PLoS ONE: Verminderte Expression von AZGP1 ist im Zusammenhang mit einer schlechten Prognose bei primären Magen Cancer

Abstrakt

Hintergrund

2-Zink-Glycoprotein 1 (AZGP1) ist eine multidisziplinäre Protein, das in vielen beteiligt wichtige Funktionen im menschlichen Körper, einschließlich Düngung, Immunregulation und Lipidmobilisierung. Vor kurzem hat sich gezeigt, dass auch in AZGP1 Karzinogenese und Tumordifferenzierung beteiligt ist. In dieser Studie untersuchten wir die Expressionsniveaus und prognostischen Wert von AZGP1 in der primären Magenkrebs.

Methoden und Ergebnisse |

Wir, die Expression von AZGP1 in 35 untersuchten Krebs gepaart und benachbarten noncancerous Magenschleimhaut abgestimmt Gewebe durch quantitative Echtzeit-RT-PCR (qRT-PCR) und western Blotting. Darüber hinaus analysierten wir AZGP1 Ausdruck in 248 Patienten, die zwischen 2005 Resektionsverfahren unterzog und 2007 Immunhistochemie. Die Beziehungen zwischen den AZGP1 Expressionsniveaus, die klinisch-pathologischen Faktoren, und das Überleben der Patienten untersucht. AZGP1 Expression wurde bei deutlich reduziert sowohl die mRNA ( P
= 0,023) und Protein-Ebene ( P
= 0,019) in Proben Tumorgewebe, verglichen mit der Expression in passenden benachbarten Nicht-Tumorgewebeproben . Die immunhistochemischen Färbung Daten zeigten, dass AZGP1 Expression signifikant in 52,8% (131/248) der Adenokarzinom des Magens Fälle verringert wurde. Clinicopathological Analyse zeigte, dass die verminderte Expression von AZGP1 signifikant mit Tumorlokalisation korreliert war ( P
= 0,011), histologischen Grad ( P
= 0,005) und T-Stadium ( P
= 0,008). Kaplan-Meier-Überlebenskurven zeigten, dass die verminderte Expression von AZGP1 mit einer schlechten Prognose in einem Adenokarzinom des Magens Patienten in Verbindung gebracht wurde ( P
= 0,009). Multivariate Cox-Analyse identifiziert AZGP1 Ausdruck war ein unabhängiger prognostischer Faktor für das Gesamtüberleben von Patienten mit Adenokarzinom des Magens (HR = 1,681, 95% CI = 1,134-2,494, P
= 0,011).

Schlussfolgerungen

Unsere Studie legt nahe, dass AZGP1 als Kandidat Tumorsuppressor dienen könnte und einem potenziellen prognostische Biomarker im Magen-Karzinogenese

Citation:. Huang Cy, Zhao Jj, Lv L, Chen Yb, Li Yf, Jiang Ss, et al. (2013) verringerte Expression von AZGP1 mit einer schlechten Prognose in primären Magenkrebs assoziiert ist. PLoS ONE 8 (7): e69155. doi: 10.1371 /journal.pone.0069155

Editor: Alfons Navarro, Universität Barcelona, ​​Spanien

Empfangen: 5. März 2013; Akzeptiert: 5. Juni 2013; Veröffentlicht am: 23. Juli 2013

Copyright: © 2013 Huang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde vom Promotionsfonds des Ministeriums für Bildung von China (20100171110084) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle weltweit, mit 988.000 Neuerkrankungen und 736.000 Todesfälle pro Jahr [1] - [2]. In China wurde Magenkrebs die dritthäufigste Krebserkrankung im Jahr 2005 mit 0,4 Millionen neue Fälle und 0,3 Millionen Todesfälle vorhergesagt werden [3] berichtet. Die Behandlung von Magenkrebs umfasst eine Kombination von Operation, Chemotherapie und Strahlentherapie. Aber fast 60% der betroffenen Patienten erliegen Magenkrebs nach einer kurative Resektion allein oder nach einer kurative Resektion mit anschließender adjuvante Therapie [4]. Magenkrebs ist eine heterogene Erkrankung sowohl in der Histologie und Genetik; daher ist der Behandlungserfolg schwer mit klassischen histologischen Klassifikationen zu prognostizieren. Magen-Krebsentstehung ist eine multifaktorielle und mehrstufiger Prozess, der Onkogenen und Inaktivierung von Tumorsuppressor-Gene in verschiedenen Stadien von Magenkrebs Progression beinhaltet die Aktivierung. Vor kurzem mit Magenkrebs assoziiert mehrere neue Onkogene und Tumorsuppressorgene identifiziert. Daher ist es klinisch wichtig effiziente neue Ziele für die frühzeitige Diagnose und wirksame Behandlung von Magenkrebs zu finden.

