PLOS ONE: Interleukin 17A Favorise cancer gastrique envahissant via NF-kB Mediated métalloprotéinases 2 et 9 Expression

Résumé

Interleukin 17A (IL-17A), une cytokine pro-inflammatoire, est impliqué dans la pathologie des maladies inflammatoires et microenvironnement de la tumeur. Le but de cette étude est d'étudier l'effet de l'IL-17A sur l'invasivité du cancer gastrique (GC). Dans cette étude, nous avons découvert que l'IL-17A pourrait favoriser la migration et l'invasion des cellules GC. En outre, après traitement par l'IL-17A, les expressions et les activités de la métalloprotéinase matricielle 2 (MMP-2) et MMP-9 étaient régulés positivement, tandis que l'expression de TIMP-1 et TIMP-2 ont été régulés à la baisse. En outre, les fractions nucléaires /globales de p65 et p50 ont été considérablement élevés par l'IL-17A. Pré-traitement avec hélénaline, facteur-kB (NF-kB), l'inhibiteur nucléaire, a été démontré abolir l'effet promoteur d'IL-17A sur la capacité d'invasion des cellules GC et la régulation positive de la MMP-2 et MMP-9. En conclusion, nos résultats illustrent que l'IL-17A pourrait favoriser l'invasion des cellules GC en activant la voie NF-kB, et la régulation à la hausse par la suite l'expression de MMP-2 et MMP-9. Ces résultats peuvent conduire à l'identification de nouveaux marqueurs de diagnostic et des cibles thérapeutiques de GC

Citation:. Wang Y, Wu H, Wu X, Bian Z, Gao Q (2014) Interleukin 17A Favorise cancer gastrique envahissant via NF -κB Mediated métalloprotéinases 2 et 9 expression. PLoS ONE 9 (6): e96678. doi: 10.1371 /journal.pone.0096678

Editeur: Nikos K. Karamanos, Université de Patras, Grèce

Reçu le 26 Novembre 2013; Accepté le 11 Avril 2014; Publié 6 Juin, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Wang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Le projet a été soutenu par la national science Foundation naturel de la Chine (n ° 81070536) et les fonds scientifiques de la jeunesse de l'Hôpital Central de Taian (2011ZRQNO35). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

Comme l'une des principales causes de décès liés au cancer dans le monde entier, GC est responsable de plus de 700.000 décès par an [1]. Il est le deuxième cancer le plus fréquent et la troisième principale cause de décès chez les patients atteints de cancer en Chine [2]. L'invasion et la métastase puissante capacité de GC est l'un des facteurs importants qui conduisent à un mauvais pronostic [3]. Par conséquent, il est important de découvrir les mécanismes sous-jacents, afin d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques moléculaires qui régulent les capacités d'invasion de cellules de GC, et donc de développer l'avancement des traitements pour GC.

IL-17A est le membre fondateur de l'IL -17 famille qui va de l'IL-17A, IL-17F [4] - [8]. IL-17 membres de la famille jouent un rôle actif dans diverses maladies telles que maladies auto-immunes, les maladies inflammatoires et les maladies malignes. Une inflammation persistante a été considérée comme étant en corrélation avec un risque accru de GC [9]. Les étapes précoces dans la cancérogenèse gastrique impliquent Helicobacter pylori
(H. pylori) conduisant à une gastrite atrophique chronique active et la production de médiateurs pro-inflammatoires [10] - [13], tels que l'IL-1b, TNFa, IFNy, IL-6 et IL-8. Cependant, le rôle de l'IL-17A dans le cancer était incompatible selon les rapports précédents. Certaines preuves ont révélé que IL-17A peut favoriser la croissance tumorale en stimulant l'angiogenèse et de la capacité invasive des cellules tumorales [14]. En revanche, d'autres études ont suggéré que l'IL-17A a montré un effet protecteur contre le développement lymphocytaire chronique leucémique en favorisant la tumeur rejet du système immunitaire à médiation [15]. De plus, IL-17A a augmenté les effets cytotoxiques des cellules NK contre les cellules tumorales en augmentant l'expression des molécules cytotoxiques [16]. Jusqu'à présent, il y a moins de rapport sur le rôle de l'IL-17A dans l'invasion de GC.

