PLOS ONE: Macrophage Infiltration Induit cancer gastrique envahissant par activation de la β-caténine

Résumé

Contexte

En dépit des preuves qui a activé les macrophages agissent dans un microenvironnement inflammatoire de promouvoir la tumorigenèse gastrique via la signalisation β-caténine, les effets de la signalisation β-caténine sur gastrique métastatique des cellules cancéreuses et la relation de ces cellules avec des macrophages associés aux tumeurs environnantes ont pas été directement étudiée.

Méthodes

la coloration immunohistochimique a été utilisé pour analyser les 103 patients. Un essai d'invasion a été utilisé pour évaluer la relation entre les macrophages et les cellules cancéreuses gastriques. ß-caténine gain de fonction et des approches de perte de fonction ont été effectuées. Pour évaluer le mécanisme de régulation β-caténine dans les cellules de cancer gastrique, Western blot et transcription inverse réaction en chaîne par polymérase ont été utilisés.

Résultats

Augmentation de la densité des macrophages a été associée à un stade avancé et une faible survie . des lignées cellulaires de cancer gastrique en co-culture avec des macrophages milieu conditionné a montré une augmentation de l'accumulation nucléaire de la β-caténine et a augmenté la capacité d'invasion. AKT mais pas Erk réglementé β-caténine translocation. MMP7 et CD44, à la fois β-caténine gènes en aval, ont été impliqués dans l'invasion des cellules gastriques du cancer du macrophage activé.

Conclusion (s)

Collectivement, les données cliniques suggèrent que l'infiltration des macrophages est en corrélation avec augmentation de grade et de mauvais pronostic pour les patients atteints de cancer gastrique qui ont subi une résection radicale. Macrophages peuvent induire invasivité en activant la voie β-caténine

Citation:. Wu MH, Lee WJ, Hua KT, Kuo ML, Lin MT (2015) Macrophage Infiltration Induit cancer gastrique envahissant par activation de la β-caténine . PLoS ONE 10 (7): e0134122. doi: 10.1371 /journal.pone.0134122

Editeur: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, Italie

Reçu: 16 Septembre 2014; Accepté 6 Juillet 2015; Paru le 30 Juillet, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Wu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

financement:.. Ce travail a été soutenu par des subventions du Conseil national des sciences, Taiwan (NSC 98-2314-B-002-055-MY2)

intérêts concurrents: les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

le cancer gastrique introduction (GC) est parmi les cancers les plus courants dans le monde et près des deux tiers de ces patients vont mourir de. leur maladie. [1] GC est étroitement associée à l'infection de Helicobacter pylori, ce qui conduit à une inflammation chronique. [2] Ce microenvironnement inflammatoire est caractérisée par la présence de leucocytes hôtes avec principalement des macrophages dans les deux stroma de support et les tissus tumoraux. [3] les recherches indiquent que les réponses inflammatoires associées à la tumeur, à la fois locales et systémiques, sont des facteurs importants indépendants dans la progression tumorale et les métastases. [4, 5] Cependant, les liens entre ces médiateurs moléculaires et l'inflammation chronique ne sont pas entièrement comprises .

l'activation de la voie Wnt est une étape importante dans la carcinogenèse. Des mutations le long de la voie Wnt-β-caténine se produisent dans environ 90% du cancer colorectal et des carcinomes hépatocellulaires et dans environ 30% de GC. [6, 7] En outre, le facteur onconécrosant-α (TNF-α) obtenu à partir des macrophages activés favorise l'activité β-caténine dans les cellules GC. [8, 9] Cependant, en dépit des preuves qui a activé les macrophages agissent dans un microenvironnement inflammatoire, de promouvoir la tumorigenèse gastrique par l'intermédiaire d'une signalisation β-caténine, les effets d'activation de signalisation β-caténine sur les métastases de cellules de GC et la relation de ces cellules avec les macrophages environnants associés à des tumeurs (TAMs) n'a pas été directement étudiés.

