PLoS ONE: Interleukiini 17A Edistää mahasyövän invasiivisuus kautta NF-KB välitteisen matriisimetalloproteinaasientsyymien 2 ja 9 Expression

tiivistelmä

interleukiini 17A (IL-17A), kuten tulehdusta sytokiinien, osallistuu patologiaan tulehdussairauksien ja kasvaimen microenvironment. Tutkimuksen tavoitteena on tutkia vaikutusta IL-17A on invasiivisuus mahasyövän (GC). Tutkimuksessa, huomasimme, että IL-17A voi edistää muuttoliikettä ja hyökkäyksen GC soluja. Lisäksi sen jälkeen kun on käsitelty IL-17A, ilmaisuja ja toimintaa matriisin metalloproteinaasi 2 (MMP-2) ja MMP-9 oli voimistunut, kun taas ilmaisuja TIMP-1 ja TIMP-2: ta säädeltiin vähentävästi. Lisäksi ydinvoiman /yleistä jakeet p65 ja p50 dramaattisesti kohonnut IL-17A. Esikäsittely helenalin, ydinvoima tekijä-KB (NF-KB) estäjä, on osoittautunut poistaa edistävää vaikutusta IL-17A on hyökkäys kyky GC solujen ja säätelyä MMP-2 ja MMP-9. Johtopäätöksenä havaintomme kuvitettu että IL-17A voisi edistää hyökkäys GC solujen aktivoimalla NF-KB-reitin, ja sittemmin upregulating ilmentymistä MMP-2 ja MMP-9. Nämä tulokset voivat johtaa tunnistamiseen diagnostisia markkereita ja terapeuttisia tavoitteita GC.

Citation: Wang Y, Wu H, Wu X, Bian Z, Gao Q (2014) interleukiini 17A Edistää mahasyövän invasiivisuus kautta NF -κB välittämä matriisimetalloproteinaasientsyymien 2 ja 9 Expression. PLoS ONE 9 (6): e96678. doi: 10,1371 /journal.pone.0096678

Toimittaja: Nikos K. Karamanoun, University of Patras, Kreikka

vastaanotettu: 26 marraskuu 2013; Hyväksytty: 11 huhtikuu 2014; Julkaistu: 06 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Projekti tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81070536) ja Nuorten tieteellinen varat keskussairaala Taian (2011ZRQNO35). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Koska yksi alkuun syitä syöpään liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti, GC on vastuussa yli 700000 kuolemantapausta vuodessa [1]. Se on toiseksi yleisin syöpä ja kolmanneksi yleisin kuolinsyy syöpäpotilaiden Kiinassa [2]. Voimakas hyökkäys ja etäpesäkkeiden kyky GC on yksi tärkeimmistä tekijöistä, jotka johtavat huonoon ennusteeseen [3]. Siksi on merkittävä paljastaa taustalla olevien mekanismien, tunnistaa uusia molekyyli hoitotavoitteet, jotka säätelevät hyökkäys kyvyt GC solun, ja täten kehittää eteenpäin hoitoja GC.

IL-17A on perustajajäsen IL -17 perhe, joka vaihtelee IL-17A IL-17F: ksi [4] - [8]. IL-17-perheen jäsenillä aktiivisesti erilaisia ​​sairauksia, kuten autoimmuunisairaudet, tulehdussairaudet ja pahanlaatuiset sairaudet. Jatkuva tulehdus on katsottu korreloivan lisääntynyt riski GC [9]. Varhainen vaiheet mahasyövän liity Helicobacter pylori
(H. pylori) -infektio johtaa krooninen aktiivinen ja atrofinen gastriitti proinflammatoristen välittäjäaineiden [10] - [13], kuten IL-1b, TNFa, IFNy, IL-6 ja IL-8. Kuitenkin rooli IL-17A syövässä oli ristiriidassa mukaan aiempien raporttien. Jonkin verran näyttöä paljasti, että IL-17A voitaisiin edistää kasvaimen kasvua stimuloimalla angiogeneesiä ja invasiivisia kapasiteetti syöpäsoluja [14]. Sen sijaan muut tutkimukset ehdotti, että IL-17A osoitti suojaava vaikutus kroonisen lymfosyyttisen leukemian kehitystä edistämällä immuunijärjestelmävälitteisistä kasvaimen hyljinnän [15]. Lisäksi IL-17A parannettu sytotoksisia vaikutuksia NK-solujen kasvainsoluja vastaan ​​kasvattamalla ilmentymistä sytotoksisia molekyylejä [16]. Tähän asti on vähemmän raportti roolista IL-17A hyökkäyksen GC.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että IL-17A voisi lisätä GC soluliikkuvuus säätelemällä MMP-2 ja MMP -9 kautta aktivoimalla NF-KB: n transkriptin tekijöistä.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen GC solulinjaa AGS hankittiin ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) ja pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Hyclone, Logan, UT), 100 U /l penisilliiniä ja 100 mg /l streptomysiiniä. Ihmisen GC solulinjat BGC-823 ja SGC-7901 saatiin Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina), ja niitä viljeltiin RPMI-1640-alustassa, joka sisälsi 10% naudan seerumia, penisilliiniä (100 U /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml). Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO _{2 ilmakehässä.}

