Финансирование:. Проект была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (№ 81070536) и молодежных научных фондов Центрального госпиталя Тайане (2011ZRQNO35). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение материалы и методы Культура клеток Вестерн блот анализ зимографии IL-17A Увеличивает подвижность клеток в GC клетки Влияние IL-17A на повышающую регуляцию ММР-2 и ММР-9 и понижающей ТИМП-1 и TIMP-2 в GC клетки Кроме того, когда helenalin (5 мкм) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), ингибитор NF-kB, был добавлен к АГС или BGC-823 клеток среду перед обработкой IL-17A, уровни экспрессии ММР-2 и ММР-9 были значительно уменьшились (рис 4C-D, рис S4C-D). Результат показал, что IL-17A индуцированную экспрессию ММР-2 и ММР-9 в GC клетки посредством активации NF-kB. Соответственно, IL-17A индуцированное GC клеток инвазивность может также был заблокирован helenalin в пробирке Обсуждение
<р> в качестве одной из главных причин рака, связанных смерти во всем мире, GC несет ответственность за более чем 700 000 смертей в год [1]. Это является вторым наиболее распространенным видом рака и третьей ведущей причиной смерти среди больных раком в Китае [2]. Мощное инвазии и метастазирования способность GC является одним из важных факторов, которые приводят к плохим прогнозом [3]. Поэтому, важно, чтобы раскрыть основные механизмы, чтобы идентифицировать новые молекулярные терапевтические мишени, которые регулируют вторжения способности GC клетки, и, таким образом, развивать продвижения обработки для GC.
<Р> IL-17A является членом-основателем IL -17 семья, которая колеблется от IL-17A к IL-17F [4] - [8]. IL-17 членов семьи играют активную роль в различных заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, и злокачественных заболеваний. Стойкие воспаление было рассмотрено, коррелирует с повышенным риском GC [9]. Ранние этапы рака желудка связаны с хеликобактерной
(H.) инфекция ведет к хронической активной и атрофический гастрит с продукцией провоспалительных медиаторов [10] - [13], такие как IL-1b, TNF-alpha, IFN, ИЛ-6 и ИЛ-8. Тем не менее, роль IL-17A при раке был непоследователен в соответствии с предыдущими докладами. Некоторые данные показали, что IL-17A может способствовать росту опухоли, стимулируя ангиогенез и инвазивный потенциал опухолевых клеток [14]. В противоположность этому, другие исследования показали, что IL-17A продемонстрировали защитный эффект против развития хронического лимфолейкоза, продвигая отторжение иммунной системы опосредованной опухоли [15]. Кроме того, IL-17A усиливается цитотоксическое действие NK-клеток против опухолевых клеток путем увеличения экспрессии цитотоксических молекул [16]. До сих пор, есть меньше доклад о роли IL-17A во вторжении в GC.
<Р> В настоящем исследовании мы обнаружили, что IL-17A может увеличить подвижность клеток GC с помощью повышающей регуляции ММР-2 и ММР -9 посредством активации NF-kB факторы транскриптов.
<р> клеточная линия человеческого GC AGS был приобретен у АТСС (American Type Culture Collection, Manassas, VA), и поддерживали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS; Hyclone, Logan, UT), 100 ед /л пенициллина и 100 мг /л стрептомицина. Линии GC клеток человека КУП-823 и SGC-7901 были получены из Китайской академии наук (Шанхай, Китай), и культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% бычьей сыворотки, пенициллин (100 ед /мл) и стрептомицина (100 мкг /мл). Все клетки культивировали при 37 ° C, 5% CO <югу> 2 воздушной атмосферы.
Заживление ран Анализ
<р> GC клетки культивировали в качестве сливных монослоев в 6-луночного планшета и получили ранения путем удаления 1 мм полосу через колодец с наконечником пипетки, когда они приклеивают к поверхности пластины. Раненые монослои затем дважды промывали PBS для удаления не прилипшие клетки до 1 мл среды с добавлением или без IL-17A (50 нг /мл) (R &Amp; D System, Minneapolis, MN) были добавлены. После 12 ч инкубации, различные группы концентрации были сфотографированы перевернутых микрофотографии.
В пробирке
Invasion Анализ
<р> в пробирке
нашествие анализ проводили с использованием Био-Coat Матригель система нашествие анализа (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), как описано ранее [17]. После обработки или без IL-17A (50 нг /мл), GC-клетки высевают в 200 мкл бессывороточной среды и помещают в верхние камеры при 2 × 10 5 клеток и нормальных ростовую среду были помещены в под ним камерами , Через двадцать четыре часа спустя, клетки на верхней поверхности мембраны были удалены с ватные тампоны, в то время как клетки на нижней стороне фильтра, фиксировали, окрашивали и измеряли. Высказывалось процент инвазивного скорости в процентах от контроля.