d'après les résultats ci-dessus, nous avons supposé que la voie β-caténine peut également être impliqué dans la régulation induite par macrophage-GC métastase. Dans cette étude, nous avons examiné d'abord la densité des macrophages infiltrés et l'expression de β-caténine dans les tissus de carcinome gastrique par immunohistochimie (IHC). Les caractéristiques clinico-pathologiques du carcinome gastrique et du pronostic ont été démontrées. En outre, nous avons découvert que les macrophages induisent la translocation nucléaire de la β-caténine et d'améliorer la capacité d'invasion des cellules GC. Nos résultats démontrent et soutiennent en outre un lien important entre TAM et son médiateur de signalisation en aval, β-caténine, dans la régulation de GC métastase.

Matériel et méthodes

Patients et Specimens

l'étude a été approuvée par le Conseil et de l'éthique humaine du Comité de national Taiwan University Hospital Institutional Review. Le consentement écrit pour l'utilisation des échantillons à des fins de recherche a été obtenu à partir de tous les patients avant la chirurgie. L'information des patients a été anonymisées et anonymisées avant l'analyse.

L'étude rétrospective inscrit 205 patients diagnostiqués avec un GC qui a reçu une résection chirurgicale radicale au Département de chirurgie générale, Université nationale de Taiwan de Janvier 1998 à Janvier 2002. De ceux-ci, 102 patients qui ont manqué les données de suivi ou qui sont morts de complications périopératoires ont été exclus et les 103 patients restants ont été inclus dans les analyses. les variables clinicopathologiques ont été classés selon la classification TNM (5e édition, 1997) et les caractéristiques sont résumées dans le tableau 1. La survie globale (OS) a été définie comme étant l'intervalle entre la chirurgie et la mort ou entre la chirurgie et le dernier suivi pour les patients survivants.

Anticorps monoclonaux et IHC

Les spécimens réséqués de GC ont été fixés au formol et inclus dans la paraffine. Les sections ont été examinées pour l'infiltration et TAM β-caténine en utilisant un anticorps anti-CD68 monoclonal (clone KP1, DakoCytomation, Glostrup, Danemark) et de l'anticorps monoclonal β-caténine (clone 15B8, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), respectivement.

évaluation du immunocoloration

Pour évaluer la densité du CD68 + macrophages tissulaires infiltrant, des coupes de tissus ont été examinés par un pathologiste certifié conseil (CI Jan) à faible puissance (100 ×) et les cinq plus représentatifs les champs ont été sélectionnés à 400 × grossissement. Les résultats ont été comptés manuellement et ont été exprimés comme la somme du nombre de cellules dans cinq 400 × champs microscopiques pour chaque zone de chaque spécimen.

Culture
Cell

cellules GC AGS, N87 (acheté de l'American type Culture Collection (Manassas, VA)), MKN45 (acheté à partir de la recherche en sciences Ressources Banque Santé (Osaka, Japon)) et TSGH (acheté de la collection bioressources et Research Center (Hsinchu, Taiwan)) et de la cellule de monocytes humains ligne THP-1 (acheté auprès de American type Culture Collection (Manassas, VA)) cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS, Life Technologies, Inc. ) et 2 mM de L-glutamine (Life Technologies, Inc.).

cellules THP-1 ont été ensemencées dans des boîtes de culture et induites à se différencier en macrophages par incubation avec 100 ng /ml de 12-O-tétradécanoylphorbol-13 -acétate (TPA, Sigma-Aldrich) pendant 24 h. Les macrophages ont été lavés trois fois avec du milieu RPMI contenant 10% de FBS, mises en incubation dans ce milieu pendant 24 h pour éliminer l'effet du TPA et incubées dans un milieu sans sérum pendant 24 h. Les surnageants de culture récoltés et mis en commun ont été utilisés comme macrophage milieu conditionné (CM) comme décrit précédemment. [5, 10]

La prolifération /viabilité Essai

GC cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits et co-cultivées avec ou sans macrophage CM. La prolifération /viabilité a été déterminée par un test colorimétrique en utilisant du 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium (MTT) (Sigma-Aldrich).