Dans la présente étude, nous avons constaté que l'IL-17A pourrait augmenter GC motilité cellulaire par upregulating MMP-2 et MMP -9 via l'activation de facteurs de transcription NF-kB.

Matériel et méthodes

Culture
Cell

lignée cellulaire humaine GC AGS a été acheté auprès de l'ATCC (American type Culture Collection, Manassas, VA) et maintenu dans du milieu DMEM additionné de 10% de sérum fœtal bovin (FBS; Hyclone, Logan, UT), 100 U /l de pénicilline et 100 mg /L de streptomycine. lignées de cellules GC humaines BGC-823 et SGC-7901 ont été obtenus à partir de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine), et cultivées dans un milieu RPMI-1640 contenant 10% de sérum bovin, de la pénicilline (100 U /ml) et de la streptomycine (100 ug /mL). Toutes les cellules ont été cultivées à 37 ° C, 5% de CO _{2 atmosphère d'air.}

Healing Assay

cellules GC plaies ont été cultivées comme des monocouches confluentes dans une plaque de 6 puits et ont été blessés en enlevant une bande de 1 mm de diamètre du puits avec une pointe de pipette quand ils adhèrent à la surface de la plaque. Les monocouches blessés ont ensuite été lavées deux fois avec du PBS pour éliminer les cellules non-adhérentes avant 1 ml de milieu avec ou sans IL-17A (50 ng /mL) (ampli R &; D système, Minneapolis, MN) ont été ajoutés. Après 12 heures d'incubation, les différents groupes de concentration ont été photographiés par micrographies inversées.

In vitro
Invasion Assay

Le in vitro
invasion essai a été réalisé à l'aide le système d'analyse de Matrigel invasion Bio-Coat (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) comme décrit précédemment [17]. Après avoir traité avec ou sans IL-17A (50 ng /ml), des cellules GC ont été ensemencées dans un milieu sans sérum 200 ul et placées dans les cavités supérieures à 2 x 10 ^{5 cellules et le milieu de croissance normal ont été placés dans des chambres en dessous . Vingt-quatre heures plus tard, les cellules sur la surface supérieure de la membrane ont été enlevées avec des tampons de coton, tandis que les cellules sur la face inférieure du filtre ont été fixées, colorées et mesurées. Le pourcentage de la fréquence invasive a été exprimée en pourcentage de contrôle.}

Western blot Analyse

lysats de cellules entières à partir de cellules de GC ont été récoltées avec un tampon de lyse cellulaire. lysats nucléaires à partir de cellules cultivées ont été récoltées avec Extraction des protéines NucBusterTM Kit (Novagen, Allemagne) selon les instructions du fabricant. Des analyses de Western Blot ont été réalisées avec le protocole standard en utilisant des anticorps contre la MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, p52 et β-actine (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), le NF-kB p50, p65 /RelA, c-Rel, RelB et Histone H1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

zymographie

Les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de IL-17A à 37 ° C pendant 24 heures, et des échantillons de milieu conditionné ont été recueillis. Des volumes appropriés des échantillons (ajusté par le nombre de cellules vitales) ont été séparés par 0,1% de gélatine, 8% électrophorèse SDS-PAGE. Après électrophorèse, les gels ont été lavés deux fois dans 2,5% de Triton X-100 à température ambiante pendant 30 minutes, puis incubées dans un tampon de réaction (mM CaCl 10 _{2, 40 mM de Tris-HCl et 0,01% de NaN 3, pH 8,0) à 37 ° C pendant 12 heures. Coomassie bleu brillant R-250 gel tache a ensuite été utilisé pour colorer le gel. Les intensités des bandes sur les gels ont été calculées en utilisant un système d'analyse d'image (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).}

Analyse statistique

Toutes les données ont été exprimées comme moyen ± SD. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, États-Unis) pour évaluer les différences statistiques. Étudiant de t
-test a été utilisé pour les comparaisons entre les deux groupes et d'une manière ou d'une analyse à deux voies de la variance a été utilisée pour analyser les différences statistiques entre les groupes dans des conditions différentes. A p
valeur inférieure à 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Tous les tests statistiques étaient à deux faces.

