Jingjing Zhao), joka oli sokaissut potilaiden kliinisiä tuloksia. Eroja tarkkailijoita havaittiin alle 10% tutkituista dioja, ja päästiin jälkeen tarkempaa tarkastelua. Yhteenlaskettu AZGP1 immunovärjäyksellä pisteet laskettiin summana prosentin positiivisuus (prosenttiosuus positiivisesti värjättyä kasvainsoluja) ja värjäyksen intensiteettiä. Prosentuaalinen positiivisuus pisteytettiin "0" (< 5%, negatiivinen), "1" (5-25%, satunnaista), "2" (25-50%, polttoväli), tai "3" (> 50 %, hajanainen). Värjäytyminen intensiteetti pisteytettiin "0" (ei värjäystä), "1" (heikosti värjätty), "2" (kohtalaisen värjätty), tai "3" (voimakkaasti värjätty). Yhteenlaskettu AZGP1 immunovärjäyty- pisteet vaihtelivat 0: sta 9 Määrittelimme AZGP1 ekspressiotasot seuraavasti: "-" varten pistemäärä 0-1, "+", jos pisteet 2-3, joka määriteltiin heikkoa ilmentymistä; "++" Varten pisteet 4-6, ja "+++" varten pisteet > 6, joka määriteltiin suuren ilme.

Follow-Up

leikkauksen jälkeinen seuranta up suoritettiin meidän poliklinikalla ja mukana kliiniset ja laboratoriotutkimukset 3 kuukauden välein 2 ensimmäisen vuoden aikana 6 kuukauden välein aikana kolmannesta viidenteen vuotta, ja vuosittain vielä 5 vuoden ajan tai kunnes potilas kuolemaan, kumpi tapahtui ensin. Kokonaiselossaolo, joka määriteltiin aika toiminnasta potilaan kuolemaan tai viimeinen seurannan käytettiin mittana ennustetta. Oli noin 4% potilaista menetti seurannassa.

Tilastollinen analyysi

pariksi-otosten t-testiä käytettiin vertaamaan AZGP1 mRNA tasot kasvain kudosnäytteistä ja viereisen ei- kasvain kudosnäytteitä. χ
^{2 testi suhteessa ja Pearsonin korrelaatiokertoimet käytettiin analysoimaan suhdetta AZGP1 ilmaisun ja erilaisten kliinispatologiset ominaisuudet. Kokonaiselossaoloaika käyrät laskettiin Kaplan-Meier menetelmällä ja analysoitiin log-rank-testi. Coxin suhteellisen riskin analyysiä käytettiin yhden ja usean analyysi tutkia vaikutusta kliinis muuttujien ja AZGP1 ilme eloonjäämiseen. Kaksipuolinen P
-arvo < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin SPSS (versio 17.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA).}

tukeminen Information
Kuva S1.
immunohistokemiallinen havaitseminen AZGP1 proteiinin ilmentymisen mahasyövän kudoksessa. Positiivinen ekspressio AZGP1 paikallistettiin sytoplasmaan.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0069155.s001
(TIF)

• PLoS ONE: vähennys miR-202-3p Expression, Novel kasvain vaimennin, mahasyövän
• PLoS ONE: uusi useampiin alaluokkiin pT4 mahasyövistä Mukaan leveys seröösisiä Invasion