PLoS ONE: Obnova Mir-1228 * Expression Potiskuje epitelnih-mczcnhimnog tranzicije u želučani Cancer

Sažetak pregled

nereguliranom miRNAs igraju ključne uloge u karcinogeneze i progresiju raka. U ovom istraživanju, funkcija Mir-1228 * u kojim se uređuje napredovanje raka je istraživana u raka želuca. Smanjena ekspresija Mir-1228 * zabilježeno je u ljudskim tkivima s rakom želuca usporedbi s normalnim tkivima. Nakon toga, uloga Mir-1228 * procijenjena je in vivo pregled pomoću tumor modelu ksenografta. U ovom modelu, miR-1228 * hiperekspresija potisnuti nastajanje ksenograft tumora. Nadalje, pokazali smo Mir-1228 * negativno regulira NF-kB aktivnost u SGC-7901 stanica raka želuca i utvrdili da CK2A2 bio meta Mir-1228 *. Doreguliranje miR-1228 * smanjio ekspresiju mezenhimalnih markera i povećao epitela oznake E-kadherin, što ukazuje na njegovu potencijalnu ulogu u suzbijanju prijelaz epitelnih-mezenhimalnih. Zajedno, ovi rezultati pružaju prvi dokaz da je Mir-1228 * igra važnu ulogu u regulaciji rasta karcinoma želuca i sugeriraju da selektivno obnova Mir-1228 * može biti koristan za želučane terapiju raka pregled

Izvor:. Jia L , Wu J, Zhang L, Chen J., Zhong D, Xu S, et al. (2013) Obnova Mir-1228 * Expression Potiskuje epitela-mczcnhimnog Tranzicija u rak želuca. PLoS ONE 8 (3): e58637. doi: 10,1371 /journal.pone.0058637 pregled

Urednik: Hiromu Suzuki, Sapporo Medicinski fakultet, Japan pregled

Primljeno: 25. listopada 2012. godine; Prihvaćeno: 5. veljače 2013; Objavljeno: 12. ožujka 2013 pregled

Copyright: © 2013 Jia i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Autori nemaju podršku ili sredstva za prijaviti pregled

suprotstavljenih interesa.. autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

mikroRNA (miRNAs) su klasa kratko ( 20-23 nukleotida), endogeni, jednolančane RNA koji reguliraju ekspresiju gena koji uzrokuje prijevodni represije ili mRNA degradacije [1], [2]. Preko molekulskih mehanizama, miRNAs posjeduju normalne biološke funkcije, kao što je regulaciji stanične proliferacije, diferencijacije i apoptoze. Štoviše, nereguliranom miRNAs pokazalo se da igraju ključne uloge u reguliranju karcinogeneze i napredovanja raka [3], [4]. Abberant miRNAs izraz uočene su u mnogim vrstama zloćudnih bolesti, uključujući rak želuca [5]. Pregled

epitela-mezenhimalne prijelaza (EMT) je biološka reprogramiranje događaj koji omogućuje epitelnih stanica proći više biokemijske promjene steći mezenhimalne stanicu fenotip. Dok EMT je kritična za odgovarajući embrionalnog razvoja, povećanje dokaza sugerira da je nenormalna aktivacija EMT dovodi do progresije malignih tumora [6]. Pokazano je da EMT ključni postupak doprinosi razvoju karcinoma, naznačen time, gubitak epitela markera E-kadherina, povećanje mezenhimskog marker vimentin, i povećanje migracije i invazivno ponašanje [7] [8]. pregled

U našem prethodnom istraživanju, analizirajući Mirne niz sfera raka gušterače, mir-1228 * pronađeno je kao jedan od karcinoma povezanih miRNAs (podaci nisu prikazani). Ovdje, pod uvjetom da dokaze da je Mir-1228 * je dolje regulirana u želučanom tkivu raka u usporedbi s normalnim tkivom. Obnova izraz Mir-1228 * u želučanim stanicama raka značajno inhibiraju migraciju stanica i rast tumora. Mehanički, pokazali smo da Mir-1228 * inhibira NF-kB aktivaciju i potencijalno smanjuje EMT. Pregled