<р> лизаты целых клеток из GC клетки собирали с помощью буфера для лизиса клеток. Ядерные лизаты из культивируемых клеток собирали с NucBusterTM белка Extraction Kit (Novagen, Германия) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вестерн-блоттинга анализа проводили с помощью стандартного протокола с использованием антител против ММР-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, р52 и β-актин (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), NF-kB-р50, р65 /RelA, C-Rel, RelB и гистона H1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
<р> Клетки обрабатывали различными концентрациями IL-17A при 37 ° C в течение 24 ч, а также образцы кондиционированной среды были собраны. Соответствующие объемы образцов (скорректированные витальным количество клеток) были разделены на 0,1% желатином 8% электрофореза в SDS-PAGE. После электрофореза гели дважды промывали в 2,5% Тритон Х-100 при комнатной температуре в течение 30 мин, а затем инкубируют в реакционном буфере (10 мМ CaCl <суб> 2, 40 мМ Трис-HCl и 0,01% NaN <суб> 3, рН 8,0) при 37 ° С в течение 12 часов. Кумасси бриллиантовый синий гель пятно R-250, затем использовали для окрашивания геля. Интенсивность полос на гелях были рассчитаны с использованием системы анализа изображений (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).
Статистический анализ
<р> Все данные были выражены как среднее значение ± SD. Статистический анализ был проведен с использованием программного обеспечения SPSS 16.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США) для оценки статистических различий. Студенческая т
-test использовали для сравнения между двумя группами и односторонним или двухсторонним дисперсионный анализ был использован для анализа статистических различий между группами в различных условиях. A значение р меньше 0,05
считалось статистически значимым. Все статистические тесты были двусторонними.
Результаты
<р> Царапина-намотана анализ проводили для определения эффекта IL-17A о миграции в AGS, КУП-823 и SGC-7901 клеток. Расширение миграции клеток количественно оценивали путем оценки процентного содержания реколонизации раневой поверхности после того, как 24 ч. В контрольной группе, движение не было очевидным. В присутствии IL-17A, это движение было значительно повышен после 12 ч инкубации (фиг.1А). Анализ Количественный анализ показал, что разница была значительной (Фигура 1В). Кроме того, анализ показал, что вторжение инвазивная способность IL-17A обработанных клетках был значительно сильнее, чем контроль родительских клеток во всех трех испытанных клеточных линий (рис 1C и 1D). Эти данные показали, что IL-17A может усилить миграцию клеток ГХ и инвазивности. Кроме того, мы также наблюдали, что IL-17A не оказывает существенного влияния на пролиферацию BGC-823, СГК-7901, и клетки AGS (рис S1), предполагая, что активирующий эффект IL-17A на миграцию и инвазивность не препятствовала клетки пролиферации.
<р> Так как избыточная экспрессия ММР может способствовать метастазирования рака [18], [19], мы в следующий раз исследовали влияние IL-17A на экспрессию ММР в линиях GC клеток. Как показано на рисунках 2 и S2, выражения ММР-2 и ММР-9 сравнивали с использованием Вестерн-блоттинга между IL-17A обработанных и необработанных клеток. Результат показал, что ММР-2 и ММР-9 были повышающей регуляции в IL-17A обработанных клеток (AGS и BGC-823) (рис 2А и 2В). В то же время, выражения TIMP-1 и TIMP-2 были подавляются (рис 2А и 2В). Желатин зимографии также была проведена с целью оценки активности ММР-2 и ММР-9 в GC клетках, обработанных или без IL-17A. Результаты показали, что IL-17A усиливает активность ММР-2 и ММР-9 в GC клетки (AGS и BGC-823) (рис 2С и 2D). Аналогичные результаты наблюдались в СГК-7901 клеток (рис S2). Эти результаты свидетельствуют о том, что про-метастаз эффект IL-17A на GC может быть за счет регулирования MMP /TIMP баланс и побудило нас дополнительно изучить механизм его действия.
