PLoS One: helyreállítása miR-1228 * Expression Megszünteti Epithelialis-mesenchymalis Transition gyomorrákban

absztrakt katalógusa

szabályozatlan miRNS kritikus szerepet játszanak során rákkeltő képességet és a rák progressziója. A jelen vizsgálatban a funkció a miR-1228 * szabályozásában daganatos progresszió vizsgálták gyomorrák. Csökkent expressziója miR-1228 * észleltek humán gyomorrák szöveteket összehasonlítva a normál szövetekben. Ezt követően, a szerepe a miR-1228 * értékelték in vivo katalógusa felhasználásával xenograft modellben. Ebben a modellben, a miR-1228 * overexpresszió elfojtott xenograft tumor kialakulását. Továbbá, azt bizonyította, miR-1228 * negatívan szabályozott NF-kB aktivitás SGC-7901 gyomorrák sejtek és megállapította, hogy CK2A2 volt a cél, miR-1228 *. Túlszabályzását miR-1228 * csökkent kifejeződését mesenchymalis markerek és növelte a hámsejtek marker E-cadherin, ami arra utal, potenciális szerepét az elnyomó epithelialis-mesenchymalis átalakulás. Együttesen ezek az eredmények az első bizonyítéka, hogy a miR-1228 * fontos szerepet játszik szabályozásában gyomorrák növekedés, és azt sugallják, hogy a szelektív helyreállítása miR-1228 * hasznos lehet gyomorrák terápia. Katalógusa

Citation: Jia L , Wu J, Zhang L, Chen J, Zhong D, Xu S, et al. (2013) restaurálása miR-1228 * Expression Megszünteti Epithelialis-mesenchymalis Transition gyomorrákban. PLoS ONE 8 (3): e58637. doi: 10,1371 /journal.pone.0058637 katalógusa

Szerkesztő: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japán katalógusa

Beérkezett: október 25, 2012; Elfogadva: február 5, 2013; Megjelent: március 12, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Jia et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: A szerzők nincs támogatás vagy támogatási jelenteni. katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. katalógusa

Bevezető katalógusa

A mikroRNS (miRNS) egy osztály a rövid ( 20-23 nukleotid hosszúságú), endogén, egyszálú RNS-ek, amelyek szabályozzák a génexpressziót okozva transzlációs elnyomás vagy mRNS degradáció [1], [2]. Via ezek molekuláris mechanizmusok, miRNS rendelkeznek normális biológiai funkciók, mint a szabályozás a sejt proliferáció, a differenciálódás, és az apoptózis. Ezen túlmenően, a rosszul szabályozott miRNS kimutatták, hogy kritikus szerepet játszanak szabályozásában karcinogenezis és a rák progressziójának [3], [4]. Abberant miRNS expressziós észleltek sokféle rosszindulatú beleértve gyomorrák. [5] katalógusa

A hámsejtek mesenchymalis tranzíció (EMT) a biológiai átprogramozása esetén, amely lehetővé teszi, hogy a hámsejtek esnek át több biokémiai változások szerezni mezenzchimasejtek fenotípus. Míg EMT kritikus a megfelelő embrionális fejlődésben, egyre több bizonyíték azt sugallja, hogy a rendellenes aktiválása EMT vezet rosszindulatú daganat progresszióját [6]. Kimutatták, hogy a EMT kulcsfontosságú folyamat hozzájárul a rák kifejlődését, azzal jellemezve, a veszteség a epithelialis marker E-cadherin, a növekedés a mesenchymalis marker a vimentin, a és nőtt a sejtvándorlását [7], [8].

a mi korábbi tanulmány, elemezve a miRNS tömb hasnyálmirigyrák gömbök, miR-1228 * találtak, mint az egyik rákkal kapcsolatos miRNS (az adatokat nem mutatjuk be). Itt azt bizonyították, hogy a miR-1228 * ben lefelé szabályozni a gyomorrák szövetekben, mint a normál szövetekben. Restaurálása kifejezése miR-1228 * gyomorrákban sejtek szignifikánsan gátolja a sejtek migrációját és a tumor növekedését. Elvileg, azt bizonyította, hogy a miR-1228 * gátolja az NF-kB aktiváció és potenciálisan elnyomja EMT. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Cell Culture katalógusa