materijali i postupci

Kultura stanica pregled

Ljudski rak želuca stanične linije SGC-7901 , AGS i BGC-823 kupljeni su iz Instituta za biokemiju i staničnu biologiju (kineske akademije znanosti). Jedna normalna želučanog epitela stanična linija GES-1 je kupljen od Beijing Institute for Cancer Research. Stanice su održavane na 37 ° C u 5% CO2 inkubatoru na RPMI-1640 (sGC 7901 i BGC-823), F-12K (AGS) ili DMEM (GES-1) medij, uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma [ ,,,0],9], [10]. pregled

kliničkim uzorcima

Pedeset para raka želuca i uzoraka tkiva susjednih non-raka su dobiveni od bolesnika podvrgnutih kirurškom resekcija kod povezanih bolnici Drugog, College of medicine , Zhejiang University. Podudarnog bez raka susjedna tkiva dobiveni su na minimalnoj udaljenosti od 5 cm od mjesta tumora. Niti jedan od pacijenata bilo je podvrgnuto radioterapiju ili kemoterapiju prije operacije. Uzorci tkiva se prikupe, smrznuti u tekućem dušiku, te spremljeni na -80 ° C, do upotrebe, [11]. Svi tkiva su histološki potvrđeno da je želučani adenokarcinoma. Istraživanje je odobreno od strane Drugog SRODNE bolnice etičkog povjerenstva Zhejiang University College of Medicine. Potpisani informirani pristanak dobiven je od svih sudionika i predstavnika pacijenata, ako se ne mogu dobiti izravan pristanak. Pregled

RNA ekstrakcija i real-time PCR pregled

Ukupna RNA je ekstrahirana iz kultiviranih stanica ili tkiva pomoću Trizol (Invitrogen), a koncentracija ukupne RNA je određena. Sinteza cDNA i u realnom vremenu PCR-a korištenjem TaqMan mikrornk reverzne transkripcije Kit (Applied Biosystems) i pribor za pokus TaqMan mikrornk (Applied Biosystems), respektivno. Realnom vremenu PCR proveden je na Applied Biosystems StepOnePlus ™ u realnom vremenu PCR sustavu prema protokolu. Razina izraz Mir-1228 * normalizira se RNU6B. Real-time PCR reakcije provedene su u triplikatu. Relativna izraz miRNAs je izračunata primjenom komparativne Ct metode [12]. Pregled

Test tumora inokulacije na miševe

BALB /c atimičnih golih miševa u dobi od 4 tjedna su kupljeni od Šangaj Laboratorij centar za životinje (kineske akademije znanosti). Svi postupci koji uključuju životinje su odobreni od strane pokusnoj životinji Etičkog povjerenstva, College of Medicine, Zhejiang University. Mir-1228 * ili miR-NC stabilne transfekcije sGC 7901 stanica suspenzije (2,5 × 10 ^{7 stanica /ml) u 200 ul medija bez seruma supkutano su injicirane u bočne golih miševa, respektivno. Rast tumora je ispitana dvaput tjedno tijekom 5 tjedana, a volumen tumora (V) je praćena mjerenjem duljine (L) i širinu (W) tumora s čeljusti i izračunava formula V = 1/2 (L × W × W) [13]. pregled}

Cell migracija pregled

migracija sposobnost Mir-1228 * ili Mir-NC stabilne transfekcije SGC-7901 stanica su detektirane Transwells (8 mm veličine pora, Corning). A Transwells bili stavljeni u 24 jažica. Svježe tripsinizirane i isprane stanice su suspendirane u 100 jal RPMI1640 seruma koji sadrži 1% fetalnog goveđeg seruma. Oko 1 × 10 ^{5 stanica /jamici stavi se u najgornju komoru svaki umetak. 200 jal RPMI1640 koji sadrži 20% fetalnog goveđeg seruma doda se u donje komore. Nakon inkubacije tijekom 24-48 sati pri 37 ° C u CO s 5% _{2 vlažnom inkubatoru, stanice su fiksirane s 95% apsolutnog alkohola i obojeni Kristal violet bojom [14]. Stanice u unutarnjoj komori su uklonjene pamučnom krpom i stanice pričvršćeni na donjoj strani membrane, su izbrojene i promatrani pod invertiranog mikroskopa na × 200 povećanjem više od pet slučajnih polja za svaku jažicu. Svaki eksperiment izveden trostruko. Pregled}}

