PLoS ONE: Interleukinas 17A Skatina skrandžio vėžio invazijos per NF-κB tarpininkaujant Matrix metaloproteinazes 2 ir 9 raiškos

Abstraktus

Interleukinas 17A (IL-17A), kaip pro-uždegiminių citokino, dalyvauja patologijos uždegiminių ligų ir naviko mikroaplinka. Šio tyrimo tikslas yra ištirti IL-17A poveikį skrandžio vėžio (GC) invazijos. Tyrime, mes nustatėme, kad IL-17A galėtų skatinti migracijos ir invazija GC ląsteles. Be to, po gydomi IL-17A, su išraiškos ir veiklos matricos metaloproteinazės 2 (MMP-2) ir MMP-9 buvo aktyvinama, tuo tarpu timp-1 ir timp-2 išsireiškimai buvo downregulated. Be to, branduolinės /bendra frakcijas 65 psl ir P50 buvo smarkiai padidėjusi IL-17A. Pirminis su helenalin, branduolinio faktoriaus κB (NF-κB) inhibitorius, buvo įrodyta, kad panaikinti skatinantį poveikį IL-17A ant invazijos gebėjimas GC ląstelių ir ląstelę MMP-2 ir MMP-9. Taigi, mūsų išvados parodė, jog IL-17A galėtų skatinti GC ląstelių invaziją aktyvuojant NF-κB kelią, o vėliau upregulating iš MMP-2 ir MMP-9 raiška. Šie rezultatai gali lemti naujų diagnostinių žymenų ir terapinių tikslų GC identifikavimo

nurodomoji dalis:. Wangas Y Wu O, VU X Bian Z Gao K (2014) Interleukinas 17A Skatina skrandžio vėžio invazijos per NF -κB tarpininkaujant Matrix metaloproteinazes 2 ir 9 išraiška. PLoS ONE 9 (6): e96678. Doi: 10,1371 /journal.pone.0096678

redaktorius: Nikos K. Karamanos universitetas Patras, Graikija

Įstojo: Lapkričio 26, 2013 m Priėmė įnešta 11 balandžio 2014 m Paskelbta: Birželis 6, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Wang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Projektas parėmė Nacionalinis gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr 81.070.536) ir jaunimo mokslo fondų centrinės ligoninės Taian (2011ZRQNO35). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Kaip vieną iš svarbiausių priežasčių vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje, GC yra atsakingas už daugiau nei 700.000 mirčių per metus [1]. Ji yra antra labiausiai paplitusi vėžio ir trečioji pagrindinė mirties priežastis tarp vėžiu sergantiems pacientams Kinijos [2]. Stiprus invazija ir metastazių gebėjimas GC yra vienas iš svarbiausių veiksnių, kurie veda į prastos prognozės [3]. Todėl, svarbu atskleisti pagrindinius mechanizmus, nustatyti naujus molekulinius terapinių tikslų, kurie reguliuoja invazija gebėjimus GC ląstelės, ir taip plėtoti skatinant gydymo GC.

IL-17A yra iš įkūrėjų IL -17 šeimos kuris svyruoja nuo IL-17A, kad IL-17F [4] - [8]. IL-17 šeimos nariai aktyviai vaidmenį įvairių ligų, tokių kaip autoimuninių ligų, uždegiminių ligų, ir piktybinių ligų. Patvarūs uždegimas buvo laikomas susijęs su padidėjusia rizika GC [9]. Ankstyvi žingsniai skrandžio kancerogenezėje įtraukti Helicobacter pylori
(H. pylori) infekcija, lėtiniam aktyviam ir atrofinį gastritas su gamybos prouždegiminių tarpininkų [10] - [13], pavyzdžiui, IL-1B, TNF, IFNγ, IL-6, ir IL-8. Tačiau IL-17A vaidmuo vėžio buvo nesuderinamas pagal ankstesnėse ataskaitose. Kai įrodymai atskleidė, kad IL-17A gali skatinti navikų augimą stimuliuoja angiogenezę ir vėžinių ląstelių [14] invazinių pajėgumus. Priešingai, kiti tyrimai rodo, kad IL-17A parodė apsauginį poveikį prieš lėtinė limfocitų leukemija vystymo skatinant imuninę sistemą, sąlygotas auglys atmetimą [15]. Be to, IL-17A pagerinę citotoksinis poveikis NK ląstelių prieš vėžinių ląstelių plėsti citotoksinių molekulių [16] išraiška. Iki šiol, yra mažiau ataskaita apie IL-17A vaidmenį GC invazijos.