Az emberi gyomor rákos sejtvonalak SGC-7901 , AGS és BGC-823 vásároltunk a Biokémiai Intézet és Sejtbiológiai (kínai Tudományos Akadémia). Egy normál gyomornyálkahártya sejtvonal GES-1-ben vásárolta a pekingi Institute for Cancer Research. Ezeket a sejteket 37 ° C-on, 5% CO 2 inkubátorban RPMI-1640 (SGC-7901 és BGC-823), F-12K (AGS) vagy DMEM (GES-1) tápközegben, kiegészítve 10% magzati borjúszérumot [ ,,,0],9], [10]. katalógusa

Klinikai minták

ötven pár gyomorrák és a szomszédos, nem rákos szövetet vettünk átesett betegek sebészi eltávolítását a második Affiliated Kórház, College of Medicine , Zhejiang University. A kiegyenlített, nem daganatos szomszédos szöveteket szereztünk legalább 5 cm-re a daganat helyén. Egyik beteg sem esett át sugárterápia vagy kemoterápia előtt a műtétet. A szövetmintákat gyűjtöttük, lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és -80 ° C-on, amíg a használt [11]. Minden mintákat szövettanilag igazoltan gyomor adenocarcinoma. A tanulmány által jóváhagyott második Affiliated Kórház Etikai Bizottságának Zhejiang University College of Medicine. Az aláírt tájékozott beleegyezésüket adták az összes résztvevő, vagy a betegek képviselőit, ha közvetlen hozzájárulása nem szerezhető. Katalógusa

RNS kivonása és Real-time PCR katalógusa

A teljes RNS-t vontunk ki a tenyésztett sejtek vagy szövetek TRIzol (Invitrogen), és a koncentráció a teljes RNS-t meghatározzuk. CDNS szintézise és a valós idejű PCR-t a TaqMan mikro-RNS reverz transzkripciós Kit (Applied Biosystems), és a TaqMan microRNS Assay Kit (Applied Biosystems), ill. Real-time PCR-t Applied StepOnePlus ™ Real-Time PCR System protokoll szerint. Az expressziós szintje a miR-1228 * normalizáltuk RNU6B. A valós idejű PCR reakciókat hajtottunk végre három párhuzamossal. A relatív expresszióját miRNS számítottuk ki az összehasonlító Ct módszer [12].

tumorinokulálás assay Nude egerek

nőstény BALB /c csecsemőmirigy nélküli csupasz egerekben korban 4 hetes szerezték a Shanghai Laboratory Animal Center (kínai Tudományos Akadémia). Minden eljárásokat állatokon hagyta jóvá kísérleti állat etikai bizottság, College of Medicine, Zhejiang University. miR-1228 * vagy miR-NC stabil transzfekció SGC-7901 sejtek szuszpenziók (2,5 × 10 ^{7 sejt /ml) 200 ul szérummentes tápközegben szubkután injektáltunk a szárnyakon meztelen egerekben. A tumornövekedést vizsgáltuk hetente kétszer 5 héten, és a tumor térfogatát (V) mérésével követtük nyomon a hosszúság (L) és szélességét (W) a tumor tolómércével és számított a V = 1/2 (L × W × W) [13]. katalógusa}

Cell Migration katalógusa

A migrációs képességét miR-1228 * vagy miR-NC stabil transz SGC-7901 sejtek detektáltuk Transwells (8 mm-es pórus méret, Corning). A Transwells kerültek be a 24 lyukú lemezeken. Frissen tripszinezett és mosott sejteket 100 ul szérummentes RPMI 1640-nel, amely 1% magzati szarvasmarha szérumot. Körülbelül 1 × 10 ^{5 sejt /lyuk került a felső kamrába minden betét. 200 ul RPMI1640, amely 20% borjúembrió-szérumot adtunk be az alsó kamrákat. Inkubálás után 24-48 órán át 37 ° C-on, 5% CO _{2 párásított inkubátorban, a sejteket fixáltuk 95% abszolút alkoholt, és megfestettük kristályibolyával [14]. A sejtek a belső kamrában eltávolítottuk egy vattacsomót és a sejteket csatolt az alsó oldalán a membrán megszámoltuk, és leképezett alatt egy invertált mikroszkóp × 200 nagyításnál több mint öt random mezők minden egyes lyukba. Mindegyik kísérletet három párhuzamosban végeztük.}}