Western blot pregled

Ukupno proteina je mjerena pomoću BCA kit (Pierce) prema protokolu proizvođača. Proteini stanice su frakcionirani elektroforezom na 12% SDS poliakrilamidni gel i elektro-nanesene na nitrocelulozne membrane (NC) 2,5 sata pri 200 V. NC Membrane su inkubirane s puferom za blokiranje tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi, a zatim preko noći tretiranje s primarnim antitijelom na 4 ° C, a zatim sa HRP-konjugiranih sekundarnih antitijela (MBL). Nakon ispiranja, reaktivno su detektirani pomoću ECL Western blot otkrivanje kita (Millipore), u skladu s uputama proizvođača. Antitijela koja se koriste u ovom eksperimentu su zečji monoklonsko anti-E-kadherin (Epitomics), anti-vimentin (Epitomics), anti-β-katenina (Epitomics), anti-puž (Cell Signaling), anti-cjevčica (Cell Signaling), anti -ZEB1 (Cell Signaling), anti-ZEB2 (Santa Cruz), anti-CK2A2 (Santa Cruz) i mišjeg anti-GAPDH (KangChen Biotech).

Imunohistokemija pregled

Parafinski rezovi, 3- um debljine, pečena su 2 sata na 60 ° C i deparafmizirani. Antigen dohvat je izvedena korištenjem citratnog natrij pufera (pH 7.2) na 95 ° C tijekom 15 minuta, a zatim su ohlađeni stakalca na sobnoj temperaturi 30 minuta. Poslije tretmana sa 3% -tnim vodikovim peroksidom na 15 minuta da se blokira endogene peroksidaze, sekcije su tretirani s normalnim kozjim serumom graničnim tekućina tijekom 30 minuta kako bi se smanjilo nespecifično vezanje i zečje poliklonalno anti-E-kadherin (Santa Cruz) i zečji monoklonsko anti-vimentin (Epitomics) se inkubira u odjeljcima 12 h na 4 ° C. Nakon rewarming 1 h i pranje za 5 puta, sekcije su inkubirane s sekundarnih antitijela tijekom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Diaminobenzidin je korišten za reakcije u boji. Pregled

plazmida graditeljstva i Cell TRANSFICIRANJE pregled

Mir-1228 * Vektor ekspresije (Mir-1228 *) ili negativna kontrola (Mir-NC) konstruirana je kloniranje kali nukleotida koje su sadržavale optimiziran mir-1228 * matičnih petlje (oligonukleotidi su dizajnirani kao: top cjedilu, 5'-TGC TGG TGG GCG GGG OKS GGT GTG TGG TTT TGG CCA CTG ACT GAC CAC ACA CCC CCC CGC CCA C-3 ';. dno cjedilu, 5'-CCT GGT GGG CGG GGG GGT GTG TGG TCA GTC AGT GGC CAA AAC CAC ACA CCT GCC CCC GCC CAC C-3 ') ili negativna kontrola matičnih petlje u pcDNA6.2-GW /EmGFP vektor ( Invitrogen) [15]. 2-kb miR-1228 * promotora regiju je pojačan (Klice su konstruirane kao: naprijed, 5'-ATC GGT TAG CTC ACC ACT TGG AG CCA CAC AGA-3 ', obrnuti, 5'-TGA GAC AGA TCT ACC TCA AGA GTT GGG GTG TG-3 '.) i coloned da pGL3-Enhancer vektor (Promega) [16], nazvana kao pGL3-mir-1228 * -promoter. Prazni pGL3 pojačivački vektor djelovao kao negativne kontrole (pGL3 kontrola). Mir-1228 * meta područje CK2A2 3'UTR slijed kemijski sintetiziran Shanghai Biotech i umetnut nizvodno od plazmida luciferaze pMIR-izvješće (Applied Biosystems), nazvana kao pMIR-CK2A2. PReceiver-c-rel ORF klon s GFP-tag je kupljen od GeneCopoeia. Za dobivanje stabilnih transfektiranih stanica, Mir-1228 * i miR-NC ekspresijski konstrukti transfecirani su u staničnu liniju SGC-7901 pomoću Lipofectamine 2000 (Invitrogen) prema uputama proizvođača. Nakon 48 sati, blasticidin (14 ug /ml) je dodan u medij. PGL3-miR-1228 * -promoter /kontrola, GFP-c-Rel /kontrola, pMIR-CK2A2 /kontrola ili NF-kB reporter vektor (Promega) su kratkotrajno transfektirane u SGC-7901 stanice pomoću Lipofectamine 2000, PRL-TK ( Promega) je korišten kao interni normalizacija [17]. pregled