Šiame tyrime mes nustatėme, kad IL-17A gali padidinti GC ląstelių judrumą iki upregulating MMP-2 ir MMP -9 per aktyvuoti NF-κB stenograma veiksnius.

medžiagos ir metodai

Mobilusis kultūra

žmogaus GC ląstelių linija "AGS buvo įsigytas iš ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) ir prižiūrimi DMEM papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS; Hyclone, Logan, UT), 100 V /L penicilino ir 100 mg /l streptomicino. Žmogaus GC ląstelių linijos BGC-823 ir SGC-7901 buvo gauti iš Kinijos mokslų akademijos (Šanchajus, Kinija) ir auginamos RPMI-1640 terpėje, turinčioje 10% galvijų serumo, penicilinui (100 V /ml) ir streptomicino (100 mikrogramų /ml). Visos ląstelės buvo auginamos 37 ° C, 5% CO _{2 oro atmosferos.}

Žaizdų gijimo Analizės

GC ląstelės buvo auginamos kaip monosluoksniai A 6 šulinėlių plokštelės ir buvo sužeisti pašalinant 1 mm juostelę visoje šulinio su pipetės galu, kai jie prisijungusios prie plokštės paviršiaus. tada sužeistiesiems monosluoksnius buvo plaunama du kartus PBS prieš 1 ml terpėje su arba be IL-17A (50 ng /ml) (R & D sistemos, Minneapolis, MN) pašalinti neadhezinę ląsteles buvo pridėta. Po 12 h inkubacijos skirtingų koncentracijų grupės buvo fotografuotas apversto mikrografikus.

in vitro
invazija Analizės

in vitro
invazija analizė atlikta naudojant Bio-Kailis Matrigel invazija tyrimo sistema (Becton Dickinson Franklinas ežerų NJ), kaip aprašyta anksčiau [17]. Po to, kai apdorotas arba be IL-17A (50 ng /ml), GC ląstelės buvo pasėjamos į 200 pL serumo neturinčioje terpėje ir įdedamas į viršutinių kamerose 2 × 10 ^{5 ląstelės ir normalus auginimo terpė buvo dedamas į apačioje kamerose , vėliau dvidešimt keturias valandas, kad ant viršutinio paviršiaus membranos ląstelės buvo pašalintas su medvilnės tamponai, o ląstelės ant dugno pusėje filtro buvo nustatyti, nudažomi ir matuojamas. Invazinių norma procentais buvo išreikštas kontrolės procentais.}

Imunoblotingo analizė

Sveikos ląstelių fragmentai iš GC ląstelių buvo surinktos su ląstelių lizės buferio. Branduoliniai fragmentai iš išaugintų ląstelių buvo surinktos su NucBusterTM Baltymai ekstrakcijos rinkinio (Novagen, Vokietija) pagal gamintojo instrukcijas. Imunoblotingo analizė buvo atlikta su standartiniu protokolu, naudojant antikūnus prieš MMP-2, MMP-9, timp-1, timp-2, P52 ir β-aktino (Mobilusis Signalizacijos Technologijos Beverly, MA), NF-κB-P50, 65 psl /Rela, c-ed, RelB ir Histono H1 (Santa Krusas biotechnologijos, Santa Krusas, Kalifornija).

Zymography

Ląstelės buvo gydomi įvairių koncentracijų IL-17A 37 ° c temperatūroje 24 h, o mėginiuose sąlygoja vidutinio buvo surinkti. Tinkami kiekiai mėginiuose (pakoreguotas pagal gyvybiškai ląstelių skaičius) buvo atskirtas 0,1% želatinos, 8% SDS-PAGE elektroforezė. Po to, kai elektroforezės geliai buvo plaunamos du kartus 2,5% Triton X-100 kambario temperatūroje 30 min, o po to inkubavome reakcijos buferinio tirpalo (10 mM CaCl _{2, 40 mmol Tris-HCl ir 0,01% NaN 3, pH 8,0), esant 37 ° C 12 valandų. tada Coomassie briliantinis mėlynasis R-250 gelis dėmių buvo naudojamas dažyti gelį. Iš juostų gelių intensyvumas buvo apskaičiuotos naudojant vaizdo analizės sistema (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).}

Statistinė analizė

Visi duomenys buvo išreikštas priemonėmis ± SD. Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant SPSS 16.0 programinę įrangą (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) įvertinti statistinius skirtumus. Studento , T
-test buvo naudojamas palyginimams tarp dviejų grupių ir vieną pusę ar dvipusio dispersinė analizė buvo naudojama analizuoti statistinius skirtumus tarp grupių pagal skirtingas sąlygas. P
vertė mažesnė nei 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas. Visi statistiniai testai buvo Dvipusis.