AZGP1 (2-Zink-Glycoprotein 1, Zn-alpha 2-Glykoprotein) ist ein 41 kDa lösliches Protein mit einem Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex -ähnlichen-1 (MHC-1) seiner Struktur falten, und es wurde zunächst identifiziert und gereinigt in Humanserum 1961 [5]. Das Gen für AZGP1, übertragen auf dem Chromosom 7q22.1 durch Fluoreszenzhybridisierungs Karyotypisierung, besteht aus vier Exons und drei Introns [6], [7]. Verwendung von immunhistochemischen Untersuchungen wurde gefunden, daß AZGP1 hauptsächlich in den Epithelzellen der Brust exprimiert wird, der Prostata, der Leber und verschiedenen anderen gastrointestinalen Organen [8]. Im Einklang mit der Produktion von sekretorischen Epithelzellen wird AZGP1 in einer Reihe von Körperflüssigkeiten gefunden [9], [10], [11].

AZGP1 ist eine multidisziplinäre Protein, das in vielen wichtigen Funktionen der teilnimmt menschlichen Körpers, einschließlich der Befruchtung [11], Immunregulation [12] und Lipid-Mobilisierung [13], [14], [15]. AZGP1 ist auch mit Krebs-Kachexie in Verbindung gebracht. AZGP1 hat ein hohes Maß an Aminosäuresequenzhomologie mit tumorderivierten fettmobilisierende Faktor [14], und in einem Mausmodell der AZGP1-produzierenden Tumoren, AZGP1 stimulierte Lipolyse in Adipozyten zu Kachexie führt [16]. Vor kurzem hat sich gezeigt, dass auch in AZGP1 Karzinogenese und Tumordifferenzierung beteiligt ist. Protein- und mRNA-Expression Assays haben eine Beziehung zwischen den AZGP1 Ebenen und die histologischen Grad von Brustkrebstumoren [17], [18] gezeigt. Außerdem legen nahe, dass viele Studien AZGP1 ein potentielles Serummarker für Prostatakrebs ist [9], [19]. Darüber hinaus hat sich gezeigt, daß AZGP1 wirkt als ein neues Tumorsuppressor bei Bauchspeicheldrüsenkrebs [20] gezeigt. Bisher sind jedoch die Expressionsstatus von AZGP1 und prognostischen Wert dieses Proteins in primären Magenkrebs wurden nicht gemeldet.

In dieser Studie haben wir die AZGP1 Expressionsniveau in Magenkrebs unter Verwendung von Echtzeit-quantitative RT analysiert PCR (qRT-PCR), Western Blotting und Immunhistochemie. Darüber hinaus haben wir festgestellt, die die Beziehung zwischen AZGP1 Ausdruck und der klinisch-pathologischen Merkmale von Magenkrebs, und wir den prognostischen Wert AZGP1 Ausdruck für die post-Resektion das Überleben von Patienten mit Magenkrebs untersucht.

Ergebnisse |

AZGP1 mRNA-Expression analysiert mit qRT-PCR

Die Transkriptionsebenen von AZGP1 wurden mit qRT-PCR-Assays bestimmt unter Verwendung von 35 Paaren von reseziert Proben (Tumorgewebeproben und angepasst benachbarten nicht-Tumorgewebeproben) von Magenkrebs-Patienten. Die AZGP1 mRNA-Spiegel wurden in 28 (80%) Tumorgewebeproben verglichen mit den angepaßten benachbarten Nicht-Tumorgewebeproben ( P
= 0,023, Abbildung 1).