Résultats

IL-17A Augmente motilité cellulaire dans les cellules du GC

Un essai de zéro à remontage a été réalisée pour déterminer l'effet de l'IL-17A sur la migration dans AGS, BGC-823, et les cellules SGC-7901. L'extension de la migration des cellules a été quantifiée en estimant le pourcentage de la recolonisation de la surface de la plaie après 24 h. Dans le groupe témoin, le mouvement n'a pas été évidente. En présence d'IL-17A, ce mouvement a été considérablement favorisé, après 12 heures d'incubation (figure 1A). Analyse de quantification indique que la différence était significative (figure 1B). En outre, l'essai d'invasion a montré que la capacité invasive d'IL-17A cellules traitées est significativement plus forte que le contrôle des cellules parentales dans toutes les trois lignées cellulaires testées (Figure 1C et 1D). Ces données ont montré que l'IL-17A pourrait améliorer la migration des cellules GC et l'invasivité. En outre, nous avons également observé que l'IL-17A n'a pas d'effet significatif sur la prolifération des BGC-823, SGC-7901 et les cellules AGS (Figure S1), ce qui suggère que l'effet promoteur de l'IL-17A sur la migration et l'invasivité ne sont pas interféré par la cellule prolifération.

effet de l'IL-17A sur la régulation positive de la MMP-2 et MMP-9 et la régulation négative de TIMP-1 et TIMP-2 dans des cellules
GC

Etant donné que la surexpression de MMP peuvent favoriser les métastases cancéreuses [18], [19], nous avons ensuite étudié les effets de l'iL-17A sur MMPs expression dans des lignées de cellules GC. Comme on le voit sur la figure 2 et la figure S2, l'expression de MMP-2 et MMP-9 ont été comparées par Western Blot entre les cellules traitées et non traitées d'IL-17A. Le résultat a montré que la MMP-2 et MMP-9 ont été régulés à la hausse dans TIL17A cellules traitées (AGS et BGC-823) (figure 2A et 2B). Dans le même temps, l'expression de TIMP-1 et TIMP-2 ont été régulés à la baisse (figure 2A et 2B). Zymographie sur gélatine a également été réalisée pour évaluer l'activité de MMP-2 et MMP-9 dans des cellules traitées GC avec ou sans IL-17A. Les résultats ont montré que l'IL-17A augmenté l'activité de MMP-2 et MMP-9 dans des cellules GC (AGS et BGC-823) (figure 2C et 2D). Des résultats similaires ont été observés dans les cellules CGT-7901 (figure S2). Ces résultats suggèrent que l'effet pro-métastase d'IL-17A sur GC pourrait être en régulant l'équilibre MMP /TIMP et nous ont incités à explorer davantage son mécanisme d'action.

IL-17A upregulates MMP-2 et MMP Les expressions 9 Activateur via NF-kB chemin

NF-kB a été rapporté comme une cible en aval de la voie de signalisation de IL-17A dans de nombreuses cellules [17], [20], [21], qui est capable de réguler à la hausse MMP-2 et MMP-9, les expressions [14], [17]. IL-17A a également été rapporté pour augmenter l'expression des MMPs via l'activation de la voie NF-kB dans de nombreuses cellules [14], [17]. Par conséquent, nous avons ensuite vérifié si l'IL-17A régulée positivement MMP-2 et MMP-9 expression dans des cellules GC à travers l'activation de NF-kB. Comme on le voit sur la figure 3, l'expression des sous-unités et la translocation de NF-kB dans le noyau ont été analysées par Western Blot. Nous avons observé que le niveau de p65 et p50 dans le noyau a été considérablement élevée dans les cellules AGS après un traitement d'IL-17A, tandis que le niveau de p65 et p50 ensemble n'a pas changé (figure 3A-D). En outre, la /fraction globale nucléaire de ces molécules a été augmentée lors d'un traitement d'IL-17A (figure 3E). Des résultats similaires ont été observés chez BGC-823 lignée cellulaire (figure S3A-E), ce qui indique que l'IL-17A activation de NF-kB dans des lignées de cellules GC.