haavan paraneminen Pitoisuus

GC-soluja viljeltiin kuten konfluentteja yksittäiskerroksina 6-kuoppalevylle ja haavoittui poistamalla 1 mm liuskan poikki hyvin pipetillä kärki, kun ne kiinni levyn pintaan. Haavoittuneen yksittäiskerroksia pestiin sitten kahdesti PBS: llä poistamaan tarttumattomat solut ennen 1 ml: ssa alustaa kanssa tai ilman IL-17A (50 ng /ml) (R &D System, Minneapolis, MN) lisättiin. 12 tunnin kuluttua inkuboinnin eri pitoisuus ryhmiä kuvannut ylösalaisin micrographs.

In vitro
invaasiomääritys

in vitro
invaasiomääritys suoritettiin käyttäen Bio-Coat Matrigel invaasiomääritys järjestelmän (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), kuten aiemmin on kuvattu [17]. Käsittelyn jälkeen tai ilman IL-17A (50 ng /ml), GC-soluja siirrostettiin 200 ui seerumia ja asetettiin yläkammiot 2 x 10 ^{5-soluja ja normaaleja kasvualustaa laitettiin alla kammioissa . Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin solut yläpinnan kalvon poistettiin vanutupoilla, kun taas solut, pohjassa puolella suodattimen kiinnitettiin, värjättiin ja mitattiin. Prosenttiosuus invasiivisen määrä ilmaistiin prosentteina kontrollista.}

Western-blottaus-analyysi

Koko solulysaatteja GC solut kerättiin solujen hajotuspuskuria. Nuclear lysaatit viljellyistä soluista kerättiin kanssa NucBusterTM Protein Extraction Kit (Novagen, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Western blotting-analyysit suoritettiin standardin protokollan käyttämällä vasta-aineita vastaan ​​MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, p52 ja β-aktiini (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), NF-KB: n p50, p65 /RelA, c-Rel, RelB, ja histoni H1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Zymografia

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla IL-17A 37 ° C: ssa 24 h, ja näytteitä väliaine kerättiin. Sopivat tilavuudet näytteiden (oikaistuna tärkeää solujen määrä) erotettiin 0,1% gelatiinia, 8% SDS-PAGE-elektroforeesilla. Elektroforeesin jälkeen geelit pestiin kahdesti 2,5% Triton X-100 huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan ja sitten inkuboitiin reaktiopuskurissa (10 mM CaCl _{2, 40 mM Tris-HCI: a ja 0,01% NaN 3, pH 8,0) 37 ° C: ssa 12 tuntia. Coomassie brilliant blue R-250 geeli tahra käytettiin sitten värjää geelin. Intensiteetit bändejä geelit laskettiin kuva-analyysi-järjestelmän (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).}

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvoina ± SD. Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 16.0 ohjelmistolla (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) arvioimaan tilastollisia eroja. Opiskelijan t
-testi käytettiin vertailuissa kahden ryhmän välillä ja yksisuuntainen tai kaksisuuntainen varianssianalyysi käytettiin analysoimaan tilastollisia eroja ryhmien eri olosuhteissa. p
arvo alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia.