AZGP1 Expression analysiert signifikant reduziert von Western Blotting

Die AZGP1 Proteinspiegel in der resezierten Magenkrebs Proben wurden mittels Western Blot bestimmt. Die Ergebnisse zeigten eine Bande für AZGP1 bei 41 kDa, und die Menge des vorhandenen Proteins AZGP1 wurde durch Densitometrie und Höhe gemessen. In Übereinstimmung mit den qRT-PCR-Ergebnisse wurden in 25 (71,4%) der Magentumorgewebe im Vergleich mit den angepaßten benachbarten Nicht-Tumorgewebe ( P
= 0,019, 2A) eine Abnahme in AZGP1 Expression beobachtet. Acht Paare von repräsentativen Magentumorgewebe und der zugehörigen benachbarten Nicht-Tumorgewebe wurden in 2B gezeigt.

immunhistochemischen Analyse von AZGP1 Expression in Magenkrebs-Gewebeproben und seine Beziehung mit der klinisch-pathologischen Eigenschaften

um die molekularbiologische Erkenntnisse und untersuchen die klinisch-pathologischen die prognostische Rolle der AZGP1 Ausdruck, um zu bestätigen, führten wir immunhistochemische Analyse in 248 Paraffin eingebetteten Magenkrebs Abschnitte. Der positive Ausdruck AZGP1 wurde in das Zytoplasma (Abbildung S1) lokalisiert. Unter den 248 Magenkrebs Proben, 117 (47,2%) zeigten eine hohe AZGP1 Ausdruck (AZGP1 ++ oder AZGP1 +++), während die übrigen 131 Fällen (52,8%) angezeigt niedrigen AZGP1 Ausdruck (AZGP1- oder AZGP1 +) (Abbildung 3, Tabelle 1). Normale Magengewebe zeigten die stärkste AZGP1 positive Färbung (3A).

basierend auf den Kategorien, die wir in den vorgenannten Verfahren definiert, die Daten zeigten, dass die geringe Expression von AZGP1 signifikant mit Tumorlokalisation korreliert war ( P
= 0,011), histologischen Grad ( P
= 0,005) und T-Stadium ( P
= 0,008), aber nicht mit dem Alter, Geschlecht, Größe des Tumors, radikale Resektion , Lymphknotenstatus (N-Stadium) oder Metastasenstatus (M-Stadium). Die Aufnahmen sind in Abbildung 3 dargestellt

Die Korrelation zwischen AZGP1 Expression Basierend auf Immunhistochemie und das Überleben des Patienten

Die mediane Überlebenszeit der 248 Magenkrebs-Patienten 45 Monate war (Bereich 2-89 Monate) . Die Gesamtüberlebensrate und 5-Jahres-Überlebensrate wurden in hohen AZGP1 Ausdruck Gruppe als die niedrige Expression Gruppe [64,2% vs. 49,5% (Gesamtüberlebensrate) und 65,1% vs. 50,4% (5-Jahres-Überlebensrate) deutlich verbessert, bzw. P
= 0,009, Abbildung 4].

eindimensionale und mehrdimensionale Analysen

Univariate und multivariate Analysen wurden durchgeführt, die Auswirkungen der AZGP1 Expression und anderen klinischen Parametern auf zu vergleichen Prognose. Basierend auf einer univariaten Analyse, die alle 248 Patienten eingeschlossen wurden acht Faktoren gefunden statistisch signifikante Assoziationen mit Gesamtüberleben zu haben. Bei dieser Analyse wurden folgende Faktoren in Betracht: Tumorlokalisation, Tumorgröße, Grading, AZGP1 Expressionsniveaus, TNM-Stadium (7. Auflage TNM-Klassifikation) und ob eine radikale Resektion durchgeführt wurde (Tabelle 2). Alle acht Faktoren wurden in einer multivariaten Cox-Proportional-Hazards-Modell enthalten die Effekte der Kovariablen anzupassen. Basierend auf diesem Modell der Tumorlokalisation, AZGP1 Expressionsniveaus, T-Stadium und N-Stadium des Tumors als unabhängige prognostische Faktoren (Tabelle 2) bestätigt.

