PLoS ONE: makrofagų Infiltracinės Skatina skrandžio vėžio invazijos aktyvuojant β-kateninai Pathway

Anotacija

Fonas

Nepaisant įrodymų, kad aktyvuotu makrofagų aktą uždegiminė mikroaplinkos skatinti skrandžio tumorigenezei per β- kateninai signalizacijos, iš β-kateninai signalizacijos skrandžio vėžio ląstelių metastazės ir šių ląstelių su aplinkinių naviku susijęs makrofagus santykių poveikis nebuvo tiesiogiai ištirti.

metodai

imunohistocheminį dažymo dirbo iki analizuoti 103 pacientų. Invazija analizė buvo naudojama, siekiant įvertinti tarp makrofagų ir skrandžio vėžio ląstelių santykius. beta-kateninai pelnas-ir-funkcijos ir netekus funkcijos požiūrių buvo atliktas. Siekiant įvertinti β-kateninai reguliavimo mechanizmas skrandžio vėžio ląsteles, imunoblotingo ir atvirkštinio transkripcijos polimerazės grandininės reakcijos buvo naudojami.

Rezultatai

Didesnis tankis makrofagų buvo susijęs su pažengęs ir prastos išlikimo , Skrandžio vėžio ląstelių linijas bendrai išauginti su makrofagų sąlygoja vidutinio parodė padidino branduolinės kaupimosi beta-kateninai ir padidėjo užplūsta galimybes. AKT bet ne ERK reglamentuojamą β-kateninai perkėlimas. MMP7 ir CD44, tiek β-kateninai pasroviui genai, dalyvavo makrofagų aktyvuota skrandžio vėžio ląstelių invaziją.

Išvada (-ai)

Bendrai klinikiniai duomenys rodo, kad makrofagų infiltracija koreliuoja su padidėjo kokybės ir blogos prognozės skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, kuriems buvo atlikta radikali rezekcija. Makrofagai gali sukelti invazinis aktyvuojant β-kateninai kelią

Citation:. Vu MH, Lee, WJ Hua KT, Kuo ML Lin MT (2015) makrofagų Infiltracinės Skatina skrandžio vėžio invazijos aktyvuojant ß-kateninai kelią , PLoS ONE 10 (7): e0134122. Doi: 10,1371 /journal.pone.0134122

redaktorius: Fabrizio Matti Istituto Superiore di Sanita, ITALIJA

Įstojo: rugsėjo 16, 2014; Priėmė 6 Liepos 2015 m Paskelbta 30 Liepos 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 VU et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

finansavimas:.. Šis darbas buvo remiamas dotacijas iš Nacionalinės mokslo tarybos, Taivanas (NSC 98-2314-B-002-055-MY2)

konkuruojančių interesų: autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra viena labiausiai paplitusių vėžio formų pasaulyje ir beveik du trečdaliai tokių pacientų mirs. liga. [1] GC yra glaudžiai susijęs su Helicobacter pylori
infekcija, kuri sukelia lėtinis uždegimas. [2] Ši uždegimo mikroaplinka yra būdinga tai, kad priimančiųjų leukocitų buvimą su daugiausia makrofagų tiek atraminio stromos ir navikų audiniuose. [3] Tyrimai rodo, kad naviku susijusių uždegiminė reakcija, tiek vietos ir sisteminis, yra svarbūs nepriklausomi veiksniai naviko progresavimo ir metastazių. [4, 5] Tačiau tarp šių molekulių tarpininkų ir lėtinis uždegimas nuorodos nėra iki galo suprastas .

aktyvinimas WNT keliu yra svarbus žingsnis kancerogenezėje. Mutacijos palei WNT-β-kateninai būdo pasireiškia maždaug 90% gaubtinės ir tiesiosios žarnos ir kepenų ląstelių karcinomos ir apie 30% GKS. [6, 7] Be to, auglio nekrozės faktoriaus-α (TNF-α), išvestų iš aktyvuotų makrofagų skatina β-kateninai veikla GC ląsteles. [8, 9] Tačiau, nepaisant įrodymų, kad aktyvuotu makrofagų aktą uždegiminė mikroaplinkos skatinti skrandžio tumorigenezei per β-kateninai signalizacijos, aktyvuotų β-kateninai signalizacijos poveikį GC ląstelių metastazės ir santykiai šių ląstelių su aplinkinėmis naviko susijęs makrofagų (TAM) nebuvo tiesiogiai ištirti.