Luciferase Reporter Assay pregled

luciferaze je analiza provedena u SGC-7901 stanice. Stanice su isprane s PBS dva puta i lizirane u pufera za pasivnu razgradnju (Promega) i aktivnosti luciferaze mjerena je sa 20 ul lizata korištenjem Dual-Luciferase reporter Assay System (Promega) na GloMax 20/20 luminometru (Promega). Svi podaci su dobiveni kao srednja vrijednost rezultata iz najmanje tri neovisna ponavljanja. Pregled

Statistička analiza pregled

Razlike između razine ekspresije Mir-1228 * kod pacijenata s rakom želuca određeni su pomoću Wilcoxon potpisan-rank test. Klinički podaci su analizirani korištenjem hi-kvadrat testa. T-test i ANOVA bili zaposleni analizirati in vitro
i in vivo
podatke. Sve P
vrijednosti su obostrani i razlike su definirani kao statistički značajni za P izvoznici < 0.05. Rezultati su analizirani pomoću SPSS V.16.0 softvera (SPSS Inc.). * P < 0,05, ** P < 0.01. Pregled

Rezultati pregled

Mir-1228 * je često Down regulirano u ljudskoj rak želuca Netlogu

Kao prvo, kako bi se utvrdilo da li je Mir-1228 * različito izražen u ljudskoj primarnoj karcinome želuca, razina ekspresije zrelog miR-1228 * ispitana je pomoću TaqMan PCR u realnom vremenu na 50 parova humanim tkivima raka želuca i par podudara susjedna netumorskih želučane tkiva. Naši rezultati pokazuju da je razina ekspresije Mir-1228 * je značajno smanjen u želučanim tkiva raka u usporedbi sa susjednim noncancerous želučanog tkiva (Sl. 1). Oko 72% uzoraka tumora bile su niže izražen Mir-1228 * (Sl. 1b). Koristeći 2 ^{-ΔΔCT vrijednosti, fold promjenu Mir-1228 * < 1,0 se smatra kao niska, dok je > 1.0 je bio smatran visoku ekspresiju [18]. Mir-1228 * ekspresija također je procijenjena u želučanim staničnih linija raka i jedan imortalizirane normalno želučane sluznice stanična linija epitelnih stanica (GES-1). Kao što je prikazano na slici. 1C, Mir-1228 * bila je značajno niska ekspresija u svim staničnim linijama karcinoma u usporedbi s GES-1. Uzeti zajedno, ovi rezultati pružaju snažne dokaze da je Mir-1228 * je dolje regulirano na rak želuca. Pregled}

Nadalje, Mir-1228 * izraz su ocijenjeni s obzirom na kliničkopatološkim karakteristikama bolesnika. Svi su bolesnici imali udaljenih metastaza i sva tkiva su histološki potvrđena želučanog adenokarcinoma. U svim slučajevima (n = 50) su podijeljeni u dvije skupine: miR-1228 * niska ekspresija (n = 36) i miR-1228 * visoke ekspresije (n = 14). Mir-1228 * niske ekspresije grupa imala sklonosti prema većoj veličini tumora. Međutim, nije bilo značajnih odnosa između Mir-1228 * izražavanja i drugih kliničko značajke kao što su dob, spol, histološkom tipu ili TNM fazi (Tablica 1). Pregled

