PLoS One: Az interleukin 17A Elősegíti gyomorkarcinóma invazív keresztül NF-kB közvetített mátrix metalloproteinázok 2. és 9. Expression

absztrakt

interleukin 17A (IL-17A), mint a pro-gyulladásos citokin, részt vesz a patológia a gyulladásos betegségek és a tumor mikrokörnyezetében. A cél ennek a tanulmány célja, hogy megvizsgáljuk az IL-17A a invazivitásának gyomorrák (GC). A tanulmányban azt találtuk, hogy az IL-17A elősegítheti a migrációs és behatolás GC sejteket. Továbbá, miután kezelt IL-17A, a kifejezések és tevékenységek mátrix metalloproteináz 2 (MMP-2) és az MMP-9-et serkentett, miközben a kifejezéseket a TIMP-1 és a TIMP-2-t downregulált. Sőt, a nukleáris /általános frakciói p65 és p50 drámaian megemelkedett IL-17A. Előkezelés helenalin, egy nukleáris faktor-kB (NF-kB) inhibitor, bebizonyosodott, hogy töröljék a elősegítő hatását az IL-17A a invázió képességét GC sejtek és fokozza az MMP-2 és MMP-9. Összefoglalva, eredményeink illusztrált, hogy az IL-17A elősegítheti az invázió GC-sejtek aktiválásával NF-kB utat, és ezt követően upregulating az MMP-2 és MMP-9. Ezek az eredmények azonosításához vezethet új diagnosztikai markerek és terápiás célpontjai GC. Katalógusa

Citation: Wang Y, Wu H, Wu X, Bian Z, Gao Q (2014) interleukin 17A Elősegíti gyomorkarcinóma invazív keresztül NF -κB közvetített mátrix metalloproteinázok a 2. és a 9. Expression. PLoS ONE 9 (6): e96678. doi: 10,1371 /journal.pone.0096678 katalógusa

Szerkesztő: Nikos K. Karamanos, University of Patras, Görögország katalógusa

Beérkezett: november 26, 2013; Elfogadva: április 11, 2014; Megjelent: június 6, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Wang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Finanszírozás: A projekt támogatott Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (No. 81070536) és ifjúsági tudományos alapok a Központi Kórház Taian (2011ZRQNO35). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

Mint az egyik legjobb oka a rák okozta halál világszerte, GC felelős több mint 700.000 haláleset évente [1]. Ez a második leggyakoribb rák és a harmadik vezető halálok között rákos betegek Kínában [2]. A potens invázió és metasztázis képessége GC az egyik fontos tényező, hogy a rossz prognózissal [3]. Ezért jelentős feltárni a mögöttes mechanizmusok azonosítása új molekuláris terápiás célpontokat, amelyek szabályozzák invázió képességeit GC sejtek, tehát olyan előrenyomuló kezelések GC. Katalógusa

Az IL-17A alapító tagja az IL -17 család amelyek tól az IL-17A-IL-17F [4] - [8]. IL-17 család tagjai aktív szerepet játszanak a különböző betegségek, például autoimmun betegségek, gyulladásos betegségek, és a rosszindulatú betegségek. Tartós gyulladás tartották, hogy korrelál a megnövekedett kockázata GC [9]. Korai lépéseit a gyomor karcinogenezis bevonni Helicobacter pylori katalógusa (H. pylori) fertőzés, ami krónikus aktív és atrófiás gastritis termelés a gyulladást megelőző mediátorok [10] - [13], mint például az IL-1b, TNFa, IFNy, IL-6 és IL-8. Ugyanakkor a szerepe az IL-17A rák volt következetlen szerint a korábbi jelentéseket. Egyes bizonyítékok azt mutatta, hogy az IL-17A elősegítheti tumor növekedését stimuláló angiogenezist és invazív képességét tumorsejtek [14]. Ezzel ellentétben, más vizsgálatok azt sugallták, hogy az IL-17A mutatott elleni védőhatást krónikus lymphoid leukémia fejlődés támogatása az immunrendszer által közvetített tumor-kilökődési [15]. Továbbá, az IL-17A fokozott citotoxikus hatására NK-sejtek tumorsejtek ellen által bővítésére expressziója citotoxikus molekulák [16]. Eddig kevesebb az a szerepe az IL-17A az invázió GC. Katalógusa