remiantis pirmiau pateiktomis išvadomis, mes iškėlė hipotezę, kad β-kateninai kelias taip pat gali dalyvauti reguliuojant makrofagų sukeltos GC metastazes. Šiame tyrime mes pirmą kartą nagrinėjo infiltruotų makrofagų tankį ir beta-kateninai išraišką skrandžio karcinoma audinių, naudojant imunohistocheminis (IHC). buvo pademonstruota klinikos charakteristikos skrandžio karcinoma ir prognozė. Be to, mes nustatėme, kad makrofagai sukelti branduolinę perkėlimą beta-kateninai ir sustiprinti invazijos gebėjimas GC ląsteles. Mūsų duomenys rodo ir toliau remti svarbų ryšį tarp TAM ir jos vartotojų signalizacijos tarpininko, beta-kateninai, reguliuojant GC metastazes.

Naudota krovimo ir metodai

Pacientai ir Mėginiai

tyrimas buvo patvirtintas Institucijų ekspertizės valdyba ir žmogaus etikos komiteto Taivano nacionalinis universitetas ligoninėje. Rašytinis sutikimas už naudojimąsi dėl mokslinių tyrimų tikslais mėginius buvo gautas iš visų pacientų prieš operaciją. Paciento informacija buvo anonimiški ir DE-identifikuojamos prieš analizę.

tyrimas retrospektyviai dalyvavo 205 pacientų diagnozuota GC gavusio radikalų chirurginės rezekcija tuo Bendrosios chirurgijos katedros, Taivano nacionalinis universitetas nuo 1998 sausio iki 2002 sausio jų 102 pacientai, kurie stokojo tolesnius duomenis arba kurie mirė nuo perioperacinei komplikacijų buvo atmesti, o likusieji 103 pacientai buvo įtraukti į analizę. Klinikos kintamieji buvo priskirti pagal TNM klasifikaciją (5-asis leidimas, 1997) ir charakteristikos yra apibendrinti 1 lentelėje Bendras išgyvenamumas (OS) buvo apibrėžiama kaip skirtumas tarp operacijos ir mirties arba tarp operacijos ir paskutinis intervalas sekti dėl maitintojo netekusių pacientų.

monokloninių antikūnų ir IHC

rezekcijos pavyzdžiai GC buvo fiksuojami formalinu ir įdėta į parafiną. Skyriai buvo tiriama TAM infiltracija ir beta-kateninai naudojant monokloninius anti-CD68 antikūnas (klonas KP1, DakoCytomation, Glostrup, Danija) ir monokloninis β-kateninai antikūnas (klonas 15B8, Sigma-Aldrich, St Louis, MO), atitinkamai.

vertinimas imunodažymu

Jei įvertinti audinių infiltruojanti CD68 + makrofagų tankį, audinių dalys buvo tikrinami pagal valdybos patvirtintą patologas (PI Jan) esant mažos galios (100 ×) ir penkių tipiškiausias laukai buvo atrinkti 400 × priartinimas. Rezultatai buvo skaičiuojami rankiniu būdu ir buvo išreikštas ląstelių skaičiaus, suma per penkerius 400 × mikroskopinių srityse kiekvienam kas pavyzdį srityje.

Mobilusis Kultūra

GC ląstelių AGS, N87 (įsigyjamas iš Amerikos tipas kultūros kolekcija (Manassas, VA)), MKN45 (įsigyjamas iš sveikatos mokslų mokslinių tyrimų išteklius banko (Osaka, Japonija)) ir TSGH (įsigyjamas iš Bioresource rinkimas ir mokslinių tyrimų centras (Hsinchu, Taivanas)) ir žmonių monocitine ląstelių linija THP-1 (perkama iš Amerikos tipas kultūros kolekcija (Manassas, VA)) ląstelės buvo auginamos RPMI-1640 terpe (Life Technologies, Inc, Rockville, MD) su 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS, gyvenimas Technologies, Inc. ) ir 2 mM L-glutamino (Life Technologies, Inc).