Diskussion

Magenkrebs bleibt eine der die meisten tödlichen menschlichen Tumoren. Auch mit den Fortschritten bei der Diagnose und Therapie ist die Prognose für Magenkrebs immer noch düster [1], [21]. Das klinische Ergebnis von Magenkrebs, hängt von einer Reihe von Tumor-Eigenschaften, wie beispielsweise Tumorwachstum, Differenzierung, Invasion und Metastasierung, das durch eine Vielzahl von verwandten Genen reguliert werden. Daher wird allgemein angenommen, dass genetische Veränderungen an der Aktivierung von Onkogenen und führt die Inaktivierung von Tumorsuppressoren die zugrundeliegenden Ursachen von Krebs Pathogenese sind. Die sequentielle Verstärkung von Onkogenen und den Verlust von Tumorsuppressoren sorgen für die notwendige Grundlage für die schrittweise Progression von soliden Tumoren von der Initiierung der Transformation und Tumorprogression [22], [23], [24]. Zuvor hat AZGP1 besitzen tumorsuppressive Eigenschaften bei Brustkrebs, Prostatakrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs und einigen anderen bösartigen Tumoren [17], [20], [25] berichtet worden; aber die Rolle der AZGP1 in primären Magenkrebs ist noch nicht bewertet worden. Unsere Studie zeigte, dass AZGP1 Expression signifikant sowohl auf mRNA- und Protein-Niveaus in Tumorgewebeproben reduziert, verglichen mit der Expression in passenden angrenzenden Nicht-Tumorgewebeproben. In Übereinstimmung mit unserer Studie, Brysk MM et al. auch gezeigt, dass die AZGP1 Niveaus in normalen Mundgewebe höher sind als bei der oralen Tumoren [26]. Gagnon S et al. auch bewiesen, dass AZGP1 in gutartigen hyperplastischen Drüsen in 91,1% der Fälle war aber in nur 40,7% (schlecht differenziert Komponente) auf 48,5% (gut differenziert Komponente) von Prostata-Adenokarzinome und nur 8% der Metastasen [27]. Diese Studienergebnisse stützen die Hypothese, dass AZGP1 als Tumorsuppressor in einigen Krebsarten dienen können.

Im Anschluss an diese Reduktion der AZGP1 Expression in primären Magenkrebs bestätigen, führten wir immunhistochemische Analyse mit einem Kaninchen-Anti-hAZGP1 Antikörper. Wir beobachteten eine geringere Expression von AZGP1 Immunfärbung in proximaler oder Gesamtmagenkrebs im Vergleich mit entfernten Magenkrebsgewebe. Einige Studien haben bewiesen, dass proximalen Magenkrebs-Patienten haben eine schlechtere Überleben als entfernte Magenkrebs-Patienten [28]. Diese Daten legen nahe, dass die geringe Expression von AZGP1 bei Magenkrebs ist mit mehr maligne Phänotypen. Darüber hinaus haben wir entdeckt, dass die Expression von AZGP1 nahm mit schlecht differenzierten Adenokarzinomen (G3 vs. G1 /G2) verbunden war, was darauf hinweist, dass AZGP1 die Differenzierung von Magenkrebs induzieren kann. Diese Ergebnisse sind konsistent mit den Ergebnissen von Diez et al. [17], [18], die einen Zusammenhang zwischen hohen AZGP1 Ausdruck und ein hohes Maß an Differenzierung in Brustkrebs beschrieben. Ähnliche Ergebnisse wurden für Prostatakrebs [19], Brustkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs berichtet [26] auch wurde. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die geringe Expression von AZGP1 mit fortgeschrittenem T-Stadium verbunden war. Diese Ergebnisse angedeutet, dass die geringe Expression von AZGP1 könnte das Tumorwachstum fördern. Gemäß unserer Studie Irmak S et al. vorgeschlagen, dass AZGP1 zur Entwicklung von oberflächlichem Blasenkrebs und seine Transformation zu einem invasiven Phänotyp [29] verwandt ist. Diese Ergebnisse zeigen, gemeinsam eine wichtige Rolle für AZGP1 bei der Differenzierung und das Wachstum von Magenkrebs.