Invasion in vitro Dosage

Le test d'invasion a été réalisée en utilisant transwell chambres de culture cellulaire (Millipore Corp., Billerica, MA). Les cellules envahissantes ont été comptées à 400 × grossissement dans 10 domaines différents pour chaque insert. L'expérience a été répétée trois fois.

Extraction de l'ARN et RT-PCR

Après stimulation avec ou sans macrophage CM pendant 6 heures, les cellules GC ont été recueillies et l'ARN total extrait en utilisant le kit de réactif Trizol ( Invitrogen, Carlsbad, CA) suivant les instructions du fabricant. ADNc a été amplifié par réaction en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant des amorces pour MMP7 (forward: 5'AGTCAATCCTGCCTTCTTAGCC, inverse: 5'GCTCCCACCTTCCCTCTTGG), CD44 (forward: 5'TGCCGCTTTGCAGGTGTAT, inverse: 5'TCCCATGTGAGTGTCTGGTAGC), la cycline D1 ( avant: 5'CCCAGCCATGGAACACCA, inverse: 5'GGAGGGCGGATTGGAAATGA), c-myc (forward: 5'AAAGAAGGTGTTGGGGTCGG, inverse: 5'TGGCTCCCCCTGTTATTTGG) et GAPDH (forward: 5'GGGTGATGCAGGTGCTACTT, inverse: 5'GGCAGGTTTCTCAAGACGGA) .

nucléaire et cytoplasmique Fractionnement

Après stimulation avec ou sans macrophage CM pendant 6 heures, les cellules du GC ont été lysées dans 300 ul de tampon de lyse sur la glace et centrifuger à 5400 rpm. Surnageant a été recueilli en tant que fraction cytosolique. Les fractions nucléaires ont été recueillies, puis dirigé dans le dodécylsulfate de sodium électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) pour l'analyse par transfert de Western.

Analyse Western blot

Après stimulation avec macrophage CM, les cellules ont été lavées avec du PBS , grattées dans du tampon RIPA et on centrifuge. Les lysats cellulaires ont été soumis à 10% de SDS-PAGE et transférés sur un fluorure de polyvinylidène (PVDF) (Millipore Corp.) La membrane a été sondée avec des anticorps primaires de β-caténine, Akt, d'ERK, JNK (SC1496, SC8312, SC154, SC474, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA, USA), MMP7 (MAB3322, CHEMICON, Temecula, CA, USA), CD44 (ab51037, Abcam, Cambridge, MA, USA), c-myc (GTX103436, GeneTex, Hsinchu , TAIWAN), la cycline D1 (SC246, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA), β-actine (ab8226, Abcam), HDAC1, p-AKT, p-ERK, p-JNK (SC7872, SC7985-R, SC7383, SC6254, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA) et de l'anticorps secondaire (Santa Cruz Biotechnology).

Immunocytochimie

l'anticorps anti-β-caténine totale a été utilisé comme anticorps primaire, et anti souris Immunoglobulin G (IgG) Alexa 594 a été utilisé comme anticorps secondaire. Les lamelles ont ensuite été monté en utilisant un milieu de montage contenant DAPI pour la coloration nucléaire.

Production Lentiviral et infection

ARNs en épingle à cheveux court (shRNA) ont été achetés à partir du noyau National Facility ARNi à Academia Sinica (Taipei, Taïwan). La séquence cible de la β-caténine shRNA 1 était 5'- CCGGTCTAACCTCACTTGCAATAATCTCGAGATTATTGCAAGTGAGGTTAGATTTTTG-3 '; celle de la β-caténine shRNA 2 était 5'-CCGGTTGTTATCAGAGGACT-AAATACTCGAGTATTTAGTCCTCTGATAACAATTTTTG-3 '. Le vecteur lentiviral et ses vecteurs d'encapsidation ont été transfectés dans des cellules d'encapsidation 293T par le phosphate de calcium, la transfection. En bref, des cellules 293T ont été divisés (10 ^{6) dans 10 cm 2 plats 1 jour avant la transfection. Ensuite, les cellules ont été transfectées avec 10 ug des vecteurs shRNA et 10 pg de pCMVΔR8.91 (le vecteur d'emballage) et 1 pg de pMD.G (le vecteur d'enveloppe). Après 5 heures d'incubation, le milieu de transfection a été remplacé par du milieu de culture frais. Quarante-huit heures plus tard, le milieu contenant des lentivirus a été recueilli à partir de transfection et centrifugée à 1500 tpm pendant 5 minutes pour sédimenter les débris cellulaires, le surnageant a été filtré à travers un filtre de 0,45 um et les cellules cibles ont été infectées par contenant lentivirus frais moyen (complété avec 8 pg /ml de polybrène) pendant 24 h.}