Western Blot

Teljes proteinek alkalmazásával mértük a BCA készlet (Pierce) alkalmazásával a gyártó protokollja. A fehérjéket a sejteket elektroforézissel frakcionáltuk 12% -os SDS-poliakrilamid gélen, és elektro-blottoltuk nitrocellulóz (NC) membránokat 2,5 órán át 200 V. A NC-membránokat blokkoló pufferben 1 órán át szobahőmérsékleten, majd egy éjszakán át a kezelés az elsődleges antitesttel 4 ° C hőmérsékleten, majd egy HRP-vel konjugált másodlagos ellenanyaggal (MBL). Mosás után, a reaktív sávok alkalmazásával detektáltuk ECL Western-blot detekciós kit (Millipore) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Antitesteket használtunk ebben a kísérletben nyúl monoklonális anti-E-cadherin (Epitomics), anti-vimentin (Epitomics), anti-β-catenin (Epitomics), anti-Csiga (Cell Signaling), anti-meztelencsiga (Cell Signaling), anti -ZEB1 (Cell Signaling), anti-ZEB2 (santa Cruz), anti-CK2A2 (santa Cruz) és egér anti-GAPDH (KangChen Biotech).

Immunhisztokémia

paraffin metszeteket, 3- um vastagságú, sütöttek 2 órán át 60 ° C-on és a paraffint. Antigén-visszanyerés alkalmazásával végeztük citrát nátrium-pufferrel (pH = 7,2) 95 ° C-on 15 percig, majd tárgylemezeket lehűtjük szobahőmérsékleten 30 percig. Miután kezeltük 3% -os hidrogén-peroxid 15 percig, hogy blokkolja az endogén peroxidáz, a metszeteket kezelt normál kecske szérummal határoló folyékony 30 percig, hogy csökkentsék a nem-specifikus kötődés, majd nyúl poliklonális anti-E-cadherin (Santa Cruz), vagy nyúl monoklonális anti-vimentin (Epitomics) inkubáltunk a szakaszok 12 órán át 4 ° C-on. Miután felmelegítés 1 órán és mosás 5-ször, metszeteket szekunder antitesttel 30 percig, szobahőmérsékleten. Diaminobenzidine használták színes reakciókat. Katalógusa

Plazmid felépítése és a sejtek transzfekcióját katalógusa

A miR-1228 * expressziós vektor (miR-1228 *), vagy negatív (miR-NC) került kialakításra, klónozása összeillesztett, amely tartalmazta a miR-optimalizált 1228 * szár-hurok (oligonukleotidokat tervezték: felső szál, 5'-TGC TGG TGG GCG GGG GCA GGT GTG TGG TTT TGG CCA CTG ACT GAC CAC ACA CCC CCC CGC CCA C-3 '; alsó szál, 5'CCT GGT GGG CGG GGG GGT GTG TGG TCA GTC AGT GGC CAA AAC CAC ACA CCT GCC CCC GCC CAC C-3 '.), vagy negatív kontroll szár-hurok be pcDNA6.2-GW /EmGFP vektor ( Invitrogen) [15]. A 2-kb miR-1228 * promoter régiót amplifikált (primereket úgy terveztük, mint: előre, 5'-ATC TAG GGT ACC CTC ACT TGG AG CCA CAC AGA-3 ', fonák, 5'-GAC TGA AGA TCT ACC TCA AGA GTT GGG GTG TG-3 '.), valamint a coloned pGL3-Enhancer Vector (Promega) [16], a neve pGL3-miR-1228 * -promoter. Az üres pGL3-Enhancer Vector hatott negatív kontroll (pGL3-vezérlés). A miR-1228 * célterületre CK2A2 3'UTR szekvenciát kémiailag szintetizált Shanghai Biotech és ki downstream az pMIR-JELENTÉS luciferáz plazmidot (Applied Biosystems), a neve pMIR-CK2A2. A pReceiver-c-Rel ORF klón GFP-tag volt, vásárolt GeneCopoeia. A generál stabil transzfektált sejteket, a miR-1228 * és miR-NC expressziós konstrukciókat transzfektáljuk a SGC-7901 sejtvonal Lipofectamine 2000 (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. 48 óra elteltével, blaszticidin (14 ng /ml) adtunk a közegbe. A pGL3-miR-1228 * -promoter /kontroll, GFP-c-Rel /kontroll, pMIR-CK2A2 /kontroll vagy NF-kB riporter vektor (Promega) átmenetileg transzfektáltuk SGC-7901 sejtek Lipofectamine 2000 pRL-TK ( Promega) alkalmaztunk belső normalizálás [17].

luciferáz riporter vizsgálat

luciferáz riporter assay-t SGC-7901 sejteket. A sejteket PBS-sel mostuk kétszer és lízise passzív Lysis Buffer (Promega), és a luciferáz-aktivitás mértük 20 ul lizátum felhasználásával Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) a GloMax 20/20 luminométer (Promega). Minden adatot kaptuk átlagolásával eredmények legalább három független ismétlődik.