IL-17A активирует ММР-2 и MMP- 9 Выражения через Активация NF-kB Тропинка
<р> NF-kB было сообщено как нижестоящий мишень IL-17A сигнального пути во многих клетках [17], [20], [21], который способен апрегулируются ММР-2 и ММР-9 выражения [14], [17]. И IL-17A также сообщается увеличивает экспрессию ММР с помощью активации NF-кВ путь во многих клетках [14], [17]. Таким образом, мы в следующий раз проверили ли повышающей регуляции IL-17A ММР-2 и ММР-9 выражений в GC-клеток посредством активации NF-kB. Как показано на рисунке 3, экспрессия и транслокации NF-kB субъединицы в ядре анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Мы наблюдали, что уровень р65 и р50 в ядрах резко повышается в AGS клетках после лечения IL-17A, в то время как уровень общего p65 и p50 не имеет каких-либо изменений (Рисунок 3A-D). Кроме того, ядерная /общая доля этих молекул была увеличена при обработке IL-17A (рис 3Е). Аналогичные результаты наблюдались в клеточной линии КУП-823 (рис S3A-E), показывая, что IL-17A активированный NF-kB в линиях GC клеток.
(Рисунок 4A-B, рис S4A-B). Таким образом, эти результаты показывают, что IL-17A активирует NF-кВ путь, затем регулирует экспрессию ММР, и тем самым влияет на миграцию и инвазивность GC клеток
<р> GC. Является одним из большинство смертельных злокачественных заболеваний в мире из-за своей высокой частотой рецидивов после лечебных терапии [3], [22]. ГК тесно коррелировало с хроническими воспалительными заболеваниями, в которых большое количество воспалительных цитокинов просочиться. IL-17A является одним из важных воспалительных цитокинов в развитии многих воспалительных заболеваний, а также часто обнаруживается в опухолевой микросреде [23] - [26]. Предыдущее исследование показало, что уровни экспрессии IL-17 в опухоли может быть независимым прогностическим индикатором при аденокарциномы желудка у пациентов [27]. Сравнение показателей выживаемости между пациентами с высоким и низким уровнем IL-17 показало, что пациенты с высоким уровнем IL-17 имел 5-летняя выживаемость на 47% по сравнению с 84% у пациентов с низким уровнем [28]. Однако молекулярные механизмы такой корреляции, которые могут помочь нам лучше понять роль IL-17 в развитии и прогрессе GC, еще предстоит выяснить.
<Р> В настоящем исследовании мы обнаружили, что IL- 17А способствовало вторжение в GC клетки. Метастазы является одной из основных причин рака, связанных смерти среди пациентов с GC. Деградация ECM крови или лимфатических сосудов имеет решающее значение для метастазирования, так как потеря ECM позволяет раковым клеткам проникать в кровь или лимфатическую систему и распространяются на другие органы и ткани [29]. ММР, особенно ММР-2 и ММР-9, отвечают за разложение ЕСМ [19], [29]. IL-17A было сообщено содействовать инвазии раковых клеток с помощью повышающей регуляции экспрессии ММР-2 и ММР-9 [17], [26]. Принято считать, что ММР деятельность тормозится TIMPs для предотвращения деградации ECM обширной [29]. Для выяснения механизма действия IL-17A, мы исследовали, может ли активирующий эффект IL-17A на инвазии клеток через регуляцию выражений ММР-2, ММР-9, TIMP-1 и TIMP-2. Наши результаты показали, что IL-17A повышенные выражения и деятельность ММР-2 и ММР-9, и подавляются выражения ТИМП-1 и ТИМП-2, который также пояснил, что IL-17A способствует миграции клеток в заживлении царапина раны анализ. Таким образом, про-метастаз эффект IL-17A на GC может быть за счет регулирования MMP /TIMP баланс.
<Р> NF-kB было сообщено как нижестоящий мишень IL-17A сигнального пути во многих клетках [17] , [20], [21], который способен апрегулируются ММР-2 и ММР-9 выражений [14], [17]. И IL-17A также сообщается увеличивает экспрессию ММР с помощью активации NF-кВ путь во многих клетках [14], [17]. Таким образом, мы исследовали, может ли это усиление активности ММР-2 и ММР-9, индуцированного IL-17A посредством активации NF-кВ путь. Результаты показали, IL-17A способствовало ядерную транслокацию р65 и р50 субъединицы GC клеток и впоследствии повышающей регуляции экспрессии ММР-2 и ММР-9. Этот эффект может быть эффективно заблокирован ингибитором NF-kB, предполагая, что активация NF-kB является потенциальным механизмом для апрегулируются ММР-2 и ММР-9 с помощью IL-17A
<р> В заключение., Наши результаты свидетельствуют о что IL-17A смог способствовать миграции и инвазивности GC клеток путем активации NF-kB путь, который впоследствии активируемых выражения ММР-2 и ММР-9 и, таким образом, пострадавших миграции и инвазивности GC клеток. Дальнейшая характеристика влияния IL-17A на инвазии и метастазирования GC может привести к идентификации новых диагностических маркеров и терапевтических целей.