Povećana Mir-1228 * Expression Potiskuje tumorskih Formiranje pregled

kako bi se procijenio funkcionalnu ulogu Mir-1228 * kod raka želuca, optimizirani Mir-1228 * matičnih petlje se klonira u pcDNA6.2-GW /EmGFP vektora. Želučani stanična linija SGC-7901 stanice su transfektirane s pcDNA6.2-GW /EmGFP-miR-1228 * ili pcDNA6.2-GW /EmGFP-NC vektor i stabilne stanične linije su generirane i nazvan miR-1228 * ili miR-NC, odnosno. Kao što se očekivalo, RT-PCR analiza pokazala je da je Mir-1228 * stabilne stanice imala je porast od zrelog Mir-1228 * izražavanja kada se uspoređuju s Mir-NC stabilnih stanica (Sl. 2). Nije bilo promjena morfološka u Mir-1228 * stabilne transficiranih stanica u usporedbi s nontransfected stanica. SGC-7901 stanica sa ili bez transfekcijom Mir-1228 * su implantirani supkutano u bokovima golim miševima procijeniti potencijalne učinke Mir-1228 * na rast raka želuca in vivo pregled. Prekomjerna ekspresija Mir-1228 * značajno potisnuti rast tumora (Sl. 2b). Na kraju eksperimentalnog perioda, veličina i težina vlažnog tumora s Mir-1228 * prekomjerna ekspresija bila je značajno manji i niži nego u kontrolnoj skupini (Sl. 2C-D). Dakle, podaci pokazuju da je Mir-1228 * sprečava rast tumorskih želučanih stanica raka in vivo pregled. Pregled

NF-kB Aktivacija je odgovoran za Lower iskazivanje Mir-1228 * u želučanom Rak pregled

U zadnje vrijeme je pokazalo da većina miRNAs imaju faktor transkripcije (TF) vezna mjesta i mnoge studije su izvijestili da miRNAs može se regulirati TFS [19]. Ovdje ćemo se koriste za bioinformatiku programi (Promotor 2.0 i P-match) identificirati potencijalne regulatora Mirna-1228 * [16], [17]. Pronašli smo tri c-rel domene za vezanje u 2-kb Mir-1228 * promotorska regija (sl. 3a). Budući da c-rel podjedinica je član obitelji NF-kB i hipcraktivnosti aktivnosti NF-kB je pokazano da je povezan s rakom želuca [20], [21]. Mi smo pretpostavili da je NF-kB aktivacije pripisuje se silazni Mir-1228 * u raka želuca. pregled

Da bi dokazali hipotezu, stvorili smo luciferaze konstrukt s Mir-1228 * promotorske regije i vrednovati svoje djelovanje u odgovoru na NF-kB aktivacije. Eksperiment je proveden kultiviranjem SGC-7901 stanica za 8 sati u prisutnosti TNF-a (50 ili 100 ng /ml, klasični NF-kB put aktivatora) i /ili pirolidinskom ditiokarbamata (PDTC, 100 uM), široko upotrebljavani inhibitor faktora transkripcije NF-kB [22]. SGC-7901 stanice su transficirane s pGL3-Mir-1228 * -promoter ili pGL3 kontrola, nakon 24 sata, transficirana SGC-7901 stanice su izložene tijekom 8 sati, da bi TNF-a sa i bez PDTC istražiti da li NF-kB aktivacije regulira mir-1228 * promotor aktivnost. Uočili smo da je TNF-a tretman značajno inhibira Mir-1228 * promotor aktivnosti i inhibicija NF-kB s PDTC spriječiti TNF-a posredovan downregulation od razina aktivnosti (sl. 3b), što ukazuje da NF-kB može negativno regulirati miR- 1228 * izraz. Kako bi se dodatno utvrditi da li NF-kB podjedinica c-rel je odgovoran za deregulating Mir-1228 *, transfektirane smo SGC-7901 stanice Mir-1228 * -promoter sa ili bez GFP-c-REL i primijetio značajan pad aktivnosti luciferaze u GFP c-rel skupina od kontrole (Sl. 3C). Zajedno, podaci ukazuju da NF-kB podjedinica c-rel funkcionalno doprinosi silazni Mir-1228 * kod raka želuca. Pregled