A jelen tanulmányban azt találták, hogy az IL-17A növelheti GC sejtmotilitással felfelé szabályozásával MMP-2 és MMP -9 keresztül aktiválja az NF-kB átirat tényezők. katalógusa

anyagok és módszerek katalógusa

Cell Culture katalógusa

Az emberi GC sejtvonal AGS-t az ATCC-től (American Type Culture Collection, Manassas, VA), és DMEM, kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS; Hyclone, Logan, UT), 100 U /l penicillint és 100 mg /l streptomicint. Emberi GC sejtvonalak BGC-823, SGC-7901 kaptuk Kínai Tudományos Akadémia (Shanghai, Kína), és RPMI-1640 közegben, amely 10% szarvasmarha szérumot, penicillint (100 egység /ml) és sztreptomicin (100 ng /ml). Az összes sejtet 37 ° C-on, 5% CO _{2 levegő atmoszférában.}

sebgyógyulás Assay

GC-sejteket tenyésztettünk, mint egybefolyó egyrétegű egy 6 mérőhelyes lemez és sebesült eltávolításával egy 1 mm-es szalag egész jól egy pipetta hegyével amikor ragasztva a lemez felületén. A sebesült monomolekuláris rétegeket ezután kétszer mossuk PBS-sel, hogy eltávolítsuk a nem-tapadó sejteket előtt 1 ml tápközegben vagy anélkül IL-17A (50 ng /ml) (R &D rendszer, Minneapolis, MN) adtunk hozzá. 12 óra elteltével inkubáció különböző koncentrációjú csoportokat fényképezte fordított mikroszkópos. Katalógusa

In vitro katalógusa Invasion Analitika katalógusa

A in vitro katalógusa invázió vizsgálatot végeztünk a Bio-Coat Matrigel inváziós vizsgálati rendszerben (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) a korábban leírtak szerint [17]. Miután kezelt vagy anélkül IL-17A (50 ng /ml), a GC sejteket beoltottuk 200 ul szérummentes tápközegben, és elhelyezni a felső kamrák a 2 × 10 ^{5 sejt és normális növekedés közepes helyeztünk alá kamrák . Huszonnégy órával később a sejteket a felső felületén a membrán eltávolítottuk, pamut törlőkendő, míg a sejtek az alsó oldalán a szűrő fixáltuk, megfestett és mértük. A százalékos invazív arány fejeztük ki a kontroll százalékában.}

Western-blot-analízis

teljes sejt lizátumokat GC sejteket összegyűjtöttük a sejtek lízis-pufferben. Nukleáris lizátumában tenyésztett sejteket összegyűjtöttük a NucBusterTM Protein Extraction Kit (Novagen, Németország) a gyártó utasításai szerint. Western blot analíziseket a szokásos protokoll alkalmazásával elleni antitestek MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, P52 és β-aktin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), az NF-kB-P50, p65 /RelA, C-Rel, RelB, és a hiszton-H1 (santa Cruz Biotechnology, santa Cruz, CA).

zimográfia

a sejteket különböző koncentrációjú IL-17A, 37 ° C-on 24 órán, és a mintákat a kondicionált tápközeget összegyűjtjük. Megfelelő térfogatú minták (korrigálva vitális sejtszámot) voltak elválasztva 0,1% zselatin-8% -os SDS-PAGE elektroforézissel. Az elektroforézis után a géleket kétszer mossuk 2,5% -os Triton X-100, szobahőmérsékleten 30 percig, majd inkubáltuk reakció puffert (10 mM CaCI _{2, 40 mM Tris-HCl-t és 0,01% NaN 3, pH = 8,0) 37 ° C-on 12 órán át. Coomassie Brilliant Blue R-250 gél folt ezután festésére alkalmaztuk a gélből. Intenzitását sávok a géleket kiszámítani egy képelemző rendszerrel (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).}