THP-1 ląstelės buvo pasėjamos į kultūros indai ir sukeliama atskirti į makrofagų inkubuojant su 100 ng /ml 12-o-tetradecanoylphorbol-13 acetatas (TPA, Sigma-Aldrich) 24 h. Makrofagų tris kartus buvo plaunamos su RPMI terpėje, turinčioje 10% FBS, inkubuojami šioje terpėje dar 24 h, siekiant pašalinti TPA poveikį ir inkubuojami laikmenų serumo neturinčioje dar 24 h. Surinkti ir sukauptos kultūros supernatantai buvo naudojami kaip makrofagų kondicionieriai terpės (cm), kaip aprašyta anksčiau. [5, 10]

neplatinimo /gyvybingumo tyrimą

GC ląstelės buvo pasėjamos 96 duobučių plokšteles ir bendro kultivuojamos su arba be makrofagų CM. Proliferacijos /gyvybingumas buvo nustatomas pagal kolorimetrinės analizėje, naudojant 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenyltetrazolium bromidas (MTT) (Sigma-Aldrich).

in vitro invazija Analizės

invazija tyrimas buvo atliktas naudojant transwell ląstelių kultūros rūmus (Millipore Corp Billerica, MA). Invazija ląstelės buvo skaičiuojami 400 × priartinimas 10 įvairių sričių kiekvieno įdėklu. Eksperimentas buvo pakartotas tris kartus.

RNR ekstrahavimas ir RT-PGR

Po stimuliacijos arba be makrofagų cm 6-h, GC ląstelės buvo surinkti ir bendras išskirta RNR naudojant Trizol Reagentų rinkinį ( Invitrogen, Karlovi Varai, Kalifornija) pagal gamintojo instrukcijas. kDNR buvo papildyta polimerazės grandininės reakcijos (PGR), naudojant pradmenis MMP7 (pirmyn: 5'-AGTCAATCCTGCCTTCTTAGCC, atvirkštinės: 5'-GCTCCCACCTTCCCTCTTGG), CD44 (pirmyn: 5'-TGCCGCTTTGCAGGTGTAT, atvirkštinės: 5'-TCCCATGTGAGTGTCTGGTAGC), ciklino D1 ( pirmyn: 5'-CCCAGCCATGGAACACCA, atvirkštinės: 5'-GGAGGGCGGATTGGAAATGA), c-MYC (pirmyn: 5'-AAAGAAGGTGTTGGGGTCGG, atvirkštinės: 5'-TGGCTCCCCCTGTTATTTGG) ir GAPDH (pirmyn: 5'-GGGTGATGCAGGTGCTACTT, atvirkštinės: 5'-GGCAGGTTTCTCAAGACGGA) .

Branduolinis ir citoplazmos Frakcijonuojant

Po stimuliacijos ar be makrofagų cm 6 valandas, GC ląstelės buvo lizuoti 300 iL lizės buferio ant ledo ir centrifuguojama, esant 5400 apsisukimų per minutę. Virš nuosėdų esantis skystis buvo surinkta kaip citozoliniame frakcija. Branduolinės frakcijos buvo surinkti, tada paleisti natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezės (SDS-PAGE) dėl Western Blot analizės.