Tulokset

IL-17A Lisäykset soluliikkuvuus GC Solut

scratch-haavan määritys suoritettiin määrittämiseksi IL-17A on siirtymä AGS, BGC-823, ja SGC-7901-soluissa. Laajentamalla solumigraation kvantifioitiin arvioimalla prosenttiosuus recolonization haavan pinnan 24 tunnin kuluttua. Kontrolliryhmässä, liike ei ole itsestään selvää. Kun läsnä on IL-17A, tämä liike on edistänyt merkittävästi sen jälkeen, kun 12 tunnin inkuboinnin (kuvio 1A). Kvantifiointi analyysi osoitti, että ero oli merkitsevä (kuvio 1 B). Lisäksi invaasiomääritys osoitti, että invasiivisen kyvyn IL-17A käsitellyistä soluista oli huomattavasti voimakkaampi kuin valvoa vanhempien soluja kaikissa kolmessa testattu solulinjoissa (kuvio 1 C ja 1 D). Nämä tulokset osoittivat, että IL-17A voisivat tehostaa GC solujen vaeltamiseen ja invasiivisuus. Lisäksi olemme havaittu, että IL-17A ei ole merkittävää vaikutusta leviämisen BGC-823, SGC-7901 ja AGS soluja (kuvio S1), mikä viittaa siihen, että edistävää vaikutusta IL-17A maahanmuutosta ja invasiivisuus ei häiritä solu leviämisen.

vaikutus IL-17A on lisääntymisen merkkejä MMP-2 ja MMP-9 ja alassäätely TIMP-1 ja TIMP-2 GC Solut

Koska yli-ilmentyminen MMP voi edistää syövän etäpesäkkeiden [18], [19], tutkimme seuraavaksi, vaikutus IL-17A on MMP ilmentyminen GC solulinjoissa. Kuten kuviossa 2 ja kuviossa S2, ilmaukset MMP-2 ja MMP-9 verrattiin käyttäen Western blotting välillä IL-17A käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen. Tulos osoitti, että MMP-2 ja MMP-9: ilmentyivät IL-17A käsiteltyjen solujen (AGS ja BGC-823) (kuvio 2A ja 2B). Samaan aikaan, ilmaukset TIMP-1 ja TIMP-2: ta säädeltiin (kuvio 2A ja 2B). Gelatiinitsymografialla suoritettiin myös arvioida MMP-2 ja MMP-9: n GC-soluissa, joita käsiteltiin tai ilman IL-17A. Tulokset osoittivat, että IL-17A tehosti MMP-2 ja MMP-9 GC soluissa (AGS ja BGC-823) (kuvio 2C ja 2D). Samanlaisia ​​tuloksia on havaittu SGC-7901-soluja (kuvio S2). Nämä tulokset viittaavat siihen, että pro-etäpesäke IL-17A GC ehkä kautta säädellään MMP /TIMP tasapainossa ja sai meidät tutkimaan edelleen sen vaikutusmekanismi.

IL-17A ylössäätelee MMP-2 ja MMP- 9 ilmaisujen kautta aktivointi NF-KB: n Pathway

NF-KB: n on raportoitu alavirran kohde IL-17A-signalointireitin monissa soluissa [17], [20], [21], joka pystyy upregulate MMP-2 ja MMP-9 ilmaisuja [14], [17]. Ja IL-17A raportoitiin myös lisätä ilmentymistä MMP kautta aktivoimaan NF-KB-reitin monissa soluissa [14], [17]. Siksi me seuraavaksi tarkistetaan onko IL-17A voimistunut MMP-2 ja MMP-9 ilmaisuja GC soluihin aktivoimalla NF-KB. Kuten on esitetty kuviossa 3, ilmentymistä ja translokaation NF-KB: n alayksiköiden nucleus analysoitiin Western-blottauksella. Havaitsimme, että taso p65 ja p50 in ytimet dramaattisesti koholla AGS soluissa jälkeen IL-17A hoitoa, kun taas taso yleistä p65 ja p50 ei ole muutosta (kuva 3A-D). Lisäksi ydinvoiman /yleinen osa näistä molekyyleistä nostettiin upon IL-17A käsittely (kuvio 3E). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin BGC-823-solulinja (kuvio S3A-E), joka osoittaa, että IL-17A aktivoitua NF-KB: n GC-solulinjoissa.