Statisztikai elemzés

Minden adatot fejeztük ki átlag ± SD. A statisztikai elemzést végeztünk az SPSS 16.0 szoftver (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA), hogy értékelje a statisztikai különbségeket. Student-féle T
-próba alkalmaztuk összehasonlítására két csoport és az egyirányú vagy kétirányú variancia analízist elemzésére használt statisztikai csoportok közötti különbségek különböző körülmények között. A p katalógusa értéke kisebb, mint 0,05 tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Valamennyi statisztikai teszt kétoldalú volt. Katalógusa

Eredmények katalógusa

IL-17A Növeli sejtmozgás GC Cells katalógusa

A karcolásálló seb vizsgálatot végeztünk annak meghatározására, hogy az IL-17A a migráció AGS, BGC-823, és SGC-7901 sejtek. A kiterjesztés a sejtmigrációt mennyiségileg becslésével a százalékos recolonization a seb felületén 24 óra után. A kontroll csoportban, a mozgás nem volt nyilvánvaló. Jelenlétében az IL-17A, ez a mozgás jelentősen elősegítette után 12 óra inkubálás (1a ábra). Számszerűsítése analízis azt jelezte, hogy a különbség szignifikáns volt (1b ábra). Sőt, a inváziós vizsgálati eljárás kimutatta, hogy a invazív képességét az IL-17A kezelt sejtek szignifikánsan erősebb, mint a kontroll a szülői sejtek mindhárom vizsgált sejtvonal (ábra 1c és 1d). Ezek az adatok azt mutatták, hogy az IL-17A javíthatnák GC-migráció és invazív. Továbbá azt is megfigyeltük, hogy az IL-17A nincs jelentős hatása elterjedése BGC-823, SGC-7901 és AGS sejtek (ábra S1), ami arra utal, hogy a serkentő hatását az IL-17A a migrációra és invazív nem zavarják a sejtek proliferációt.

hatása az IL-17A on felülszabályozása MMP-2 és MMP-9 és alulszabályozása TIMP-1 és a TIMP-2 GC Cells

Mivel overexpressziója MMP-k elősegítheti a rák metasztázis [18], [19], akkor a következő hatását vizsgálták az IL-17A a MMP-k expresszióját GC sejtvonalakban. Amint a 2. ábrán látható, és ábra S2, a kifejezések az MMP-2 és MMP-9 alkalmazásával hasonlítottuk össze Western blot között az IL-17A kezelt és kezeletlen sejtekben. Az eredmény azt mutatta, hogy az MMP-2 és MMP-9-et felülszabályozott IL-17A kezelt sejtek (AGS és BGC-823) (ábra a 2A és 2B). Ugyanakkor, a kifejezéseket a TIMP-1 és a TIMP-2, arra downregulált (ábra a 2A és 2B). Zselatin zimográfia is végeztünk, hogy értékelje a MMP-2 és MMP-9 GC kezelt sejtek vagy anélkül IL-17A. Az eredmények azt mutatták, hogy az IL-17A fokozott aktivitását MMP-2 és MMP-9-GC-sejtek (AGS és BGC-823) (2C ábra és 2D). Hasonló eredményeket figyeltek meg SGC-7901 sejtek (ábra S2). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a pro-áttét hatása az IL-17A GC lehet, ha a szabályozó MMP /TIMP egyensúly és arra ösztönzött minket, hogy tovább vizsgálja a hatásmechanizmusa. Katalógusa

IL-17A upregulálja MMP-2 és MMP- 9 kifejezések keresztül aktiválása az NF-kB Pathway

NF-kB számoltak downstream célpontjaként az IL-17A jelátviteli út sok sejtben [17], [20], [21], amely képes arra, hogy upregulate MMP-2 és MMP-9 kifejezések [14], [17]. És az IL-17A is beszámoltak, hogy növelje a kifejezés az MMP-k keresztül aktiváló NF-kB útvonal számos sejtben [14], [17]. Ezért következő ellenőrizte, hogy az IL-17A serkentett MMP-2 és MMP-9 kifejezések GC sejtek aktiválásával NF-kB. Amint a 3. ábrán látható, a kifejezés és az NF-kB alegységek nucleus analizáltuk Western-blottal. Megfigyeltük, hogy a szint p65 és p50 a magok drámaian megemelkedett AGS sejtekben az IL-17A kezelés, míg a szint teljes p65 és p50 nincs változás (3A-D). Ezen túlmenően, a nukleáris /általános frakció ezen molekulák nőtt upon IL-17A kezelés (ábra 3E). Hasonló eredményeket figyeltünk meg BGC-823 sejtvonal (ábra S3A-E), jelezve, hogy az IL-17A aktivált NF-kB in GC sejtvonalakban.