En outre, lorsque hélénaline (5 uM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), un inhibiteur de NF-kB, on a ajouté de l'AGS ou BGC-823 cellules moyennes avant le traitement d'IL-17A, les niveaux de MMP-2 et MMP-9 expression ont été significativement réduits (figure 4C-D, Figure S4C-D). Le résultat a démontré que l'IL-17A induit la MMP-2 et MMP-9 expression dans des cellules GC via l'activation de NF-kB. En conséquence, l'IL-17A cellules GC induite invasivité pourrait également été bloquée par hélénaline in vitro
(figure 4A-B, Figure S4A-B). Par conséquent, ces résultats suggèrent que l'IL-17A active voie NF-kB, régule ensuite l'expression de MMP, et affecte ainsi la migration et l'invasivité des cellules GC

Discussion

GC. Est l'un des la plupart des maladies malignes mortelles dans le monde en raison de son taux élevé de récidive après des thérapies curatives [3], [22]. GC est étroitement corrélée avec les maladies inflammatoires chroniques, dans laquelle beaucoup de cytokines inflammatoires infiltrent. IL-17A est une des cytokines pro-inflammatoires importants dans le développement de nombreuses maladies inflammatoires et est fréquemment détectée dans microenvironnement tumoral [23] - [26]. étude précédente a suggéré que les niveaux d'expression de l'IL-17 dans la tumeur pourrait être un indicateur pronostique indépendant chez les patients d'adénocarcinome gastrique [27]. Comparaison des taux de survie entre les patients avec des niveaux élevés et faibles de l'IL-17 a constaté que les patients avec des niveaux élevés d'IL-17 avaient un taux de survie à 5 ans de 47% contre 84% chez les patients ayant un faible niveau [28]. Cependant, les mécanismes moléculaires de cette corrélation, ce qui peut nous aider à mieux comprendre le rôle de l'IL-17 dans le développement et le progrès de GC, restent à élucider.

Dans la présente étude, nous avons constaté que IL- 17A promu l'invasion des cellules du GC. Métastase est l'une des principales causes de décès liés au cancer chez les patients du GC. La dégradation de l'ECM des vaisseaux sanguins ou lymphatiques est critique pour les métastases, car la perte de l'ECM permet aux cellules cancéreuses envahissent le sang ou le système lymphatique et se propage à d'autres tissus et organes [29]. MMP, notamment la MMP-2 et MMP-9, sont responsables de la dégradation de l'ECM [19], [29]. IL-17A a été rapporté pour favoriser l'invasion des cellules cancéreuses par la régulation positive de l'expression de MMP-2 et MMP-9 [17], [26]. Il est généralement admis que les activités de MMP sont inhibées par les TIMP pour empêcher une dégradation de l'ECM [29]. Afin de clarifier le mécanisme d'action de l'IL-17A, nous avons étudié si l'effet promoteur d'IL-17A sur l'invasion des cellules se fait par régulation de l'expression de MMP-2, MMP-9, TIMP-1 et TIMP-2. Nos résultats ont montré que l'IL-17A élevé les expressions et les activités de MMP-2 et MMP-9, et downregulated les expressions de TIMP-1 et TIMP-2, qui a également expliqué que l'IL-17A promu la migration des cellules dans la guérison de zéro de la plaie essai. Par conséquent, l'effet pro-métastase d'IL-17A sur GC pourrait être en régulant l'équilibre MMP /TIMP.

