Plos ONE: Interlevkin 17A Spodbuja Rak želodca invazivnost preko NF-κB posredovana Matrix metaloproteinaz 2 in 9 Expression

Povzetek

interlevkin 17A (IL-17A), kot pro-vnetnih citokinov, ki je vključen v patologiji vnetnih bolezni in tumorskega mikrookolja. Cilj te raziskave je raziskati vpliv IL-17A o invazivnosti raka želodca (GC). V raziskavi smo ugotovili, da lahko IL-17A spodbujajo migracije in invazije GC celic. Poleg tega, ko obdelamo z IL-17A, izrazi in aktivnosti matrične metaloproteinaze 2 smo molekul (MMP-2) in MMP-9, medtem ko so navzdol reguliranih z izrazi TIMP-1 in TIMP-2. Poleg tega so bili jedrske /celotne frakcije p65 in P50 dramatično povišane IL-17A. Predobdelava z helenalin, faktorja-κB (NF-κB) zaviralca jedrskega, je bilo dokazano, da odpravijo spodbuja učinek IL-17A na invazijo sposobnosti GC celic in uravnavanjem MMP-2 in MMP-9. Skratka, naši rezultati pokazali, da bi lahko IL-17A spodbujanje vdor GC celic z aktivacijo NF-κB poti in nato navzgornje regulacije izražanja MMP-2 in MMP-9. Ti rezultati lahko privede do identifikacije novih diagnostičnih označevalcev in terapevtskih ciljev GC

Navedba. Wang Y, Wu H, Wu X, Bian Z, Gao Q (2014) interlevkin 17A Spodbuja Rak želodca invazivnost preko NF -κB posredovana Matrix metaloproteinaz 2 in 9 Expression. PLoS ONE 9 (6): e96678. doi: 10,1371 /journal.pone.0096678

Urednik: Nikos K. Karamanos, Univerza v Patrasu, Grčija

Prejeto: 26. november 2013; Sprejeto: 11. april 2014; Objavljeno: 6. junij 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Projekt je bila podprta z National Natural Science Foundation Kitajske (št 81070536) in mladinskih znanstvenih skladov The Central Hospital Taian (2011ZRQNO35). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Kot eden izmed vodilnih vzrokov smrti, povezanih z rakom po celem svetu, GC je odgovorna za več kot 700.000 smrti na leto [1]. Je drugi najpogostejši rak in tretji vodilni vzrok smrti med bolniki z rakom iz Kitajske [2]. Učinkovita invazija in metastaza sposobnost GC je eden od pomembnih faktorjev, ki vodijo do slabo prognozo [3]. Zato je pomembno odkriti temeljne mehanizme, da prepoznajo nove molekularne terapevtske cilje, ki urejajo invazijo sposobnosti GC celice, in s tem za razvoj napreduje zdravljenja za GC.

IL-17A je ustanovni član IL -17 družina, ki sega od IL-17A na IL-17F [4] - [8]. IL-17 družinski člani igrajo aktivno vlogo v različnih bolezni, kot so avtoimunske bolezni, vnetnih bolezni in malignih bolezni. Obstojne vnetje se šteje, da se povezana s povečanim tveganjem za GC [9]. Zgodnji koraki v želodcu rakotvornost vključujejo Helicobacter pylori
(H. pylori) okužba privede do kroničnega aktivnega in atrofični gastritis z proizvodnjo vnetnih mediatorjev [10] - [13], kot so IL-1b, TNFa, IFNy, IL-6 in IL-8. Vendar pa je bila vloga IL-17A pri raku neskladju po prejšnjih poročilih. Nekateri dokazi kažejo, da bi IL-17A spodbuja rast tumorja s spodbujanjem angiogenezo in invazivno sposobnost tumorskih celic [14]. V nasprotju s tem pa druge študije kažejo, da IL-17A pokazala zaščitni učinek proti kronično limfocitno levkemijo razvoja s spodbujanjem imunskega zavračanja tumorja sistemsko posredovano [15]. Poleg tega IL-17A okrepljena z citotoksične učinke NK celic proti tumorskih celic, povečuje ekspresije citotoksičnih molekul [16]. Do sedaj, je manj poročilo o vlogi IL-17A v invaziji na GC.