Rezultatai

IL-17A Padidina ląstelių judrumą GC Cells

įbrėžimams žaizdos tyrimas buvo atliktas siekiant nustatyti IL-17A poveikį ant į AGS, bgc-823, ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių migraciją. Visos ląstelės migracijos išplėtimas buvo įvertintas, įvertinant recolonization iš žaizdos paviršiaus procentą po 24 h. Su kontroline grupe, judėjimas nebuvo akivaizdu. Atsižvelgiant į IL-17A buvimą, šis judėjimas buvo žymiai skatinamas po 12 h inkubavimo (1A pav). Kiekybinis įvertinimas analizė parodė, kad skirtumas buvo statistiškai patikimas (1B pav). Be to, invazija tyrimas parodė, kad invazinės gebėjimas IL-17A elgiamasi ląstelės buvo žymiai stipresnis, nei kontroliuoti tėvų ląstelių visų trijų tirtų ląstelių linijas (1c ir 1D pav). Šie duomenys rodo, kad IL-17A galėtų sustiprinti GC ląstelių migraciją ir invaziškumo. Be to, mes taip pat pastebėjo, kad IL-17A neturi reikšmingos įtakos bgc-823, SGC-7901 ir AGS ląstelių (S1 paveiksle) platinimu, o tai rodo, kad skatinant poveikis IL-17A migracijos ir invaziškumo yra nesikišo ląstelių proliferacija.

poveikis IL-17A ant ląstelę MMP-2 ir MMP-9 ir downregulation iš timp-1 ir timp-2 GC Ląstelės

nuo padidėjusią MMP gali skatinti vėžio metastazių [18], [19], mes kitą tyrė IL-17A poveikį MMP raiškos GC ląstelių linijų. Kaip parodyta 2 paveiksle ir S2 paveiksle, MMP-2 ir MMP-9 išraiškos buvo palyginti Imunoblotingo metodu tarp IL-17A apdoroto ir neapdoroto ląstelių. Rezultatai parodė, kad MMP-2 ir MMP-9 buvo aktyvinama į IL-17A paveiktų ląstelių (AGS ir BGC-823) (2a pav ir 2B). Tuo pačiu metu, iš TIMP-1 ir TIMP-2 išraiškos buvo downregulated (2A pav ir 2B). Želatina zymography taip pat buvo atliekama siekiant įvertinti MMP-2 ir MMP-9 veiklą GC ląstelių, gydytų su arba be IL-17A. Rezultatai parodė, kad IL-17A sustiprino MMP-2 ir MMP-9 GC ląstelių (AGS ir bgc-823) (2c ir 2d pav) veiklą. Panašūs rezultatai buvo pastebėta SGC-7901 ląstelių (S2 pav). Šie rezultatai rodo, kad pro-metastazės poveikis IL-17A ant GC gali būti per reguliavimo MMP /timp pusiausvyrą ir paskatino mus toliau nagrinėti jo veikimo mechanizmas.

IL-17A Upregulates MMP-2 ir MMP- 9 išraiškos per aktyvinimas NF-κB kelias

NF-κB buvo pranešta kaip vartotojų taikinį IL-17A signalinio kelio daugelyje ląstelių [17], [20], [21], kuris sugeba upregulate ir MMP-2 MMP-9 išraiškos [14], [17]. Ir IL-17A taip pat buvo pranešė, kad padidinti MMP išraiška per aktyvavimo NF-κB kelią daugelyje ląstelių [14], [17]. Todėl kitą kartą patikrinti, ar IL-17A aktyvinama MMP-2 ir MMP-9 raiškos GC ląstelių per aktyvuoti NF-κB. Kaip parodyta 3 paveiksle, išraiška ir translokacijos NF-κB subvienetai branduolio buvo analizuojami Vakarų blotingo metodu. Mes pastebėjo, kad 65 psl ir P50 branduolyje lygis buvo smarkiai padidėjusi AGS ląstelių po IL-17A gydymo, o bendras 65 psl ir P50 lygis neturi pakeisti (pav 3A-D). Be to, branduolinė /bendra frakcija iš šių molekulių buvo padidintas nuo IL-17A gydymo (3E pav). Panašūs rezultatai buvo pastebėtas BGC-823 ląstelių linijos (pav S3A-E), nurodant, kad IL-17A aktyvuota NF-κB GC ląstelių linijų.