Lisäksi, kun helenalin (5 uM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), joka on NF-KB: n estäjä, lisättiin AGS tai BGC-823-solujen väliaineessa ennen IL-17A käsittely, ilmaisu MMP-2 ja MMP-9 oli vähentynyt merkittävästi (kuvio 4C-D, Kuvio S4C-D). Tuloksena osoitettiin, että IL-17A indusoi MMP-2 ja MMP-9 ekspression GC soluun NF-KB: n aktivaation. Näin ollen IL-17A indusoiman GC solun invasiivisuus voi myös estää helenalin in vitro
(kuvio 4A-B, kuvio S4A-B). Näin ollen, nämä tulokset viittaavat siihen, että IL-17A aktivoi NF-KB: n reitti, sen jälkeen säätelee ilmentymistä MMP, ja vaikuttaa siten muuttoliike ja invasiivisuus GC soluja.

Keskustelu

GC on yksi kohtalokkain pahanlaatuisia sairauksia maailmassa, koska sen korkea uusiutumisriski jälkeen parantava hoitomuotoihin [3], [22]. GC läheisesti korreloi kroonisiin tulehdussairauksiin, jossa runsaasti tulehduksellisten sytokiinien tunkeutua. IL-17A on yksi tärkeä inflammatoristen sytokiinien kehityksen monissa autoimmuunisairauksissa, ja se on myös usein havaittu kasvaimen mikroympäristössä [23] - [26]. Edellinen tutkimus ehdotti, että ekspressiotasot IL-17 kasvaimen voisi olla itsenäinen prognostinen indikaattori mahalaukun adenokarsinooman potilailla [27]. Vertailu eloonjäämisluvut potilaiden välillä, joilla on korkea ja alhainen IL-17 havaittiin, että potilaat, joilla on korkea IL-17 oli 5 vuoden pysyvyys 47% verrattuna 84% potilailla, joilla on alhainen [28]. Kuitenkin molekyylitason mekanismeja korrelaatioestimaatteihin, jotka voivat auttaa meitä ymmärtämään paremmin roolin IL-17 kehittämisessä ja edistymistä GC, on vielä selvittämättä.

Tässä tutkimuksessa havaittiin, että IL- 17A edistänyt hyökkäyksen GC soluja. Etäpesäke on yksi johtavista syövän syiden liittyvä kuolema keskuudessa GC potilailla. Hajoamista ECM veren tai imusuonten on kriittinen etäpesäke, koska menetys ECM mahdollistaa syöpäsolujen hyökätä veren tai lymfaattisen järjestelmän ja levitä muihin kudoksiin ja elimiin [29]. MMP, erityisesti MMP-2 ja MMP-9, ovat vastuussa huonontamatta ECM [19], [29]. IL-17A on esitetty edistävän hyökkäyksen syöpäsolujen kautta säätelemällä ilmentymisen MMP-2 ja MMP-9: [17], [26]. On yleisesti hyväksytty, että MMP toimintaa estää TIMP estää laajan ECM hajoamiseen [29]. Selventää vaikutusmekanismi IL-17A, tutkimme onko edistävää vaikutusta IL-17A solujen invaasio kautta sääntely ilmauksia MMP-2, MMP-9, TIMP-1 ja TIMP-2. Tuloksemme osoittivat, että IL-17A koholla ilmaisuja ja toimintaa MMP-2 ja MMP-9, ja vaimentua ilmaukset TIMP-1 ja TIMP-2, joka selitti lisäksi, että IL-17A edistetään soluvaelluksen tyhjästä haavan paranemista määritys. Siksi pro-etäpesäke IL-17A GC ehkä kautta säädellään MMP /TIMP tasapainossa.