Поддержка информации Рисунок S1
.
Влияние IL-17A на пролиферацию BGC-823, SGC-7901 и AGS клетки
DOI: 10.1371. /journal.pone.0096678.s001
(TIF) Рисунок S2
.
IL-17A способствует выразительности ММР-2 и ММР-9 и подавляет проявления TIMP-1 и TIMP-2 в СГК-7901 клеток. (A) Выражения ММР в СГК-7901 клеток сравнивали с помощью вестерн-блоттинга между клетками, обработанными и без IL-17A (50 нг /мл) в течение 24 ч. (В) Количественное определение уровней белка ММР-2 и ММР-9. Значения представляют собой средние значения ± SD трех независимых экспериментов, выполненных в трех экземплярах. . * р
&л; 0,05, по сравнению с контрольной группой
DOI: 10.1371 /journal.pone.0096678.s002
(TIF)
Рисунок S3.
IL-17A активирует NF-kB в клетках BGC-823. (А) Вестерн-блот анализ был использован для выявления общей p50, p65, p52, C-Rel и экспрессию RelB в BGC-823 клетках, обработанных IL-17A (50 нг /мл) в указанные моменты времени. (B) Количественная уровней протеина общей p50, p65, p52, C-Rel и RelB. (С) Вестерн-блот анализ был использован для обнаружения ядерного p50, p65, p52, C-Rel экспрессии и RelB в BGC-823 клетках, обработанных IL-17A (50 нг /мл) в указанные моменты времени. (D) Количественная уровней белка p50 ядерного, p65, p52, C-Rel и RelB. (Е) Относительное отношение к ядерному общей фракции p50, p65, p52, C-Rel и RelB. Значения представляют собой средние значения ± SD трех независимых экспериментов, выполненных в трех экземплярах. . * р
&л; 0,05, по сравнению с контрольной группой
DOI: 10.1371 /journal.pone.0096678.s003
(TIF)
Рисунок S4.
Эффекты helenalin и IL-17A инвазии клеток и выражений ММР-2 и ММР-9 в клетках КУП-823. (А) 1 × 10 6 КУП-823 клетки предварительно обрабатывают с helenalin (5 мкМ), а затем инкубировали в присутствии или в отсутствие IL-17A (50 нг /мл) в течение 24 ч. Клеточная инвазивность измеряли с помощью анализа Transwell вторжения. Было выражено (В) Скорость инвазия процентов в процентах от контроля. (С, D) Уровни белка ММР-2 и ММР-9 были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга, когда клетки КУП-823 были обработаны с helenalin и /или IL-17A. Значения представляют собой средние значения ± SD трех независимых экспериментов, выполненных в трех экземплярах. * р
&л; 0,05, по сравнению с контрольной группой
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0096678.s004
(TIF)
Ингибиторы GSK-3 перспективны при лечении коронавирусных инфекций
Крупное исследование показало, что вирусная нагрузка SARS-CoV-2 самая низкая у детей
Дети имеют иммунитет к SARS-CoV-2
Ученые разрабатывают пептиды, которые восстанавливают баланс кишечных бактерий и предотвращают атеросклероз.
Анализ крови на микробную ДНК может предупредить о раке
Будут ли диеты на основе ДНК и персонализированные лечебные продукты - будущее для похудения?
Исследования показывают, что пробиотики помогают бороться с тревогой и депрессией.
Предыдущие исследования связали проблемы психического здоровья и нарушения развития со здоровьем кишечника. Теперь, группа британских ученых показала, что продукты, расширяющие профиль полезных бактер
Будут ли диеты на основе ДНК и персонализированные лечебные продукты - будущее для похудения?
Большинство людей знают, что гены унаследованы от родителей и что ДНК этих родителей объединяются, чтобы создать уникальный генетический состав человека. Это определяет такие аспекты фенотипа, как цве
Исследования показывают, что заражение кишечными паразитами снижает тяжесть COVID-19
Каждый день мы узнаем больше о болезни COVID-19. Взрослые любого возраста с определенными основными заболеваниями подвержены повышенному риску тяжелого заболевания, вызванного вирусом, вызывающим COVI