analyse statistique

l'analyse statistique des caractéristiques cliniques a été effectuée à l'aide du χ ^{2 test et le degré d'infiltration entre les deux groupes ont été comparés en utilisant le test t. Les courbes de survie ont été construites en utilisant la méthode de Kaplan-Meier et la signification statistique a été analysée en utilisant le test du log-rank. Une valeur p inférieure à 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.}

Résultats

Corrélation des variables immunohistochimiques avec Caractéristiques anatomocliniques dans

L'analyse immunohistochimique de GC patients a montré un modèle CD68 de coloration cytoplasmique pour les macrophages. CD68 + macrophages ont été distribués dans les tissus péritumoraux et intratumoral mais seulement faiblement dispersées dans la muqueuse normale (Fig 1A-1C). La densité des macrophages CD68 + était particulièrement élevé dans les 4 lésions (pT4) tumorales au stade de la tumeur pathologique par rapport aux lésions pT1 (figure 1D). Pour déterminer l'association entre les caractéristiques cliniques et la densité de CD68 + macrophage, le nombre de CD68 + macrophages ont été divisés en ceux ci-dessus et en dessous des valeurs médianes. Le nombre de macrophages CD68 + a été trouvée être associée à la profondeur de la tumeur et l'étape (p = 0,001 et p = 0,043, respectivement) (tableau 1). Cette observation suggère que les macrophages CD68 + peuvent être importants dans la promotion de l'invasion tumorale. Pour une analyse plus approfondie, les courbes de survie de Kaplan-Meier ont été tracées pour déterminer l'association des macrophages avec la survie (figure 2). La densité du CD68 + macrophages dans le tissu tumoral a été négativement associée à la survie globale (p = 0,0073). Les patients ayant un nombre élevé de CD68 + macrophages tumoraux avaient la survie globale plus courtes que celles avec un faible nombre de CD68 + macrophages.

L'expression accrue et un signal plus fort de β-caténine ont été observées par coloration IHC dans les tumeurs. Dans la plupart des cas, l'expression de β-caténine est situé principalement dans le cytoplasme (figure 3A). Fait intéressant, une forte coloration nucléaire des cellules GC β-caténine a été associée à des macrophages CD68 + dans des lésions tumorales, en particulier en face de l'invasion tumorale (figure 3B). Sur la base de ces résultats, nous avons supposé que l'infiltration des macrophages peut activer la signalisation β-caténine dans les cellules tumorales gastriques, ce qui conduit alors susceptible d'invasion dans le cancer gastrique.

Exigence de Macrophages pour Tumor Invasion en GC et activé macrophage induite par l'invasion des cellules du GC

Pour confirmer davantage nos résultats cliniques in vitro
, nous les premiers macrophages co-cultivées avec différentes lignées de cellules de GC (AGS, N87, MKN-45 et TSGH) . Toutes les lignées cellulaires GC testées recruterait des macrophages à migrer et à la capacité macrophage recrutement dépendait du degré de malignité des cellules cancéreuses telles que déterminées par leur invasivité (figure 4A). [11] Afin de déterminer si l'invasivité ou la prolifération des cellules GC peuvent être régulée par les macrophages, AGS, N87, MKN45 et TSGH ont été co-cultivées avec et sans macrophages ou CM de macrophage pendant 24 h et leur invasion et la prolifération des capacités testées. Tous les types de co-culture avec des macrophages ou CM à partir macrophage cellulaires ont montré une augmentation de près de deux fois le nombre d'envahir les cellules (par rapport aux témoins négatifs, p < 0,05), qui ne sont pas associées à leur capacité de prolifération (figure 4B-4D ).