Továbbá, amikor helenalin (5 uM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), egy NF-kB inhibitor, adunk AGS vagy BGC-823 sejtek közepes előtt az IL-17A kezelés, az expressziós szintek az MMP-2 és MMP-9-et jelentősen csökkent (4C-D, ábra S4C-D). Az eredmény igazolta, hogy az IL-17A indukált MMP-2 és MMP-9-expresszió GC sejt keresztül az NF-kB aktiválást. Ennek megfelelően az IL-17A indukált GC sejt behatolásra is blokkolta helenalin in vitro katalógusa (4a ábra-B, ábra S4A-B). Ezért ezek az eredmények arra utalnak, hogy az IL-17A aktiválja az NF-kB utat, ezt követően expresszióját szabályozza az MMP-k, és ezáltal befolyásolja a migráció és invazivitását GC sejteket.

Discussion

GC az egyik legvégzetesebb rosszindulatú betegség a világon, mert a magas visszaesési arány után gyógyító terápiák [3], [22]. GC szorosan összefügg a krónikus gyulladásos betegségek, amelyekben sok gyulladásos citokinek beszivárog. IL-17A egyik fontos gyulladásos citokinek a fejlesztés számos gyulladásos betegségek és az is gyakran kimutatható tumor mikrokörnyezetében [23] - [26]. Korábbi tanulmány azt javasolta, hogy az expressziós szintek az IL-17 a tumor lehet egy független prognosztikai mutató gyomor adenokarcinóma betegeknél [27]. A túlélési arányok közötti betegek magas és alacsony interleukin-17 megállapította, hogy a betegek magas szintű IL-17 volt, az 5 éves túlélési arány 47%, szemben a 84% a betegek alacsony szinten [28]. A molekuláris mechanizmusok ilyen összefüggés, amely segíthet, hogy jobban megértsük a szerepe az IL-17 a fejlődés és a haladás a GC, még tisztázásra szorul. Katalógusa

A jelen tanulmányban azt találták, hogy az IL- 17A elősegítette az invázió GC sejteket. Áttét az egyik vezető oka a rák okozta halál között GC betegeknél. Degradációja ECM vér vagy nyirokerek kritikus metasztázis, mert veszteség az ECM lehetővé teszi a rákos sejteket, hogy megszállják a vér vagy a nyirokrendszer és átterjedt más szövetek és szervek [29]. Az MMP-k, különösen az MMP-2 és MMP-9, felelősek lebontására az ECM [19], [29]. Az IL-17A leírták, hogy elősegítik az invázió rákos sejtek keresztül upregulating expresszióját MMP-2 és MMP-9 [17], [26]. Általánosan elfogadott, hogy az MMP tevékenységeket gátolja TIMP-ek, hogy megakadályozza kiterjedt ECM lebomlása [29]. Tisztázni a hatásmechanizmusa az IL-17A, azt vizsgáltuk, hogy a serkentő hatását az IL-17A sejtinvázióra keresztül szabályozás a kifejezések az MMP-2, MMP-9, TIMP-1 és a TIMP-2. Eredményeink azt mutatták, hogy az IL-17A emelkedett a kifejezések és tevékenységek az MMP-2 és MMP-9 és downregulált kifejezései TIMP-1 és a TIMP-2, amely továbbá kifejtette, hogy az IL-17A mozdítani sejtmigráció a karcolás sebgyógyulás próba. Ezért, a pro-metasztázis hatása az IL-17A GC lehet keresztül szabályozó MMP /TIMP egyensúlyt.