V tej raziskavi smo ugotovili, da bi lahko IL-17A povečanje GC celic gibljivost ga navzgornje regulacije MMP-2 in MMP -9 z aktivacijo NF-κB transkriptov dejavnikov.

materiali in metode

Cell Culture

celična linija Human GC AGS je bila kupljena iz ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) in jo vzdržujemo v DMEM dopolni z 10% fetalnega govejega seruma (FBS; Hycolne-a, Logan, UT), 100 U /L penicilina in 100 mg /L streptomicin. Človeški GC celične linije BGC-823 in SGC-7901 so bili pridobljeni s kitajske akademije znanosti (Shanghai, Kitajska) in kultivirali v RPMI-1640 medij vsebuje 10% govejega seruma, penicilin (100 U /ml) in streptomicin (100 g /ml). Vse celice smo gojili pri 37 ° C, 5% CO _{2 zračni atmosferi.}

celjenje ran Vsebnost

GC celice smo gojili kot Strnjena plast v 6 vdolbinicami in ranjenih z odstranjevanjem 1 mm trak po vsej jamico s pipeto ko prilepi na površino plošče. Je ranjenih plast smo nato dvakrat sprali s PBS, da odstranimo brez prilepljenih celic pred 1 ml mediju z ali brez IL-17A (50 ng /ml) (R &D System, Minneapolis, MN) dodamo. Po 12 h inkubacije, so bile različne skupine koncentracij fotografirali obrnjenih posnetki.

In vitro
Invasion Vsebnost

in vitro
invazija test je bil izveden s pomočjo Bio-coat Študiie sistem invazija test (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), kot je opisano predhodno [17]. Po obdelamo z ali brez IL-17A (50 ng /ml), smo GC celice zasejali v 200 ul mediju brez seruma in damo v zgornjem komorah 2 x 10 ^{5 celicah in običajna gojišče damo v pod njim komorah . Štiriindvajset ur kasneje smo celice na zgornji površini membrane odstranimo z bombažnimi blazinicami, medtem ko smo celice na spodnji strani filtra fiksna, obarvajo in izmeriti. Odstotek invazivnih tečaja je bila izražena kot odstotek nadzora.}

Western blot analiza

Cela lizati celic iz GC celice požanjemo s celično lizo buffer. Jedrske lizati iz gojenih celic požanjemo s NucBusterTM Protein Extraction Kit (Novagen, Nemčija), v skladu z navodili proizvajalca. Western blot analize so bile izvedene s standardnim protokolom z uporabo protiteles proti MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, P52 in β-aktin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), NF-κB-P50, p65 /rela, c-Rel, RelB in histon H1 (santa Cruz Biotechnology, santa Cruz, CA).

cimografijo

Celice smo obdelali z različnimi koncentracijami IL-17A pri 37 ° c 24 h in vzorcev kondicioniranega medija zberemo. Ustrezne količine vzorcev (nastavljiv po številu vitalnih celic) so ločeni z 0,1% želatina-8% SDS-PAGE elektroforeza. Po elektroforezi so bili geli dvakrat speremo v 2,5% Triton X-100 pri sobni temperaturi 30 minut in nato inkubiramo v reakcijskem pufru (10 mM CaCl _{2, 40 mM Tris-HCl in 0,01% NaN 3, pH 8,0) pri 37 ° C 12 ur. Coomassie briljantno modro R-250 gel madež je bil nato uporabljen za madež gel. Intenzivnost pasov na geli so bili izračunani s pomočjo sistema za analizo slike (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).}

Statistična analiza

Vsi podatki so bili izraženi kot sredstvo ± SD. Statistična analiza je bila izvedena s pomočjo programa SPSS 16,0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, ZDA) za oceno statistične razlike. Študent je t
-test smo uporabili za primerjavo med obema skupinama in enosmerno ali dvosmerno analizo variance smo uporabili za analizo statističnih razlik med skupinami v različnih razmerah. A p
vrednost manj kot 0,05 je štela kot statistično značilna. Vsi statistični testi so bili dvostranski.