Mir-1228 * Smanjuje NF-kB aktivnosti i CK2A2 izražavanja u SGC-7901

kako bi se istražio utjecaj Mir-1228 * na NF-kB signalnog puta, NF-kB reporter konstrukti klonovi ubačeni u bilo Mir-1228 * ili Mir-NC stabilno transfektirane SGC-7901 stanice i aktivnost NF-kB luciferaze je određena nakon 48 sati. Naši rezultati pokazuju da je aktivnost NF-kB je značajno smanjio prekomjernom ekspresijom Mir-1228 * (Sl. 4a), što ukazuje na negativna povratna sprega između Mir-1228 * ekspresije i aktivnosti NF-kB. Kako bi se dodatno utvrditi nizvodnih ciljeve Mir-1228 * u NF-kB puta, proveli smo bioinformatičkih analizu i utvrdili CK2A2 je bio jedan od navodnih ciljnih gena koji su bili predviđeni. Korištenje Miranda i RNA22 [23], [24], koji se nalazi se jedan potencijalni vezanja za Mir-1228 * na 3'UTR CK2A2 (Sl. 4B). CK2A2 jedna podjedinica protein kinaze CK2 koji je uključen u NF-kB puta [25], [26] i njegova ekspresija je primijećeno da se viša u nekoliko vrsta raka, uključujući rak želuca [27], [28]. Daljnja istraživanja o povezanosti CK2A2 i Mir-1228 * pokazala je da je razina proteina u CK2A2 je istodobno regulirati na dolje na Mir-1228 * stabilne prekomjernom ekspresijom u SGC-7901 stanica (Sl. 4c). Kako bi provjerila je li CK2A2 je pravi cilj Mir-1228 *, segment CK2A2 3'UTR sadrži vezno mjesto je kloniran u 3'UTR gena luciferaze u pMIR-REPORT plazmida [29]. Fluorescentni intenzitet reporter-gena znatno smanjena u skupini koja je istovremeno transfektirana pMIR-CK2A2 i miR-1228 * u odnosu na kontrolu (Sl. 4D). Ovi rezultati sugeriraju da je Mir-1228 * interakciju s CK2A2 mRNA 3'UTR. Pregled

Mir-1228 * Koči EMT pregled

On je izvijestio da aktivacija NF-kB igraju važnu ulogu u EMT progresije raka [30], [31], te inhibicija NF-kB aktivnosti u nekih staničnih linija tumora uzrokovana obrat EMT [32]. Od Mir-1228 * Čini se da negativno regulira NF-kB aktivnost, mi, dakle, istražuju, ako Mir-1228 * može negativno regulirati EMT u raka želuca. Western blot je pokazala da prekomjerna ekspresija Mir-1228 * u SGC-7901 stanica dolje regulirane mezenhimalne markeri (vimentin, β-katenina, puževa, cjevčica i ZEB1 /2), dok se regulira prema gore epitela marker E-kadherina (Sl. 5A ). Nadalje, miR-1228 * hiperekspresija uzrokovala smanjenje stanične migracije (Sl. 5B-C). Imunohistokemijska bojanja je korištena da bi dodatno potvrđuju EMT-srodnih proteina promjene Mir-1228 * transfektirane SGC-7901 stanica u modelu ksenografta. Pokazano je da ekspresija vimentin smanjen i ekspresija E-kadherina povećana u usporedbi s kontrolnim stanicama koje u (Sl. 5D). Na sličan nalaz zabilježen je u drugom želučanog raka stanične linije AGS (sl. S1). Podaci predstavljaju prvi dokaz da Mir-1228 * restauracije kod raka želuca negativno regulira EMT. Pregled

Rasprava pregled

Rak želuca je četvrti najčešći zloćudni tumor u svijetu i trenutno je drugi vodeći uzrok rakom smrtnost [33], [34]. Iako sadašnja praksa koja kombinira kemoterapije ili terapije zračenjem kod kirurške resekcije uvelike povećao ukupno preživljenje pacijenata s rakom želuca, ukupna stopa preživljenja od 5 godina i dalje je niska. Želuca karcinogeneze se smatra faktora i više koraka koji obuhvaća aktivaciju onkogena i inaktivaciju gena za suzbijanje tumora [35]. Pregled