NF-kB számoltak downstream célpontjaként az IL-17A jelátviteli útvonal számos sejtben [17] , [20], [21], amely képes arra, hogy fokozzák az MMP-2 és MMP-9 kifejezések [14], [17]. És az IL-17A is beszámoltak, hogy növelje a kifejezés az MMP-k keresztül aktiváló NF-kB útvonal számos sejtben [14], [17]. Tehát azt vizsgáltuk, hogy az fokozza a MMP-2 és MMP-9 által indukált IL-17A keresztül aktiváló NF-kB utat. Az eredmények azt mutatták, az IL-17A mozdítani nukleáris transzlokációját a p65 és p50 alegységekből GC sejtek és ezt követően serkentett expresszióját MMP-2 és MMP-9. Ez a hatás nem lehetne hatékonyan blokkolta az NF-kB inhibitor, ami arra utal, hogy az NF-kB a potenciális mechanizmus upregulate MMP-2 és MMP-9 által IL-17A.

Összefoglalva, eredményeink azt javasolta, hogy az IL-17A képes volt, hogy támogassák a migráció és invazivitását GC-sejtek aktiválásával NF-kB útvonal, amely ezt követően serkentett a kifejezéseket az MMP-2 és MMP-9, és ezáltal befolyásolta a migráció és invazivitását GC sejteket. További jellemzés a hatás az IL-17A GC invázió és metasztázis vezethet azonosításához új diagnosztikai markerek és terápiás célokat.

Támogató információ
ábra S1.
Az IL-17A a elterjedése BGC-823, SGC-7901 és AGS sejteket. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s001 katalógusa (TIF) hotelben ábra S2.
IL-17A elősegíti a kifejezéseket az MMP-2 és MMP-9 és elnyomja a kifejezéseket a TIMP-1 és a TIMP-2 SGC-7901 sejteket. (A) Kifejezések Az MMP-k az SGC-7901 sejteket képest Western-blottal között kezelt sejtek és a nélkül az IL-17A (50 ng /ml) 24 órán át. (B) mennyiségi meghatározása A fehérje szintje MMP-2 és MMP-9. Az értékek az átlag ± SD-három független kísérlet három párhuzamosban végeztük. * p katalógusa < 0,05, míg a kontroll csoportban. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s002 katalógusa (TIF) hotelben ábra S3.
IL-17A aktiválja az NF-kB a BGC-823 sejtekben. (A) Western-blot analízis segítségével kimutatására teljes p50, p65, p52, c-Rel és RelB expresszió BGC-823-vel kezelt sejtek az IL-17A (50 ng /ml) a jelzett időpontokban. (B) mennyiségi meghatározása A fehérje szintek általános p50, p65, p52, c-Rel és RelB. (C) Western blot analízist kimutatására használják nukleáris p50, p65, p52, c-Rel és RelB expresszió BGC-823-vel kezelt sejtek az IL-17A (50 ng /ml) a jelzett időpontokban. (D) számszerűsítése a fehérje szintje a nukleáris p50, p65, p52, c-Rel és RelB. (E) A relatív aránya nukleáris az általános frakció p50, p65, p52, c-Rel és RelB. Az értékek az átlag ± SD-három független kísérlet három párhuzamosban végeztük. * p katalógusa < 0,05, míg a kontroll csoportban. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s003 katalógusa (TIF) hotelben ábra S4.
hatásai helenalin és az IL-17A a sejtek invázióját és a kifejezések az MMP-2 és MMP-9 BGC-823 sejtekben. (A) 1 × 10 6 BGC-823 sejteket előkezeltük helenalin (5 uM), majd inkubáljuk a jelenlétében vagy hiányában IL-17A (50 ng /ml) 24 órán át. Cellular invazív mértük a transwell inváziós vizsgálati eljárás. (B) A százalékos invázió mértéke fejeztük ki a kontroll százalékában. (C, D) A fehérje szintje MMP-2 és MMP-9 detektáltuk Western-blottal, amikor BGC-823-sejteket kezeltünk helenalin és /vagy IL-17A. Az értékek az átlag ± SD-három független kísérlet három párhuzamosban végeztük. * p katalógusa < 0,05, míg a kontroll csoportban. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s004 katalógusa (TIF) hotelben

• PLoS One: megváltozott expressziója hipoxia-indukálható faktor-1α (HIF-1α) és annak szabályozó gének gyomorrákban Tissues
• PLoS One: A keringő daganatsejtek (CTC) által észlelt RT-PCR és prognosztikai szerepe a gyomorrák: meta-analízise Megjelent Literature