Mit der Kaplan-Meier-Überlebensanalyse, Patienten in unserer Studie mit niedrigem AZGP1 Ausdruck hatten eine signifikant kürzere Überlebenszeit als diejenigen mit hohen Expressionsniveaus. Univariate Analysen zeigten, dass die verminderte Expression von AZGP1 in Geweben Magenkrebs signifikant mit der Gesamtüberlebensrate und der 5-Jahres-Überlebensrate verbunden war. Multivariate Analyse zeigte, dass AZGP1 Ausdruck, zusammen mit einigen traditionellen prognostische Faktoren wie Tumorlokalisation, T-Stadium und N-Stadium, waren unabhängige Risikofaktoren für die Prognose von Patienten mit Magenkrebs. Diese Ergebnisse legen nahe, dass AZGP1 als neuer Indikator für die Prognose bei Patienten mit Magenkrebs nach der operativen Resektion dienen könnten.

Die molekularen Mechanismen der AZGP1 des Tumorsuppressor-Eigenschaften sind noch unklar. AZGP1 gehört zur Familie Makroglobulin, ein altes und evolutionär konservative Verbindung des Immunsystems. Zorin NA et al. vorgeschlagen, dass die Hemmung der Enzym-vermittelte zur Bindung Hydrolasen macht Tumorinvasion möglich [30] die Fähigkeit der Makroglobuline. Zur gleichen Zeit wird ein Überschuss an Makroglobulin /Hydrolase Komplexe können Apoptose [31] aktivieren. Er N et al. berichtet, dass AZGP1 Cyclin-abhängige Kinase, die zur Regulierung des G2-M-Übergang, einen geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt in dem Zellzyklus auch nach unten reguliert verantwortlich ist. Dies deutet darauf hin, dass AZGP1 spielt indirekt eine Rolle Tumorprogression [32] in behindern. AZGP1 wurde als Tumorsuppressor in Bauchspeicheldrüsenkrebs durch Kong B. et al vorgeschlagen. Ihre Studie schlug vor, dass die AZGP1 Gen durch die Hemmung der TGF-b-vermittelte ERK-Signal [20] mesenchymalen-to-epithelialen transdifferentiation induziert. Die funktionelle Bedeutung und Mechanismen der AZGP1 bei Magenkrebs müssen weitere Untersuchungen.

Abschließend wir zunächst die Expressionsniveaus und prognostischen Wert von AZGP1 in primären Magenkrebs in dieser Studie untersucht. Unsere Studie Ergebnisse zeigten, dass AZGP1 als Kandidat Tumorsuppressor und prognostische Biomarker in primären Magenkrebs dienen könnte und ein potenzielles Ziel für therapeutische Intervention sein; aber die beteiligten molekularen Mechanismen bei der Regulation von AZGP1 bei Magenkrebs rechtfertigt weitere Untersuchungen.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Diese Arbeit wurde von der Ethikkommission genehmigt wurde von Sun Yat-sen University Cancer Center, und eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von jedem Patienten in der Studie erhalten.

Human Tissue Beispiel s

insgesamt 35 gepaart Krebs und angepasst benachbarten noncancerous Magenschleimhaut Gewebe von Patienten mit Magenkrebs gesammelt wurden Gastrektomie bei Sun Yat-sen University Cancer Center von 2010 bis 2011. nach der chirurgischen Resektion, die frischen Gewebe wurden sofort in RNAlater (Ambion, Inc., USA) eingetaucht zu vermeiden RNA-Abbau, bei 4 ° C über Nacht gelagert gründlich Eindringen von RNAlater in das Gewebe zu ermöglichen, und dann bei -80 ° C eingefroren, bis die RNA und Protein-Extraktion durchgeführt wurde. Weitere 248 in Paraffin eingebettete primären Magenkarzinom Proben, die zwischen 2005 und 2007 gesammelt worden waren, wurden von der Sun Yat-sen University Cancer Center erhalten. Keiner dieser Patienten hatte eine Strahlentherapie oder eine Chemotherapie vor der Operation erhalten. Die histopathologische Art und dem Stadium der Magenkrebs wurden nach den Kriterien der Klassifizierung der Weltgesundheitsorganisation festgelegt und der TNM-Stadium von der Union for International Cancer Control enthalten.