Imunoblotingo analizė

Po stimuliacijos makrofagų CM, ląstelės buvo plaunamas PBS , mėšlą išmeta į Ripa buferio ir centrifuguojama. Mobilieji fragmentai buvo tiriami 10% SDS-PAGE ir perkelti į polivinilidenfluorido (PVDF) membraną (Millipore Corp.) Membrana buvo tyrinėjo naudojant pirminius antikūnus dėl beta-kateninai, AKT, ERK, JNK (SC1496, SC8312, SC154, SC474, Santa Cruz laboratorijos, Santa Krusas, Kalifornija, JAV), MMP7 (MAB3322, CHEMICON, Temecula, Kalifornija, JAV), CD44 (ab51037, Abcam, Cambridge, MA, JAV), c-MYC (GTX103436, GeneTex, Hsinchu Miestas , Taivanas), cikloniniai D1 (SC246, Santa Cruz laboratorijos, Santa Krusas, Kalifornija), β-aktino (ab8226, Abcam), HDAC1 p-AKT p-ERK, p JNK (SC7872, SC7985-R SC7383, SC6254, Santa Cruz laboratorijos, Santa Krusas, Kalifornija) ir antrinis antikūnas (Santa Krusas biotechnologijos).

imunocitocheminiais

Anti-bendras β-kateninai antikūnų buvo naudojamas kaip pirminio antikūno ir anti pelės imunoglobulinas G (IgG) Alexa 594 buvo naudojamas kaip antriniais antikūnais. Viršelio lapeliai buvo tada montuojamas naudojant montavimo terpėje, turinčioje DAPI branduolinės dažymo.

lentiviruso gamyba ir infekcija

Trumpas segtukas RNR (shRNAs) buvo įsigytas iš nacionalinės RNAi pagrindinę priemonę esant akademinio Sinica (Taipėjus, Taivanas). Tikslinė seka beta-kateninai shRNR 1 buvo 5'-CCGGTCTAACCTCACTTGCAATAATCTCGAGATTATTGCAAGTGAGGTTAGATTTTTG-3 "; kad beta-kateninai shRNR 2 buvo 5'-CCGGTTGTTATCAGAGGACT-AAATACTCGAGTATTTAGTCCTCTGATAACAATTTTTG-3 ". Lentiviruso vektorius ir jo pakuotės vektoriai buvo pernešta į 293T pakavimo ląstelių kalcio fosfato transfekciją. Trumpai tariant, 293T ląstelės buvo padalinti (10 ^{6) į 10 cm 2 patiekalai 1 dieną prieš transfekciją. Tada ląstelės buvo pernešta su 10 ľg shRNR vektorių ir 10 mikrogramų pCMVΔR8.91 (pakuotė vektorių) ir 1 mikrogramų pMD.G (vokas vektorių). Po to, kai 5 h inkubacijos, transfekcija vidutinės buvo pakeistas su šviežia auginimo terpėje. vėliau per keturiasdešimt aštuonias valandas, lentivirus-terpėje, turinčioje buvo surinkta iš transfekciją ir susuktų žemyn esant 1500 apsisukimų per minutę 5 min į granulių ląstelių nuolaužų, supernatantas buvo filtruojamas per 0,45-mikronų filtrą, ir tikslinės ląstelės buvo infekuoti švieži lentivirus, kurių sudėtyje yra vidutinio (papildyta 8 mikrogramai /ml polibrenui) 24 val.}

Statistinė analizė

Statistiniai analizė klinikiniais požymiais buvo padaryta naudojant χ ^{2 testą ir infiltracijos lygis tarp abi grupės buvo palyginti naudojant t-testas. Išgyvenimo kreivės buvo pastatyti naudojant Kaplan-Meier metodą ir statistinis reikšmingumas buvo analizuojami naudojant log-rank testą. P-reikšmė mažesnė nei 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas.}

Rezultatai

koreliacija Imunohistocheminiais kintamuosius Clinicopathologic Savybės GC ligonių