Be to, kai helenalin (5 mkm) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) A NF-κB inhibitorius, buvo įtraukta į AGS arba bgc-823 ląstelių vidutinio iki IL-17A gydymo, ekspresijos lygis MMP-2 ir MMP-9 buvo žymiai sumažėjo (pav 4C-D, pav S4C-D). Rezultatas parodė, kad IL-17A sukeltas MMP-2 ir MMP-9 raiška GC ląstelės per NF-κB aktyvacijos. Taigi, IL-17A sukeltas GC ląstelių invazyvumas taip pat gali būti blokuojami helenalin in vitro
(pav 4A-B S4A-B pav.) Taigi, šie duomenys rodo, kad IL-17A aktyvuoja NF-κB kelią, vėliau reguliuoja MMP ekspresija, ir tokiu būdu paveikia migraciją ir invaziškumo GC ląsteles.

Diskusijos

GC yra vienas iš mirtinų piktybinių ligų pasaulyje dėl savo aukštos recidyvo lygis po gydomųjų terapijų [3], [22]. GC yra glaudžiai susijęs su lėtinėmis uždegiminėmis ligomis, kurioje daug uždegiminių citokinų įsiskverbia. IL-17A yra vienas iš svarbiausių uždegiminių citokinų daugelio uždegiminių ligų vystymuisi ir yra taip pat dažnai aptinkamos naviko mikroaplinkoje [23] - [26]. Ankstesnis tyrimas parodė, kad sąvoka lygiai IL-17 naviko gali būti nepriklausomas prognozinis rodiklis skrandžio adenokarcinoma sirgusių pacientų [27]. Palyginimas išgyvenimo tarp pacientų, sergančių aukšto ir žemo lygio IL-17 nustatė, kad pacientams, sergantiems didelio IL-17 turėjo 5-erių metų išgyvenamumas 47%, palyginti su 84% pacientų, sergančių žemo lygio [28]. Tačiau molekulinius mechanizmus tokio koreliacija, kuri gali padėti mums geriau suprasti IL-17 vaidmens vystymosi ir pažangos GC, dar reikia išsiaiškinti.

Šiame tyrime mes nustatėme, kad IL 17A skatino GC ląstelių invaziją. Metastazės yra viena iš pagrindinių priežasčių, vėžio susijusių mirčių tarp GC pacientams. Degradacija kraujo arba limfagyslių ECM yra labai svarbus metastazių, nes nuostolis ECM leidžia vėžinės ląstelės įsiveržti į kraujo ar limfos sistemą ir išplisti į kitus audinius ir organus [29]. MMPs, ypač MMP-2 ir MMP-9, yra atsakingi už pažeminimą ECM [19], [29]. IL-17A buvo pranešta skatinti vėžinių ląstelių invaziją per upregulating iš MMP-2 ir MMP-9 [17] išraišką [26]. Visuotinai pripažįstama, kad MMP veikla slopina timps užkirsti kelią didelę ECM degradaciją [29]. Paaiškinti veiksmų IL-17A mechanizmą, mes ištirti, ar skatinti poveikis IL-17A dėl ląstelių invazijos yra per reguliavimo iš MMP-2, MMP-9, TIMP-1 ir TIMP-2 raiškos. Mūsų rezultatai parodė, kad IL-17A padidėjusi išraiškas ir veiklą MMP-2 ir MMP-9 ir downregulated su timp-1 ir timp-2 išraiškas, kurios taip pat paaiškino, kad IL-17A skatinamas ląstelių migraciją į įbrėžimams žaizdų gijimą tyrimas. Todėl, pro-metastazės poveikis IL-17A ant GC gali būti per reguliavimo MMP /timp pusiausvyrą.