Rezultati

IL-17A Poveča Cell gibljivost v GC celice

je A-scratch rane test izvaja za določitev učinka IL-17A o migraciji v letnem pregledu rasti, BGC-823, in SGC-7901 celic. Razširitev migracije celic smo kvantificirali z ocenjevanjem odstotek recolonization na površini rane po 24 urah. V kontrolni skupini je gibanje ni bilo očitno. V prisotnosti IL-17A, je to gibanje bistveno napredoval po 12 urah po inkubacijski (slika 1A). Analiza kvantifikacija je pokazala, da je razlika znatna (slika 1B). Poleg tega je vdor test je pokazal, da invazivne sposobnost IL-17A zdravijo celice je bila bistveno močnejša kot nadzor starševske celice v vseh treh testiranih celičnih linij (slika 1C in 1D). Ti podatki so pokazali, da se lahko IL-17A povečati migracijo GC celic in invazivnosti. Poleg tega smo tudi ugotovili, da je IL-17A nima pomembnega vpliva na širjenje BGC-823, SGC-7901 in AGS celic (Slika S1), kar kaže, da se spodbuja učinek IL-17A na področju migracij in invazivnosti, ne moti ga celica proliferacije.

Učinek IL-17A na uravnavanjem MMP-2 in MMP-9 in downregulation od TIMP-1 in TIMP-2 v GC Celice

Ker prekomerno MMP lahko spodbujajo rakavih metastaz [18], [19], smo naslednji raziskovali učinek IL-17A na MMP izražanja v celičnih linijah GC. Kot je prikazano na sliki 2 in sliki S2, so izrazi MMP-2 in MMP-9 v primerjavi z uporabo Western blot med IL-17A obdelanih in neobdelanih celic. Rezultat je pokazala, da so bili MMP-2 in MMP-9 povečana pri IL-17A obdelane celice (AGS in BGC-823) (slika 2A in 2B). Hkrati so bili izrazi TIMP-1 in TIMP-2 navzdol reguliranih (slika 2A in 2B). Želatina cimografijo smo izvedli tudi ocenili aktivnost MMP-2 in MMP-9 v GC celicah obdelanih z ali brez IL-17A. Rezultati so pokazali, da je IL-17A izboljšano aktivnost MMP-2 in MMP-9 v GC celicah (AGS in BGC-823) (slika 2C in 2D). Podobne rezultate so opazili pri SGC-7901 celic (Slika S2). Ti rezultati kažejo, da je lahko pro-metastaze učinek IL-17A na GC z regulacijo MMP /TIMP ravnovesje in nas pozove, da nadalje razišče svoj mehanizem delovanja.

IL-17A Upregulates MMP-2 in MMP- 9 Izrazi preko Aktiviranje NF-κB Pathway

NF-κB je bila prijavljena kot cilj nadaljnji IL-17A signalne poti v mnogih celic [17] [20] [21], ki je sposoben upregulate MMP-2 in MMP-9 izrazi [14], [17]. In IL-17A so poročali tudi povečanje ekspresije MMP preko aktiviranja NF-κB poti v številnih celicah [14], [17]. Zato bomo naslednjič preverili, ali je IL-17A molekul MMP-2 in MMP-9 izrazov v GC celic skozi aktiviranje NF-κB. Kot je prikazano na sliki 3, je bilo izražanje in translokacije od NF-κB podenote v jedru analiziramo z Western blotting-om. Opazili smo, da je bila raven p65 in P50 v jedra močno povišano AGS celic po obdelavi IL-17A, medtem ko je stopnja celotne p65 in P50 nobenih sprememb (Slika 3A-D). Poleg tega je bila jedrska /skupni delež teh molekul povečala na zdravljenje z IL-17A (Slika 3E). Podobni rezultati so bili v BGC-823 celične linije (slika S3A-E) opazili, kar kaže, da IL-17A aktivirajo NF-κB v celičnih linijah GC.