Imunohistocheminiais analizė parodė citoplazmos CD68 dažymo modelis už makrofagus. CD68 + makrofagai buvo platinamas visoje peritumoral ir naviką audiniuose, bet tik retai išsibarsčiusios normalios gleivinės (pav 1A-1C). Iš CD68 + makrofagų tankis buvo ypač didelis patologinis naviko 4 etapas (PT4) vėžinių pakitimų palyginti su PT1 pažeidimų (pav 1d). Norėdami nustatyti ryšį tarp klinikinių charakteristikų ir CD68 + makrofagų tankio asociaciją, skaičiavimai CD68 + makrofagų buvo skirstomi į tuos, aukščiau ir žemiau medianos reikšmės. buvo nustatyta, kad CD68 + makrofagų skaičius turi būti susijęs su naviko gylio ir etape (p = 0,001 ir p = 0,043, atitinkamai) (1 lentelė). Šis pastebėjimas rodo, kad CD68 + makrofagai gali būti svarbus skatinant naviko invaziją. Dėl išsamesnės analizės, Kaplan-Meier išgyvenimo kreivės buvo brėžiamas nustatyti makrofagų su išlikimo (2 pav) Asociacija. Iš CD68 + makrofagų tankis vėžinių audinių buvo neigiamai susijęs su bendrojo išgyvenimo (p = 0,0073). Pacientus, sergančius didelio skaičiaus Auglio CD68 + makrofagų turėjo trumpesnį bendrą išgyvenamumą nei tie, su mažomis skaičių CD68 + makrofagus.

Padidėjęs išraiška ir stipresnis signalas beta-kateninai nepastebėta IHC dažymo navikuose. Daugeliu atvejų, β-kateninai išraiška pirmiausia buvo įsikūrusi citoplazmą (pav 3A). Įdomu tai, kad stipri branduolinė dažymo β-kateninai GC ląstelių buvo susijęs su CD68 + makrofagų naviko pažeidimo, ypač prieš auglio invazijos (pav 3B). Remiantis šiais rezultatais, mes iškėlė hipotezę, kad makrofagų infiltracija gali aktyvuoti β-kateninai signalizacijos skrandžio naviko ląstelių, kurios vėliau greičiausiai veda į invazijai skrandžio piktybinių navikų.

Reikalavimas makrofagų naviko invazija į GC ir aktyvuotos makrofagų sukeltos invazija GC Cells

Jei toliau patvirtina savo klinikinius rezultatus in vitro
, mes pirmieji bendro išauginti makrofagai su skirtingais GC ląstelių linijas (AGS, N87, MKN-45 ir TSGH) , Visi GC ląstelių linijos išbandyti samdytų makrofagus migruoti ir makrofagų-įdarbinti gebėjimas buvo priklausomas nuo piktybinių vėžio ląstelių nustatytos pagal jų invazijos (pav 4A) laipsnį. [11] Norėdami įvertinti, ar įsibrovimo ar masinio GC ląstelės gali reglamentuoja makrofagų, AGS, N87, MKN45 ir TSGH buvo bendrai kultūringas su ir be makrofagų ar cm nuo makrofagų 24 val ir jų invazija ir platinimo galimybes išbandyti. Visi mobilieji tipai bendrai išauginti su makrofagų ar cm nuo makrofagų parodė netoli 2 kartus padidinti invazija ląstelių skaičius (palyginti su neigiamos kontrolės, p < 0,05), kuris nėra susijęs su jų platinimo galimybe (pav 4B-4D ).

Branduolinė perkėlimas beta-kateninai GC ląstelių Aktyvuotos Makrofagai

Mes atlikome in vitro bandymą suprasti, ar β-kateninai signalizacijos dalyvavo makrofagų aktyvuota GC ląstelių invaziją. Kaip parodyta Fig 5A, β-kateninai reaktyvumas buvo nustatyta, kad branduolinės frakcijos N87 ląstelių kaip pradžioje kaip 15 minučių po makrofagų CM gydymo, ir branduolinės β-kateninai proteinų padidėjo ir tam tikru priklausomu būdu. Laikantis šių išvadų, imunofluorescencinio parodė kaupimu ir branduolinės lokalizacijos beta-kateninai GC ląstelių bendrai išaugintų su makrofagų CM, palyginti su kontrolės cocultured į N87 (pav 5B). Šie rezultatai aiškiai rodo, kad tirpūs veiksniai, gautų iš makrofagų padėti tarpininkauti kaupimu ir branduolinės perkėlimą beta-kateninai GC ląsteles. Mes laikinai nuvertė ß-kateninai iki shRNR ir nustatė, sumažėjo β-kateninai baltymo ekspresija per 24 val. Genetinis abliacija beta-kateninai į N87 ląstelių nepavyksta padidinti po makrofagų CM gydymo savo invazinio galimybes. Priešingai, ne perkeltų ir kontrolės shRNR neturėjo į invazinių gebėjimų kaita N87 ląstelių pagal makrofagų CM gydymo (pav 5C). Branduolinės β-kateninai baltymų kiekis taip pat buvo padidintas AGS ir MKN45 ląstelės po makrofagų CM gydymo (S1 pav).