translocation nucléaire de β-caténine dans les cellules du GC par les macrophages activés

Nous avons mené une expérience in vitro pour comprendre si la signalisation β-caténine a été impliqué dans l'invasion des cellules GC macrophage activé. Comme cela est représenté sur la figure 5A, β-caténine immunoréactivité n'a été trouvée dans la fraction nucléaire des cellules N87 aussi tôt que 15 minutes après le traitement macrophage CM et la quantité de protéine nucléaire de β-caténine a augmenté d'une manière dépendante du temps. Conformément à ces résultats, l'immunofluorescence a montré l'accumulation et la localisation nucléaire de la β-caténine dans les cellules GC en co-culture avec des macrophages CM par rapport aux témoins en coculture N87 (figure 5B). Ces résultats suggèrent fortement que les facteurs solubles dérivés des macrophages contribuent médiate l'accumulation et la translocation nucléaire de la β-caténine dans les cellules GC. Nous transitoirement renversés β-caténine par shRNA et trouvé diminué β-caténine expression de la protéine dans les 24 h. ablation génétique de β-caténine dans les cellules N87 ne parvient pas à augmenter leur capacité invasive après traitement macrophage CM. En revanche, non transfectée et de contrôle shRNA eu aucun changement dans la capacité invasive des cellules sous traitement N87 macrophage CM (figure 5C). La quantité de protéine nucléaire β-caténine a également augmenté dans les AGS et MKN45 cellules après traitement macrophage CM (S1 Fig).

Effets de macrophage sur l'expression de la β-caténine et les gènes en aval dans les cellules N87

Nous avons évalué les Wnt /β-caténine traditionnelle gènes en aval MMP7, CD44, c-myc et cycline D1 à DÉTERMINÉE si elles sont activées par les macrophages. Les niveaux de MMP7, CD44 et des gènes c-myc ARNm et la protéine ont tous été significativement augmentée dans les cellules incubées avec N87 macrophage CM et les niveaux de cycline D1 a légèrement augmenté (figure 6A). Après avoir demandé diminution de l'activité de l'invasion de frapper vers le bas β-caténine, MMP7, CD44 et de la cycline D1, mais pas c-myc a montré la protéine régulation vers le bas (figure 6B). Pour confirmer la relation entre la capacité d'invasion et MMP7 et CD44, nous avons testé la capacité d'un anticorps neutralisant pour bloquer MMP7 et CD44 activité. la capacité d'invasion a été compromise de façon significative par un traitement préalable avec 2,5 pg /ml d'anti-MMP7 et 10 pg /ml d'anti-CD44 (figure 6C), respectivement, ce qui suggère l'implication des deux gènes dans l'invasion des cellules GC macrophage activé. Nous avons trouvé les niveaux de CD44 et cycline gènes D1 protéines ont augmenté dans les autres lignées de cellules de GC (AGS et MKN45) incubées avec macrophage CM mais MMP7 et c-myc ne sont pas significatifs modifiés (S2 Fig).

Autres ont fait état d'une possible intersection de la voie MAPK avec la voie de signalisation Wnt /β-caténine. [12, 13] Nous avons donc réalisé une étude au cours du temps et a constaté que seulement phospho-AKT et phospho-ERK expression ont été upregulated lorsqu'ils sont traités avec macrophage CM (S3A Fig). Pour confirmer l'interaction entre le /ERK et de AKT β-caténine, on a prétraité les cellules avec soit l'inhibiteur d'ERK (en U0126) ou l'inhibiteur de l'AKT (LY294002). Diminution de la β-caténine dans le noyau translocation n'a été trouvée que dans les cellules traitées avec l'inhibiteur de l'AKT, mais pas un inhibiteur de l'ERK, ce qui indique Wnt voie de signalisation /β-caténine macrophage avtivated peut être régulée par l'AKT (Fig S3B). Dans les cellules GC, l'effet de l'AKT semble être dominant dans le macrophage activé Wnt voie de signalisation /β-caténine. Des études antérieures ont également suggéré que le TNF-α produite par les macrophages est un médiateur clé de l'inflammation et peut favoriser l'activité β-caténine dans les cellules tumorales. Nous avons trouvé que l'utilisation d'anticorps neutralisants contre le TNF-α dans N87 activation suppress β-caténine dans l'exposition à macrophage CM (S4 Fig).