miRNAs su endogeni non-protein-kodirajuće kratke RNA koje igraju važnu ulogu u staničnom fiziologija, razvoj i bolesti koje negativno reguliraju ekspresiju gena. Analize Mirna ekspresije profila pokazala su da mnogi miRNAs neprirodno izraženi i korelaciji s tumorigenezi, napredovanje i prognozi različitih hematoloških i solidnih tumora, uključujući rak želuca [36]. Kako prepoznati i rasvijetliti biološke funkcije miRNAs deregulacija u rak želuca može nam pomoći da bolje razumijemo patogenezu ove smrtonosne bolesti i daje nove mogućnosti za razvoj Mirna-based terapije. Primjerice miR-221 i miR-222 pokazano je da je pozitivno regulira proliferaciju i invaziju stanica raka želuca, što upućuje kako odabrati inhibicija tih miRNAs biti koristan za liječenje raka želuca [37]. miRNAs igraju ulogu u etiologiji i patogenezi raznih vrsta raka ciljajući niz onkogena ili potiskivača gena tumora. Mir-21 je izraženo u inficirane s H. pylori želučane sluznice želuca i tkiva raka. Prisilni izraz Mir-21 povećava invazivnost želučanih stanica raka, Reck je izravna meta Mir-21 [38]. Mir-218 inhibira invaziju i metastaziranje raka želuca ciljanjem Robo1 receptora [39]. Ueda et al [40] identificirati 22 regulira prema gore i 13 dolje regulirana miRNAs u rak želuca u odnosu na ne-tumorske sluznice, Low izražavanja neka-7g i Mir-433 i visoku ekspresiju Mir-214 bili su povezani s nepovoljnim ishodom u ukupnom poretku opstanak nezavisne kliničkih kovarijanata, uključujući i dubini invazije, limfnih čvorova metastaza, te faze. Mir-375 je često dolje regulirano raka želuca i funkcije kao supresor tumora regulirati želučane proliferaciju stanica raka potencijalno ciljanjem JAK2 onkogena [10]. Naša druga studija pokazala je Mir-1228 * je jedan epitelni karcinom vezane Mirna (neobjavljeni). Međutim, samo nekoliko istraživanja Mir-1228 * su izvijestili. Guled sur [41] pokazalo je da Mir-1228 * je vrlo izražena u malignim uzorcima mesothelioma u usporedbi s normalnim uzorcima. Ali biološka funkcija ovog Mirni još nije procijenjena. U ovom istraživanju, identificirali smo da je Mir-1228 * je dolje regulirana u više od 70% uzoraka karcinoma želuca u usporedbi s njihovim nontumor kolegama i pružiti eksperimentalne dokaze da to može funkcionirati kao supresor tumora kroz negativno regulira EMT i inhibira NF -κB aktivnost. pregled

Naši podaci naznačeno downregulation Mir-1228 * u želučanim tkiva raka i rak želuca staničnim linijama. Razne molekularni mehanizmi dovode do Mirne poremećajem, kao što su genetske mutacije, epigenetičke aberacije i deregulirano transkripcije aktivnosti [42]. TFS može regulirati izražavanje Mirna vezivanjem na promotorske regije, bilo u fiziološkim ili patološkim situacijama [43]. Da bi istražili kako Mir-1228 * je deregulirano kod raka želuca, analizirali smo promotora regiju 2-kb uzvodno od Mir-1228 * i pronašao tri pretpostavljena c-rel vezne domene. Iako NF-kB je najpoznatiji po svojoj aktivacije transkripcije funkcije, nedavni rad sa P65, RelB i c-rel pokazala da NF-kB može se regulirati specifične gene [17], [44], [45]. Korištenje Mir-1228 * konstrukt promotor-reporter koji je sadržavao 2-kb fragmenti Mir-1228 * promotora, otkrili smo da NF-kB put aktivator TNF-α smanjio Mir-1228 * aktivnost promotora. A NF-kB inhibitor PDTC izuzetno antagonizirati TNF-α posredovane Mir-1228 * promotor niske aktivnosti. Naši podaci također pokazuju da su c-rel bio u stanju izravno vezan uz Mir-1228 * promotora i negativno reguliraju svoj izraz. Budući da je c-rel podjedinica je član obitelji NF-kB, NF-kB aktivacije phenocopied učinke c-rel u reguliranju Mir-1228 * izraza, što ukazuje da NF-kB put negativno je bio uključen u silazni Mir-1228 * kod raka želuca. Nadalje, Mir-1228 * prekomjerna ekspresija također je rezultiralo u smanjenom aktivnosti NF-kB. Dakle, naši podaci opisuju dvostruko negativna povratna sprega između NF-kB i Mir-1228 *. Točan mehanizam kako je to negativna povratna javlja potreba da se dalje istražuje. Pregled