Extraktion von Gesamt-RNA und quantitative Echtzeit RT-PCR

die Gesamt-RNA extrahiert wurde mit TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die Gesamt-RNA-Konzentration wurde durch Messung der Absorption bei 260 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers NANO DROP (ND-1000, Thermo Scientific, USA) bewertet. Reverse Transkription (RT), der erste Strang der cDNA zu synthetisieren, wurde unter Verwendung von 2 ug Gesamt-RNA behandelt mit M-MLV reverser Transkriptase (Promega, USA) nach den Empfehlungen des Herstellers. AZGP1 vorwärts: Die resultierende cDNA wurde dann auf quantitative RT-PCR in Echtzeit zur Auswertung der relativen mRNA-Spiegel von AZGP1 und GAPDH (Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, als interne Kontrolle) mit den folgenden Primern unterworfen 5'-GGAAGCAGGACAGCCAACTT -3 ', und umgekehrt: 5'-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3'; GAPDH vorwärts: 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ', und umgekehrt: 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'. Gene-spezifische Amplifikation wurde durchgeführt mit einem ABI 7900HT real-time PCR-System (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit einem 15-ul PCR-Gemisch, das 0,5 ul cDNA, 7,5 ul 2 × SYBR Green Master-Mix (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) und 200 nM der geeigneten Oligonukleotidprimer. Die Mischung wurde bei 95 ° C (10 min) vorgewärmt und dann bei 95 ° C (30 sec) und 60 ° C (1 min) für 45 Zyklen amplifiziert. Die Auflösungskurve wurde für 15 sec bei 95 ° C gemessen wird, 60 ° C für 15 sec und 95 ° C für 15 sec. Der Ct (threshold cycle) Wert jeder Probe wurde mit dem Gerät der Software (SDS 2.3) von der Schwellenzyklen berechnet, und die relative Expression der AZGP1 mRNA wurde in den GAPDH-Wert normalisiert. Die Daten wurden mit Hilfe des Vergleichsschwellenzyklus analysiert (2 ^{-ΔCt) Verfahren wie die folgende Formel: Relative Ausdruck level = 2 -ΔCt = 2 -Ct (GAPDH) - 2 -Ct (AZGP1), in der Ct (GAPDH) ist die Ct-Wert von GAPDH und Ct (AZGP1) ist die Ct-Wert von AZGP1.}

Western Blotting Analyse

die homogenisierten Magenkrebs Proben, einschließlich Tumor- und Nicht-Tumorgewebe wurden in RIPA Lysepuffer lysiert, und die Lysate wurden durch Zentrifugation (12.000 UpM) bei 4 ° C für 30 min geerntet. Etwa 20 ug Protein Proben wurden dann durch Elektrophorese in einem 12% igen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel und auf eine Polyvinyliden-Fluorid-Membranen getrennt. die nicht-spezifische Bindungsstellen für 60 min mit 5% fettfreier Milch Nach dem Blockieren wurden die Membranen über Nacht bei 4 ° C mit einem Kaninchen-monoklonalen Antikörper gegen AZGP1 (PTG Company, USA, mit einer 1:200 Verdünnung) inkubiert. Die Membranen wurden dann dreimal mit TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20) für 10 min und mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Immunology Consultants Laboratory, USA untersucht, bei einer 1: 2000-Verdünnung) bei 37 ° C für 1 Stunde. Nach dreimaligem Waschen wurden die Membranen mit einem verstärkten Chemilumineszenz-System (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA) entwickelt. Die Bandenintensität wurde durch Densitometrie unter Verwendung der Quantity One Software (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, USA) gemessen. Die Proteingehalte wurden normalisiert, die der GAPDH eine Maus Anti-Human-GAPDH monoklonalen Antikörper nachgewiesen unter Verwendung von (Shanghai Kangchen, China, bei einer 1:10000 Verdünnung).