Poveikis makrofagų apie Išsireiškimas beta-kateninai ir tolesnio genų N87 Cells

įvertino tradicinis WNT /β-kateninai pasroviui genus MMP7, CD44, c-MYC ir cikloniniai D1 ryžtingas, jei jie yra aktyvuota makrofagus. MRNR ir baltymų lygiai MMP7, CD44 ir C-MYC genų visi buvo gerokai padidėjo N87 ląstelių inkubuojamos makrofagų cm, o nuo cikloniniai lygių D1 šiek tiek padidėjo (pav 6a). Po raginimo sumažėjo invazija veiklą nuo numušti ß-kateninai, MMP7, CD44 ir cikloniniai D1, bet ne C-MYC parodė baltymų žemyn Reglamento (pav 6B). Norėdami patvirtinti tarp invazijos galimybes ir MMP7 ir CD44 santykius, mes išbandė neutralizuojančių antikūnų gebėjimas blokuoti MMP7 ir CD44 veiklą. Invazija gebėjimas reikšmingai pažeista apdirbant 2,5 mikrogramai /ml anti-MMP7 ir 10 mikrogramų /ml anti-CD44 (pav 6c), atitinkamai, rodo abiejų genų dalyvavimą makrofagų aktyvuota GC ląstelių invaziją. Mes nustatėme, kad baltymų lygiai CD44 ir cikloniniai D1 genų buvo padidintos kitų GC ląstelių linijas (AGS ir MKN45) inkubuojamos makrofagų cm, bet MMP7 ir C-MYC nebuvo reikšmingas pasikeitė (S2 pav).

Kita pranešė apie galimą susikirtimo MAPK keliu su WNT /β-kateninai signalizacijos keliu. [12, 13] Todėl mes atlikome laikui bėgant tyrimą ir nustatė, kad tik PHOSPHO-AKT ir PHOSPHO-ERK išraiška buvo aktyvinama, kai gydomi makrofagų CM (S3A pav). Norėdami patvirtinti tarp AKT /ERK kelio ir beta-kateninai sąveiką, mes iš anksto apdorojamas ląsteles nei su ERK inhibitoriumi (U0126) arba AKT inhibitoriumi (LY294002). Sumažėjimas β-kateninai perkėlimas į branduolį buvo rasti tik ląstelių gydomi AKT inhibitorių, bet ne ERK inhibitorių, nurodant makrofagų-avtivated WNT /β-kateninai signalizacijos kelias gali būti reguliuojamas AKT (S3B pav). GC ląstelių, The AKT poveikis, atrodo, dominuoja makrofagų aktyvuota WNT /β-kateninai signalizacijos kelias. Ankstesni tyrimai taip pat rodo, kad TNF-α gaminamas makrofagų yra pagrindinis tarpininkas uždegimas ir gali skatinti β-kateninai veiklą vėžinių ląstelių. Mes nustatėme, kad naudojant neutralizavimo antikūnai prieš TNF-alfa į N87 slopinti β-kateninai aktyvavimo pagal poveikio makrofagų cm (S4 pav).