Discussion

Le microenvironnement d'une tumeur est d'une importance critique dans la détermination de la fonction leucocytaire et le phénotype. Des données contradictoires ont montré des fonctions antitumorigène ou protumorigenic sur les macrophages en particulier, mais nos données indique les macrophages jouent un rôle protumorigenic chez les patients du GC. Dans la majorité des tumeurs, TAMs produisent une multitude de facteurs qui favorisent la croissance et l'angiogenèse tumorale. [14, 15] Le degré d'infiltration des macrophages dans le nid de cellules de cancer est également un facteur prédictif significatif de la survie chez les patients du GC. [16-18] IHC résultats de cette étude montrent clairement que la densité des macrophages dans le tissu GC est corrélé avec le degré de stade clinique (en particulier dans la tumeur [T] stade) et la survie des patients. Les études actuelles impliquent également que les macrophages peuvent jouer des rôles nocifs dans GC avancé. Cette constatation est en harmonie avec les études qui suggèrent que le microenvironnement immunitaire peut être protumoral plutôt que antitumorale, en dépit de quelques données contradictoires. [19, 20]

accumulation nucléaire de β-caténine a été rapportée chez environ un tiers des adénocarcinomes gastriques, les deux types intestinaux et diffuses. [18] β-caténine est une protéine kDa 92 qui fonctionne directement dans l'adhésion de cellule à cellule [21]. des mutations de β-caténine et une expression aberrante de la protéine ont été impliqués dans l'invasion tumorale et les métastases. [22, 23] dans nos résultats IHC, β-caténine a été localisé dans le noyau à l'avant invasif des cellules tumorales, mais pas dans la zone la plus centrale des tumeurs primaires, où elle est localisée dans la membrane plasmique . Ces observations peuvent également être trouvés dans des échantillons de tumeurs colorectales. [24] Wnt activation /β-caténine dans les cellules cancéreuses situées à l'avant invasive a été postulé comme une étape importante dans la croissance tumorale et la progression. [25]