NF-KB: n on raportoitu alavirran kohteena IL-17A signalointireitistä monissa soluissa [17] [20], [21], joka pystyy upregulaatioon MMP-2 ja MMP-9 ilmaisuja [14], [17]. Ja IL-17A raportoitiin myös lisätä ilmentymistä MMP kautta aktivoimaan NF-KB-reitin monissa soluissa [14], [17]. Joten tutkimme, onko säätely MMP-2 ja MMP-9 indusoi IL-17A on aktivoimalla NF-KB-reitin. Tulokset osoittivat IL-17A edistää tumaansiirtymiseen, että p65 ja p50-alayksiköiden GC-solujen ja sen jälkeen voimistunut ilmentyminen MMP-2 ja MMP-9. Tämä vaikutus voidaan tehokkaasti estää NF-KB estäjä, mikä viittaa siihen, että NF-KB on mahdollinen mekanismi upregulate MMP-2 ja MMP-9 IL-17A.

Johtopäätöksenä meidän päätelmissään että IL-17A pystyi edistämään muuttoa ja invasiivisuus GC solujen aktivoimalla NF-KB-reitin, joka myöhemmin upregulated lausekkeet MMP-2 ja MMP-9 ja siten vaikuttaa siirtolaisuuden ja invasiivisuus GC soluja. Edelleen luonnehdinta IL-17A GC invaasio ja etäpesäkkeiden voivat johtaa tunnistamiseen diagnostisia markkereita ja terapeuttisia tavoitteita.

tukeminen Information
Kuva S1.
vaikutus IL-17A proliferaatioon BGC-823, SGC-7901 ja AGS soluja.
doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s001
(TIF) B Kuva S2.
IL-17A edistää ilmaisuja MMP-2 ja MMP-9 ja estää ilmaisuja TIMP-1 ja TIMP-2: SGC-7901-soluja. (A) ilmaisujen MMP: iden SGC-7901-soluja verrattiin Western blot välillä käsiteltyjen solujen kanssa ja ilman IL-17A (50 ng /ml) 24 tuntia. (B) kvantifiointi proteiinin MMP-2 ja MMP-9. Arvot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena. * p
< 0,05, verrattuna kontrolliryhmään.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s002
(TIF) B Kuva S3.
IL-17A aktivoi NF-KB: BGC-823 soluja. (A) Western blot-analyysiä käytettiin havaitsemaan yleistä p50, p65, p52, c-Rel ja RelB ilmentymisen BGC-823-soluja käsiteltiin IL-17A (50 ng /ml) ilmoitettuina ajankohtina. (B) kvantifiointi proteiinin tasojen yleistä p50, p65, p52, c-Rel ja RelB. (C) Western blot-analyysiä käytettiin havaitsemaan ydin- p50, p65, p52, c-Rel ja RelB ilmentymisen BGC-823-soluja käsiteltiin IL-17A (50 ng /ml) ilmoitettuina ajankohtina. (D) kvantifiointi proteiinin tasot ydinvoiman p50, p65, p52, c-Rel ja RelB. (E) suhteellinen suhde ydinvoiman yleiseen osa p50, p65, p52, c-Rel ja RelB. Arvot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena. * p
< 0,05, verrattuna kontrolliryhmään.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s003
(TIF) B Kuva S4.
Vaikutukset helenalin ja IL-17A solujen invaasiota ja ilmauksia MMP-2 ja MMP-9 BGC-823 soluja. (A) 1 x 10 6 BGC-823-soluja esikäsiteltiin helenalin (5 uM) ja inkuboitiin sitten läsnä ollessa tai ilman IL-17A (50 ng /ml) 24 tuntia. Cellular invasiivisuus mitattiin Transvvell- invaasiomääritys. (B) Prosentuaalinen invaasio määrä ilmaistiin prosentteina kontrollista. (C, D) proteiini MMP-2 ja MMP-9 havaittiin Western-blottauksella, kun BGC-823 soluja käsiteltiin helenalin ja /tai IL-17A. Arvot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena. * p
< 0,05, verrattuna kontrolliryhmään.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s004
(TIF) B

• PLoS ONE: Altered Expression of Hypoksia-indusoituva Factor-1α (HIF-1α) ja sen säätelygeenit mahasyövän Tissues
• PLoS ONE: Circulating tuumorisoluissa (CTC) Havaita RT-PCR ja sen Prognostiset rooli mahasyövän: Meta-analyysi Julkaistu Literature