Ob tem, ko helenalin (5 um) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), inhibitor NF-κB, dodamo AGS ali BGC-823 celic medij pred zdravljenjem z IL-17A, stopnje izraženosti MMP-2 in MMP-9 so znatno zmanjšala (slika 4C-D Slika S4C-D). Rezultat je pokazala, da IL-17A inducirane MMP-2 in MMP-9 izražanja v GC celici preko aktivacije NF-κB. Zato bi IL-17A povzroča GC celic invazivnost bila prav tako blokirala helenalin in vitro
(slika 4A-B, slika S4A-B). Zato so te ugotovitve kažejo, da IL-17A aktivira NF-κB poti, nato regulira izražanje MMP, in s tem vpliva migracije in invazivnosti GC celic.

Diskusija

GC je eden izmed največ smrtnimi maligne bolezni v svetu zaradi svoje visoke stopnje recidiva po zdravilnih terapij [3], [22]. GC je tesno povezana z kroničnih vnetnih bolezni, pri katerih veliko vnetnih citokinov nabirajo. IL-17A je eden od pomembnih vnetnih citokinov v razvoju številnih vnetnih bolezni in tudi pogosto zazna tumorskega mikrookolja [23] - [26]. Predhodna raziskava je predlagal, da bi se ekspresijski nivoji IL-17 v tumor neodvisen napovedni kazalec pri bolnikih adenokarcinomom želodca [27]. Primerjava stopnje preživetja med bolnikih z visokimi in nizkimi stopnjami IL-17 je pokazala, da so imeli bolniki z visoko stopnjo IL-17 5-letno preživetje 47% v primerjavi s 84% ​​pri bolnikih z nizko stopnjo [28]. Vendar pa molekularni mehanizmi za takšno povezanost, ki lahko nam pomagajo bolje razumeti vlogo IL-17 pri razvoju in napredku GC, še vedno ni pojasnjen.

V tej raziskavi smo ugotovili, da IL- 17A spodbuja invazijo GC celic. Metastaze je eden izmed glavnih vzrokov smrti zaradi raka med bolniki GC. Razgradnja ECM krvnih ali limfnih žil je ključnega pomena, da metastaze, saj izguba ECM omogoča rakave celice napadel krvi ali limfni sistem in se širijo na druga tkiva in organe [29]. MMP, zlasti MMP-2 in MMP-9, so odgovorni za poslabšanje ECM [19], [29]. IL-17A Poročali so, da spodbujajo invazijo rakavih celic preko navzgornje regulacije izražanja MMP-2 in MMP-9 [17], [26]. Na splošno velja, da so MMP dejavnosti zavira TIMPs preprečiti obsežno degradacijo ECM [29]. Za pojasnitev mehanizma delovanja IL-17A, smo raziskali, ali je pospeševanje učinek IL-17A na celično invazijo skozi regulacijo izrazov MMP-2, MMP-9, TIMP-1 in TIMP-2. Naši rezultati so pokazali, da IL-17A povišano izraze in aktivnosti MMP-2 in MMP-9 in navzdol reguliranih izraze TIMP-1 in TIMP-2, ki nadalje pojasnjena, da IL-17A napredoval migracijo celic pri zdravljenju praske rane esej. Zato bi lahko pro-metastaze učinek IL-17A na GC je po urejanju MMP /TIMP ravnotežje.

NF-κB je bila prijavljena kot cilj nadaljnji IL-17A signalnih poti v mnogih celic [17] [20] [21], ki je sposoben upregulate MMP-2 in MMP-9 izrazom [14], [17]. In IL-17A so poročali tudi povečanje ekspresije MMP preko aktiviranja NF-κB poti v številnih celicah [14], [17]. Pa raziskali, ali je Povecanje MMP-2 in MMP-9, IL-17A inducirane z aktiviranjem NF-κB poti. Rezultati so pokazali, IL-17A napredoval jedrsko translokacijo od p65 in P50 podenote GC celic in nato molekul izražanje MMP-2 in MMP-9. Ta učinek se lahko učinkovito blokira inhibitor NF-κB, kar kaže, da je aktivacija NF-κB potencial mehanizem za upregulate MMP-2 in MMP-9 IL-17A.