Chose intéressante, nous avons aussi trouvé β-caténine situé dans le noyau des cellules tumorales avec des macrophages situés de manière adjacente, ce qui suggère une relation possible entre les macrophages et la translocation nucléaire de la β-caténine dans les cellules tumorales. β-caténine à l'avant invasive de GCS est en partie expliquée par des interactions au sein du microenvironnement de la tumeur. Nous avons confirmé in vitro
que les macrophages augmentent la capacité d'invasion des cellules GC. Immunofluorescence en utilisant la microscopie confocale, on a déterminé la localisation et l'accumulation de β-caténine dans le noyau dans les macrophages traités. Ainsi, nous pensons que les cytokines sécrétées par les macrophages induisent β-caténine translocation nucléaire dans les cellules du GC, augmentant ainsi leur capacité d'invasion. Le front invasif des tumeurs de l'épithélium représente un microenvironnement, dans lequel les macrophages interagissent avec les cellules parenchymales en produisant une matrice extracellulaire et par sécrétion de cytokines et de facteurs de croissance qui favorisent localement la prolifération cellulaire et l'invasion. [26, 27] Cependant, dans notre étude, une augmentation de β-caténine expression in vitro
n'a pas modifié la prolifération, indiquant que par lui-même, ne suffit pas d'augmenter la malignité de la tumeur. Cette constatation est également démontré précédemment que β-caténine seulement favorise sites d'adhésion pour former focalement et stimule la migration directionnelle et l'invasion des cellules cancéreuses du côlon, mais non impliqué dans la prolifération des cellules du cancer de l'estomac et de la prostate. [28-30] Cependant, la cellule stromale modulation paracrine de signalisation Wnt dans les cellules épithéliales est probablement coordonné par un réseau plus complexe de la promotion et l'inhibition des facteurs de sécrétion. Les effets en aval des différents niveaux de signalisation Wnt /β-caténine (et en particulier celles qui affectent la prolifération cellulaire, EMT et l'invasion locale) sont pour l'instant mal compris. β-caténine translocation vers le noyau où il se lie à des facteurs de transcription du facteur activateur T cell factor /lymphocytes (TCF /LEF) de la famille et initie la transcription des gènes cibles, tels que cycline D1
c- myc
et MMP-7
[31, 32] impliquée dans la prolifération, l'invasion tumorale et les métastases. [33, 34] Nos résultats suggèrent que les voies de signalisation à travers laquelle les macrophages induisent β-caténine induisent également la l'expression de gènes cibles. Conformément à nos précédents travaux, [5] MMP-7 et CD44 étaient deux tableaux de PCR identifiés après coculture avec les macrophages que les gènes exprimés de manière différentielle associées à la métastase des cellules GC. Dégradation de la matrice extracellulaire médiée par les métalloprotéinases matricielles (MMP) est un mécanisme crucial lors de l'invasion tumorale et les métastases. Une telle dégradation est nécessaire de créer un micro-environnement qui favorise la croissance des tumeurs primaires et les métastases. Le /complexe TCF β-caténine active ensuite un grand nombre d'oncogènes, y compris vegf, c-myc, c-jun, fra-1 et de la gastrine qui peut également être impliqué dans les événements en aval macrophage activé β-caténine. [35]

Une variété de routes modulent probablement le /β-caténine et la régulation de la signalisation β-caténine peuvent se compliquer de façon similaire. Des études récentes ont constaté que macrophage CM déclenche la voie ERK et Wnt active ERK dans les cellules endothéliales. [36, 37] Ici, nous avons constaté que les macrophages induisent la phosphorylation des deux ERK et AKT dans les cellules du GC. Nous avons démontré que le traitement avec un inhibiteur de l'AKT, mais pas inhibiteur de ERK réduit β-caténine translocation. Ces résultats indiquent que Akt joue un rôle dans la signalisation macrophage activé β-caténine dans des types cellulaires gastriques.

Conclusions

Ensemble, les données cliniques suggèrent que l'infiltration des macrophages est corrélée avec le grade accrue et moins bon pronostic pour patients du GC qui ont subi une résection radicale. Macrophages peuvent induire GC invasivité en activant la voie β-caténine. En conséquence, la suppression de l'infiltration des macrophages et la suppression de l'activation de la voie β-caténine représentent des stratégies potentielles pour le traitement de la GC.

Informations complémentaires
S1 Fig. . CM effet de macrophage sur la voie de β-caténine
β-caténine dans le noyau accumule après le traitement par macrophage CM pendant 30 minutes dans les cellules AGS et MKN45
doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s001
(TIFF)
S2 Fig. Effet de macrophage CM sur l'expression des protéines de β-caténine gènes en aval des cellules AGS et MKN45
doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s002
(TIFF)
S3 Fig. (A) Macrophage CM induite AKT et l'activation de ERK dans les cellules N87. les cellules (B), N87 ont été pré-traitées avec 10 uM des inhibiteurs de β-caténine. LY294002 ou U0126 pendant 1 heure, puis cultivées en présence de macrophages CM pendant 1 heure supplémentaire
Akt, d'ERK et de β-caténine expression de la protéine ont été déterminées par Western blot
doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s003
(TIFF)
S4 Fig. . Anticorps neutralisants contre le TNF-α
cellules N87 en présence de macrophage CM pendant 24 heures ont été pré-traitées avec ou sans inhibiteur de TNF-α pendant 1 heure
doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s004
(TIFF)

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