Diskusijos

naviko mikroaplinka yra ypatingai svarbi nustatyti leukocitų funkciją ir fenotipą. Prieštaringi duomenys parodė antitumorigenic arba protumorigenic funkcijas makrofagų ypač Tačiau mūsų duomenys rodo, makrofagai žaisti protumorigenic vaidmenį GC pacientams. Be auglių dauguma, TAM gaminti keletą veiksnių, kurie skatina navikų augimą bei angiogenezę daugybė. [14, 15] makrofagų infiltracija laipsnis į vėžio ląstelių lizdą taip pat yra reikšmingas prognostinis išlikimo GC pacientams. [16-18] IHC išvados šiame tyrime aiškiai įrodyti, kad makrofagų GC audinio tankis yra susijęs su klinikine etape (ypač naviko [t] etapas) ir išlikimo pacientams laipsnį. Dabartiniai tyrimai taip pat reiškia, kad makrofagai gali žaisti kenksmingų vaidmenis Išplėstinė GC. Ši išvada yra harmonijoje su studijų, rodančių, kad imuninė mikroaplinka gali būti protumoral o ne Antinavikinis, nepaisant kai kurių prieštaringų duomenų. [19, 20]

Branduolinė kaupimas beta-kateninai buvo pranešta maždaug trečdaliu skrandžio adenokarcinomos, abu žarnyno ir pasklidųjų tipai. [18] β-kateninai yra 92 kDa baltymas, kuris veikia tiesiogiai mobilųjį-to-ląstelių sukibimą. [21] mutacijos beta-kateninai ir nukrypusiu nuo normos išraiška jo baltymų buvo susijęs naviko invazija ir metastazių. [22, 23] mūsų IHC išvadas, β-kateninai buvo įsikūrusi tuo invazinio naviko ląstelių priešais branduolio, bet ne labiausiai centrinėje zonoje pirminius navikus, kur jis localizes į plazminės membranos , Šios pastabos taip pat gali būti rasta storosios žarnos vėžinių egzempliorių. [24] WNT /β-kateninai aktyvavimo vėžinių ląstelių esančių invazinių priekyje buvo postuluojama kaip svarbų žingsnį auglio augimą ir progresavimą. [25]

Įdomu tai, kad mes taip pat nustatė, ß-kateninai esančią naviko ląstelių branduolį su makrofagų esančių gretimai, tai rodo galimą ryšį tarp makrofagų ir branduolinio perkėlimas beta-kateninai vėžinių ląstelių. β-kateninai tuo invaziniam GCS priekyje iš dalies galima paaiškinti sąveiką per naviko mikroaplinka. Mes patvirtino in vitro
kad makrofagai padidinti invazijos gebėjimas GC ląsteles. Naudojant imunofluorescencinį confocal mikroskopą, mes nustatyti lokalizacijos ir kaupimą beta-kateninai į gydytų makrofagų branduolį. Taigi, mes įtariame, kad citokinai išskiriami makrofagų sukelti β-kateninai branduolinę perkėlimas į GC ląsteles, tokiu būdu didinant jų invazija galimybes. Invazinių epitelio navikų priekinio sudaro mikroaplinka, kurioje makrofagai bendrauti su parenchiminių ląstelių gaminti tarpląsteliniame ir išskyrė citokinus ir augimo faktoriai, kurie lokaliai skatinti ląstelių proliferaciją ir invazija. [26, 27] Tačiau, mūsų tyrimo duomenimis, padidėjo β-kateninai išraiška in vitro
nepakeitė platinimu, nurodant, kad pats, nepakanka padidinti naviko piktybinių navikų. Ši išvada taip pat įrodytas anksčiau, kad β-kateninai skatina tik sukibimo vietų, kurios sudarys iš pagrindų ir stimuliuoja krypties migraciją ir invazija į gaubtinės žarnos vėžio ląstelėse, bet ne dalyvauja skrandžio ir prostatos vėžinių ląstelių dauginimąsi. [28-30] Nepaisant to, STROMA paracrine moduliavimas WNT signalizacijos epitelio ląstelių tikėtina koordinuoja sudėtingesnio tinkle skatinti ir slopina sekreciją veiksnius. Tolesni poveikis įvairių lygių WNT /β-kateninai signalizacijos (ir ypač poveikį ląstelių proliferacija, EMT ir vietos invazija) yra kol kas sunkiai suprantamas. β-kateninai translocates į branduolį, kur ji jungiasi su transkripcijos veiksnių T ląstelių faktoriaus /limfocitų stipriklis koeficiento (TCF /LEF) šeimos ir pradeda transkripciją tikslinių genų, pavyzdžiui, , cikloniniai D1
C- Myc parsisiųsti ir , MMP-7
[31, 32], dalyvaujančių platinimu, naviko invazija ir metastazių. [33, 34] Mūsų išvados rodo, kad signalizacijos keliai, per kuriuos makrofagų sukelti ß-kateninai taip pat sukelti išraiška tikslinių genų. Suderinamas su mūsų ankstesniame darbe [5], MMP-7 ir CD44 buvo du PGR matricos, nustatytos po coculture su makrofagų kaip skirtingai išreikštas genų, susijusių su metastazėmis GC ląsteles. Degradacija matriksą medijuojamų matrikso metaloproteinazių (MMP) yra esminis mechanizmas metu naviko invazija ir metastazių. Toks skaidymas yra būtina sukurti mikroaplinka, kuri palaiko pirminių auglių ir metastazių augimą. Vėliau β-kateninai /TCF kompleksas aktyvina daug onkogenų, įskaitant VEGF, c-myc, c-jun, fra-1 ir gastrinas, kad taip pat gali būti įtraukta į makrofagus aktyvuota β-kateninai tolesniems renginiams. [35]