NF-kB a été rapporté comme une cible en aval de l'IL-17A voie de signalisation dans de nombreuses cellules [17] , [20], [21], qui est capable de réguler à la hausse de la MMP-2 et MMP-9, les expressions [14], [17]. IL-17A a également été rapporté pour augmenter l'expression des MMPs via l'activation de la voie NF-kB dans de nombreuses cellules [14], [17]. Donc, nous avons étudié si la surexpression de MMP-2 et MMP-9 induite par l'IL-17A se fait par l'activation de la voie NF-kB. Les résultats ont montré TIL17A promu translocation nucléaire des sous-unités p65 et p50 de cellules GC et par la suite une régulation positive de l'expression de MMP-2 et MMP-9. Cet effet pourrait être efficacement bloqué par des inhibiteurs de NF-kB, ce qui suggère que l'activation de NF-kB est le mécanisme potentiel pour réguler positivement la MMP-2 et MMP-9 par IL-17A.

En conclusion, nos résultats suggèrent IL-17A a été capable de promouvoir la migration et l'invasivité des cellules GC en activant la voie NF-kB, qui ensuite régulée à la hausse l'expression de MMP-2 et MMP-9 et par conséquent la migration et affectée invasivité des cellules GC. Une caractérisation plus poussée de l'effet de l'IL-17A sur l'invasion de GC et des métastases peut conduire à l'identification de nouveaux marqueurs de diagnostic et des cibles thérapeutiques.

Renseignements à l'appui
Figure S1.
L'effet de l'IL-17A sur la prolifération des BGC-823, SGC-7901 et les cellules AGS
doi:. 10.1371 /journal.pone.0096678.s001
(TIF)
Figure S2.
IL-17A favorise l'expression de MMP-2 et MMP-9 et supprime les expressions de TIMP-1 et TIMP-2 dans les cellules SGC-7901. (A) les expressions des MMP dans les cellules CGT-7901 ont été comparés par transfert de western entre les cellules traitées avec ou sans IL-17A (50 ng /ml) pendant 24 h. (B) Quantification des niveaux de MMP-2 et MMP-9 protéines. Les valeurs représentent les moyennes ± écart-type de trois expériences indépendantes réalisées en triple. . * p
< 0,05, comparativement au groupe témoin
doi: 10.1371 /journal.pone.0096678.s002
(TIF)
Figure S3.
IL-17A active NF-kB dans les BGC-823 cellules. (A) L'analyse Western Blot a été utilisée pour détecter p50 dans l'ensemble, p65, p52, c-Rel et RelB expression dans BGC-823 cellules traitées avec IL-17A (50 ng /ml) aux points temporels indiqués. (B) Quantification des niveaux de p50 dans l'ensemble, p65, p52, c-Rel et RelB protéines. (C) Analyse Western Blot a été utilisée pour détecter p50 nucléaire, p65, p52, c-Rel et RelB expression BGC-823 cellules traitées avec IL-17A (50 ng /ml) aux points temporels indiqués. (D) Quantification des niveaux de p50 nucléaire, p65, p52, c-Rel et RelB protéines. (E) Le rapport relatif à la fraction nucléaire globale de p50, p65, p52, c-Rel et RelB. Les valeurs représentent les moyennes ± écart-type de trois expériences indépendantes réalisées en triple. . * p
< 0,05, comparativement au groupe témoin
doi: 10.1371 /journal.pone.0096678.s003
(TIF)
Figure S4.
Effets de hélénaline et IL-17A sur l'invasion des cellules et l'expression de MMP-2 et MMP-9 dans le BGC-823 cellules. (A) 1 × 10 6 BGC-823 cellules ont été prétraitées avec hélénaline (5 uM), puis incubées en présence ou en absence d'IL-17A (50 ng /mL) pendant 24 h. invasivité cellulaire a été mesurée en utilisant l'essai d'invasion Transwell. (B) Le taux d'invasion pour cent a été exprimée en pourcentage de contrôle. Les niveaux de MMP-2 et MMP-9 protéines (C, D) ont été détectés par transfert de Western, lorsque BGC-823 cellules ont été traitées avec hélénaline et /ou IL-17A. Les valeurs représentent les moyennes ± écart-type de trois expériences indépendantes réalisées en triple. * p
< 0,05, comparativement au groupe témoin
doi:. 10.1371 /journal.pone.0096678.s004
(TIF)

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