Na koncu je predlagal naše ugotovitve da je IL-17A sposoben spodbujati migracije in invazivnosti GC celic z aktivacijo NF-κB pot, ki je pozneje molekul izraze MMP-2 in MMP-9 in s tem vplivala na migracije in invazivnosti GC celic. Nadaljnje karakterizacija učinka IL-17A na GC invaziji in metastaz lahko privede do identifikacije novih diagnostičnih označevalcev in terapevtskih ciljev.

Podpora Informacije
Slika S1.
Učinek IL-17A o širjenju BGC-823, SGC-7901 in AGS celice
doi:. 10,1371 /journal.pone.0096678.s001
(IOD)
Slika S2.
IL-17A promovira izraze MMP-2 in MMP-9 in zatira izraze TIMP-1 in TIMP-2 v SGC-7901 celic. (A) Izrazi MMP v SGC-7901 celic smo primerjali z Western blotting-om med celicami, zdravljenih z in brez IL-17A (50 ng /ml) 24 h. (B) Količinska vsebnosti beljakovin MMP-2 in MMP-9. Vrednosti predstavljajo sredstva ± SD treh neodvisnih poskusov, opravljenih v treh izvodih. . * p
< 0,05, v primerjavi s kontrolno skupino
doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s002
(IOD)
Slika S3.
IL-17A aktivira NF-κB v BGC-823 celic. (A) Western blot analiza je bila uporabljena za odkrivanje celotne P50, p65, P52 C-Rel in RelB ekspresijo v celicah BGC-823, obdelane z IL-17A (50 ng /ml) pri označenih časovnih točkah. (B) Količinska ravni beljakovin celotnega P50, p65, P52, c-Rel in RelB. (C) blotting analizo Western bila uporabljena za odkrivanje jedrske P50, p65, P52, c-Rel in RelB ekspresijo v celicah BGC-823, obdelane z IL-17A (50 ng /ml) pri označenih časovnih točkah. (D) Količinska ravni beljakovin jedrske P50, p65, P52, c-Rel in RelB. (E) Relativni delež jedrske energije k skupni delček P50, p65, P52, c-Rel in RelB. Vrednosti predstavljajo sredstva ± SD treh neodvisnih poskusov, opravljenih v treh izvodih. . * p
< 0,05, v primerjavi s kontrolno skupino
doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s003
(IOD)
Slika S4.
Učinki helenalin in IL-17A na celične invazije in izražanja MMP-2 in MMP-9 v BGC-823 celicah. (A) 1 x 10 6 BGC-823 celice smo obdelali z helenalin (5 uM) in nato inkubiramo v prisotnosti ali odsotnosti IL-17A (50 ng /ml) 24 h. Cellular invazivnost je bila izmerjena s pomočjo transwell invazijo testom. (B) Stopnja invaziji odstotka bil izražen kot odstotek kontrole. (C, D) Vrednosti proteinske MMP-2 in MMP-9 so odkrile Western blotting-om, ko so BGC-823 celice obdelamo z helenalin in /ali IL-17A. Vrednosti predstavljajo sredstva ± SD treh neodvisnih poskusov, opravljenih v treh izvodih. * p
< 0,05, v primerjavi s kontrolno skupino
doi:. 10,1371 /journal.pone.0096678.s004
(TIF)

• Plos ONE: Altered Izražanje inducirajo s hipoksijo Factor-1 a (HIF-1 a) in njenih regulatornih genov želodčnega raka Tissues
• Plos ONE: obtoku tumorske celice (CTCs) RT-PCR in njeno prognostičnih vlogi želodčnega raka Zaznane: Meta-analiza Objavljeno Literature