maršrutų įvairovė greičiausiai moduliuoti WNT /β-kateninai kelią ir reguliavimas β-kateninai signalizacijos gali būti panašiai sudėtinga. Naujausi tyrimai nustatė, kad makrofagų CM sukelia ERK kelią ir WNT aktyvuoja ERK endotelio ląstelių. [36, 37] Čia, mes nustatėme, kad makrofagai sukelti fosforilinimo tiek ERK ir AKT GC ląsteles. Mes parodė, kad gydymas AKT inhibitorių, bet ne ERK inhibitorių mažina β-kateninai perkėlimas. Šie rezultatai rodo, kad Akt vaidina vaidmenis makrofagų aktyvuota β-kateninai signalizacijos skrandžio ląstelių tipų.

Išvados

Bendrai klinikiniai duomenys rodo, kad makrofagų infiltracija koreliuoja su padidėjusiu lygio ir prastesne prognozavimas GC pacientai, kuriems buvo atlikta radikali rezekcija. Makrofagai gali sukelti GC invazinis aktyvuojant β-kateninai kelią. Todėl makrofagų infiltracija ir slopinimo aktyvavimo β-kateninai kelio slopinimo atstovauti galimas strategijas gydymo GC.

Pagalbinė informacija
S1 pav. . Poveikis makrofagų CM ant β-kateninai keliu
β-kateninai kaupiasi branduolio po gydymo makrofagų cm 30 min AGS ir MKN45 ląstelių
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0134122.s001
(TIFF)
S2 pav. Poveikis makrofagų CM baltymų raiškos beta-kateninai žemyn srauto genus AGS ir MKN45 ląstelių
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s002
(TIFF)
S3 pav. (A), makrofagų CM sukeltas AKT ir ERK aktyvinimą į N87 ląsteles. (B), N87 ląstelės buvo iš anksto gydomi 10 mikromolių iš β-kateninai inhibitoriais. LY294002 ar U0126 1 valandą, tada išauginti į makrofagų CM akivaizdoje už 1 papildomą valandą
AKT, ERK ir β-kateninai baltymų raiška lėmė Vakarų dėmė
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0134122.s003
(TIFF)
S4 pav. . Neutralizuojančių antikūnų prieš TNF-alfa
N87 ląsteles iš makrofagų CM buvimo 24 valandas iš anksto buvo apdorotas arba be TNF-alfa inhibitorių 1 valandą
doi:. 10,1371 /journal.pone.0134122.s004
(TIFF)

• PLoS ONE: PRR11 Ar prognostinis žymeklį ir potencialas onkogeno pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu
• PLoS ONE: limfmazgių metastazių unikalus Nepriklausomas prognostinis faktorius ankstyvo skrandžio vėžio