Immunhistochemie Analyse

Die Gewebeschnitte wurden mit Dimethylbenzol und rehydratisiert bis 100%, 95%, 90%, 80% und 70% Ethanol entparaffiniert. Nach dreimaligem Waschen in PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) wurden die Objektträger in Antigen-Retrieval-Puffer, enthaltend 0,01 M Natriumcitrat-Salzsäure (pH = 6,0) für 15 min in einem Mikrowellenofen gekocht. Nach dem Spülen mit PBS wurden die Gewebeschnitte mit dem primären Antikörper inkubiert, und die Objektträger wurden dann in 3% Peroxidase Quenching-Lösung (Invitrogen) endogene Peroxidase zu blockieren gespült. Die Schnitte wurden dann mit einem Kaninchen-monoklonalen Antikörper gegen AZGP1 (PTG Company, USA, mit einer 1:200 Verdünnung) inkubiert bei 4 ° C über Nacht und dann mit Meerrettichperoxidase (HRP) (DAKO ChemMateTM EnVisionTM Detection Kit) bei Raumtemperatur inkubiert, 30 Minuten. Nach dem Waschen mit 3, in PBS wurde das Visualisierungssignal 3'-Diaminobenzidin (DAB) Lösung entwickelt, und alle Folien wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. Als Negativkontrollen wurden benachbarte Abschnitte mit der Ausnahme, wie beschrieben verarbeitet, daß sie bei 4 ° C über Nacht inkubiert wurden Lösung ohne primäre Antikörper bei der Blockierung.

Die Proben durch drei Beobachter (Chunyu Huang, Lin Lv analysiert wurden, und Jingjing Zhao), die auf die klinischen Ergebnisse von Patienten geblendet wurden. Abweichungen zwischen den Beobachtern wurden in weniger als 10% der untersuchten Folien und ein Konsens gefunden wurde, nach einer weiteren Überprüfung erreicht. Die Gesamt AZGP1 Immunofärbung Punktzahl wurde als die Summe der Prozent-Positivität (der Prozentsatz der positiv gefärbten Tumorzellen) und die Färbungsintensität berechnet. Die prozentuale Positivität wurde als "0" (< 5%, negativ) hat, "1" (5-25%, sporadische), "2" (25-50%, fokale) oder "3" (> 50 %, diffus). Die Färbungsintensität wurde als "0" (keine Färbung) erzielt, "1" (schwach gefärbt), "2" (mäßig gefärbt), oder "3" (stark gefärbt). Die Gesamt AZGP1 immunostaining Punktzahl lag im Bereich von 0 bis 9. Wir haben die AZGP1 Expressionsniveaus wie folgt definiert: "-" für eine Punktzahl von 0-1, "+" für einen Score von 2-3, die so niedrig Ausdruck definiert wurden; "++" Für eine Punktzahl von 4-6, und "+++" für eine Kerbe >. 6, die als hohe Expression definiert wurden

Follow-Up

Die Nachuntersuchungs -up wurde in unserer Ambulanz durchgeführt und umfasste klinische und Laboruntersuchungen alle 3 Monate für die ersten 2 Jahre, alle 6 Monate während der dritten bis fünften Jahr, und jährlich für weitere 5 Jahre oder bis Tod des Patienten, je nachdem, was zuerst eintrat. Das Gesamtüberleben, die als die Zeit von der Operation den Tod des Patienten oder der letzten Follow-up wurde als Maß für die Prognose verwendet definiert wurde. Es waren etwa 4% der Patienten Follow-up verloren.

Statistische Analyse

Ein gekoppeltes-Proben t-Test, um die AZGP1 mRNA-Spiegel in den Tumorgewebeproben und dem benachbarten nicht zu vergleichen verwendet wurde, Tumorgewebeproben. Die χ
^{2 Test für Proportionen und Pearson-Korrelationskoeffizienten wurden verwendet, um die Beziehung zwischen AZGP1 Expression und verschiedenen klinisch-pathologischen Eigenschaften zu analysieren. Die Gesamtüberlebenskurven wurden mit der Kaplan-Meier-Methode berechnet und wurden mit dem Log-Rank-Test analysiert. Cox-Proportional-Hazard-Analyse wurde für univariate und multivariate Analyse verwendet, um die Wirkung von klinisch-pathologischen Variablen und AZGP1 Ausdruck auf das Überleben zu erkunden. Eine zweiseitige P
-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle statistischen Analysen wurden mit SPSS Software (Version 17.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt.}

Grundinformationen
Abbildung S1.
immunhistochemischen Nachweis des AZGP1 Proteinexpression in Gewebemagenkrebs. Der positive Ausdruck AZGP1 wurde in das Zytoplasma lokalisiert
doi:. 10.1371 /journal.pone.0069155.s001
(TIF)

• PLoS ONE: Abnahme des miR-202-3p Expression, einer neuartigen Tumor Suppressor, in Magenkrebs
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