NF-κB buvo pranešta kaip vartotojų taikinį IL-17A signalinio kelio daugelyje ląstelių [17] , [20], [21], kuris gali upregulate MMP-2 ir MMP-9 išraiškos [14], [17]. Ir IL-17A taip pat buvo pranešė, kad padidinti MMP išraiška per aktyvavimo NF-κB kelią daugelyje ląstelių [14], [17]. Todėl mes ištirti, ar MMP-2 ir MMP-9, sukeltos IL-17A ląstelę yra per aktyvavimo NF-κB kelią. Rezultatai parodė, IL-17A skatinamas branduolinės perkėlimas iš 65 psl ir P50 subvienetų GC ląstelių ir vėliau aktyvinama apie MMP-2 ir MMP-9 raiška. Šis poveikis gali būti efektyviai blokavo NF-κB inhibitorius, tai rodo, kad NF-κB aktyvinimas yra potencialus mechanizmas upregulate MMP-2 ir MMP-9 IL-17A.

Taigi, mūsų rezultatai parodė, kad IL-17A galėjo skatinti migracijos ir invaziškumo GC ląstelių aktyvinimo NF-κB kelią, kuris vėliau aktyvinama su MMP-2 ir MMP-9 raiškos ir taip paveikti migracijos ir invaziškumo GC ląsteles. Daugiau apibūdinimas IL-17A poveikio GC invazija ir metastazių gali atsirasti naujų diagnostinių žymenų ir terapinių tikslų nustatymo.

Parama Informacija
pav S1. Viesbutis The IL-17A įtaka bgc-823, SGC-7901 ir AGS ląstelės
doi platinimu. 10,1371 /journal.pone.0096678.s001
(TIF) pervežimas S2 pav.
IL-17A skatina MMP-2 ir MMP-9 raiškos ir slopina timp-1 ir timp-2 išraiškas SGC-7901 ląstelių. (A) išraiškos MMP į SGC-7901 ląstelių buvo lyginamos pagal Imunoblotingo tarp ląstelių gydomi bei be IL-17A (50 ng /ml) 24 h. (B) kiekybinis baltymų lygių MMP-2 ir MMP-9. Vertybės atstovauti priemones ± SD trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų tris kartus. . * P
< 0,05, palyginti su kontroline grupe
Doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s002
(TIF)
S3 pav.
IL-17A aktyvuoja NF-κB į BGC-823 ląstelių. (A), imunoblotingu analizė buvo naudojama, siekiant nustatyti bendrą P50, 65 psl, 52 psl, C-Rel ir RelB išraišką bgc-823 ląstelių gydomiems IL-17A (50 ng /ml) nurodytu laiku kiekis. (B), kiekybinis baltymų lygių bendrą P50, 65 psl, 52 psl, C-Rel ir RelB. (C) imunoblotingu analizė buvo naudojama, siekiant nustatyti branduolinių P50, 65 psl, 52 psl, C-ed ir RelB išraiška bgc-823 ląstelių gydomiems IL-17A (50 ng /ml) nurodytu laiku kiekis. (D), kiekybinis baltymų lygio branduolinės P50, 65 psl, 52 psl, C-Rel ir RelB. (E), santykinė santykis branduolinio į bendrą frakciją P50, 65 psl, 52 psl, C-Rel ir RelB. Vertybės atstovauti priemones ± SD trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų tris kartus. . * P
< 0,05, palyginti su kontroline grupe
Doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s003
(TIF)
S4 pav.
poveikis helenalin ir IL-17A mobiliųjų invazijos ir MMP-2 ir MMP-9 raiška BGC-823 ląstelių. (A) 1 × 10 6 BGC-823 ląstelės buvo iš anksto apdoroti helenalin (5 mikronų) ir tada buvo inkubuojama su buvimo ar nebuvimo IL-17A (50 ng /ml) 24 h. Mobilieji invazyvumas buvo matuojamas naudojant transwell invazija tyrimą. (B) proc invazija norma buvo išreikšta kaip kontrolės procentais. (C, D) baltymo koncentracija MMP-2 ir MMP-9 buvo aptikta Imunoblotingo, kai BGC-823 ląstelės buvo gydomi helenalin ir /arba IL-17A. Vertybės atstovauti priemones ± SD trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų tris kartus. * P
< 0,05, palyginti su kontroline grupe
Doi.: /Journal.pone.0096678.s004
(TIF)
10,1371

• PLoS ONE: Altered išraiška hipoksijos indukuojamąją faktorius 1α (HIF-1α) ir jos reguliavimo genų skrandžio vėžys Tissues
• PLoS One: Cirkuliacinis vėžinių ląstelių (CTCs) aptiktas RT-PGR ir jos prognostinio vaidmuo skrandžio vėžys: meta-analizė Paskelbta Literature