CK2A2 je jedna podjedinica protein kinaze CK2, što je vrlo očuvan i sveprisutni protein serin /treonin-kinaza. Pojačanom ekspresijom CK2 uočen je u određenom broju oblika raka, uključujući i one iz žljezdanog tkiva dojke, prostate, bubrega, pluća, glave i vrata, i želuca [27], [46]. Pojačanom ekspresijom CK2 u mliječnim žlijezdama transgenskim miševima uzrokuje hiperplaziju i displazija koje na kraju dovodi do adenokarcinoma [47]. CK2 su izraženo u glavu i vrat linijama karcinoma pločastih stanica i tkiva. Obaranje CK2 podjedinica različito inhibirana IκBα razgradnje, NF-kB nuklearnu lokalizaciju, fosforilacije, vezanje DNA, a novinar aktivnosti [25]. CK2 igra važnu ulogu u HER-2 /neu signalizacije, promicanje IκB degradaciju i NF-kB aktivaciju [26]. U ovom istraživanju, pokazali smo da miR-1228 * smanjuje ekspresiju CK2A2 na razini proteina. Test luciferazu s novinarom koji sadrži Mir-1228 * obvezujući slijed na 3'UTR CK2A2 mRNA predložio da Mir-1228 * izravno cilja 3'UTR CK2A2. Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da je supresija aktivnosti NF-kB by Mir-1228 * može biti kroz ciljanje izraz CK2A2. EMT sada se zna da se pojavljuju u različitim bolestima, uključujući napredovanja raka. Poznato je da je EMT je važan proces u obliku difuzno histologiju i inicirati metastaziranje povećanje pokretljivosti tumorskih stanica [48]. EMT je regulirano različitim onkogena signalnih puteva, kao što su AKT i NF-kB [49], [50]. Naime, aktivacija NF-kB je pokazano da promoviraju EMT, a inhibicija NF-kB aktivnosti u mezenhimalnog stanici uzrokuje obrat EMT [30]. Gubitak ekspresije E-kadherina i dobitak vimentin izraza smatraju se najvažniji molekularni biljezi EMT [51]. TFS, kao puž, cjevčica, ZEB1 i ZEB2, pokazalo se da imaju ključnu ulogu. miRNAs imaju ključnu ulogu u regulaciji procesa EMT. Obitelj Mir-200 i Mir-205 regulira EMT ciljajući ZEB1 i ZEB2, koja djeluje kao transkripcije represora izražavanja E-kadherina, čime se smanjuje agresivnost stanica raka [52]. Stabilna ekspresija Mir-155 značajno inhibira stanice prolaze EMT i inhibira ekspresiju brojnih gena koji se odnose na induciranje EMT [53]. Prekomjerna ekspresija CK2 je bio uključen u karcinogeneze i razvoja raka debelog crijeva kroz regulaciju EMT-vezanih gena [54]. Aktivacija CK2 i C-rel izaziva EMT preko aril ugljikovodika receptora i cjevčica signalnog puta [55]. U našoj studiji, obnova Mir-1228 * potisnut EMT fenotip i smanjuje migraciju želučane stanica raka, to bi moglo pripisati Mir-1228 * posredovanih regulacija aktivnosti NF-kB i kroz ciljanje izraz CK2A2. Pregled

Ovaj rad identificira Mir-1228 * kao negativni regulator aktivnosti NF-kB i naglašava njegovu ulogu u suzbijanju EMT i rast karcinoma želuca, sugerira da selektivno obnova Mir-1228 * može biti koristan za želučane terapije protiv raka. pregled

Podrška Informacije pregled Slika S1. pregled Učinak Mir-1228 * na EMT u AGS stanicama. (A) Western blot analiza epitela markera E-kadherina i mczcnhimnog marker vimentin u Mir-1228 * stabilne transficirane AGS stanicama i kontrole. (B) Transwell® migracija analiza pokazala je da AGS stanice stabilno transficirane Mir-1228 * imali manji migracijski potencijal u usporedbi s Mir-NC (× 100) pregled, doi:. 10,1371 /journal.pone.0058637.s001 pregled ( DOC) pregled

priznanja

autori zahvaljuju dr Yongliang Zhu u Drugom SRODNE bolnici Zhejiang University College of medicine za tehničku pomoć. pregled