Statisztikai elemzés

Különbségek az expressziós szintek a miR-1228 * A gyomorrákos betegek által meghatározott Wilcoxon signed rank tesztet. A klinikai adatok elemeztük chi-négyzet próba alapján. T-próba és ANOVA alkalmaztak, hogy elemezzék a in vitro katalógusa és in vivo katalógusa adatokat. Minden P katalógusa értékek kétoldalas és különbségek határozták meg statisztikailag szignifikáns P katalógusa < 0.05. Eredmények elemeztük az SPSS V.16.0 szoftver (SPSS Inc.). * P < 0,05, ** P < 0.01.

Eredmények katalógusa

miR-1228 * gyakran lefelé szabályozni az emberi gyomorkarcinóma katalógusa

Először is, annak megállapítására, hogy a miR-1228 * különbözőképpen kifejezett humán primer gyomor rákos megbetegedések, az expressziós szintje az érett miR-1228 * vizsgáltuk TaqMan valós idejű PCR-ben 50 pár emberi gyomorrák szövetek és pár illeszkedő szomszédos jóindulatú gyomorfekély szövetekben. Eredményeink azt mutatták, hogy az expressziós szintje miR-1228 * szignifikánsan csökkent a gyomorrák szövetekben, összehasonlítva a szomszédos jóindulatú gyomor- szövetekben (1A.). Mintegy 72% -a tumor minták alacsonyabb volt kifejezni miR-1228 * (ábra. 1B). Használata 2 ^{-ΔΔCT értékek szeres változást a miR-1228 * < 1.0 tartották alacsony, miközben > 1.0 úgy tekintették, mint a magas kifejezés [18]. miR-1228 * expressziója is vizsgálták gyomorrák sejtvonalakon és egy immortalizált normál gyomornyálkahártya epiteliális sejtvonalat (GES-1). Ábrán látható. 1C, miR-1228 * szignifikánsan alacsony expressziót valamennyi rákos sejtvonal képest GES-1. Összefoglalva, ezek az eredmények erős bizonyíték arra, hogy a miR-1228 * volt, alulszabályozott gyomorrákban.}

Továbbá, miR-1228 * expressziós értékeltük, tekintettel a klinikopatológiai jellemzői a betegeknél. Minden betegnél nem a távoli áttétek és minden szöveteket szövettanilag igazolt gyomor adenocarcinoma. Minden esetben (n = 50) volt két csoportra osztottuk: miR-1228 * alacsony expressziója (n = 36) és a miR-1228 * magas expressziós (n = 14). A miR-1228 * alacsony expressziós csoportban volt nagyobb hajlamot a tumor mérete. Azonban nem volt szignifikáns kapcsolat a miR-1228 * kifejezés és egyéb klinikai és patológiai jellemzői, mint az életkor, a nem, a szövettani típus vagy TNM (1. táblázat). Katalógusa

Fokozott miR-1228 * Expression Megszünteti xenograft tumor kialakulása

Annak érdekében, hogy értékelje a funkcionális szerepe a miR-1228 * gyomorrákban, az optimalizált miR-1228 * szár-hurok kiónoztuk pcDNA6.2-GW /EmGFP vektor. A gyomor-sejtvonal SGC-7901 sejteket transzfektáltunk pcDNA6.2-GW /EmGFP-miR-1228 * vagy pcDNA6.2-GW /EmGFP-NC vektor és stabil sejtvonalakat generáltunk és a megnevezett miR-1228 * vagy miR-NC, illetőleg. Amint az várható volt, az RT-PCR-analízis azt mutatta, hogy a miR-1228 * stabil sejtek volt a növekedés érett miR-1228 * kifejezés, ha összehasonlítjuk MIR-NC stabil sejtek (ábra. 2A). Nem volt morfológiai változás miR-1228 * stabil transzfektált sejteket képest nem transzfektált sejtekben. SGC-7901 sejtek vagy anélkül transzfekciója miR-1228 * ültettünk szubkután szárnyakon csupasz egerek, hogy értékelje a lehetséges hatásait miR-1228 * A gyomorrák növekedése in vivo katalógusa. Túlexpressziója miR-1228 * szignifikánsan csökkentette a tumor növekedését (ábra. 2B). Végére a kísérleti időszak, a méret és a nedves tömegét tumorok miR-1228 * overexpresszió szignifikánsan kisebb volt, és alacsonyabb, mint a kontroll csoport (ábra. 2C-D). Így az adatok azt mutatják, hogy a miR-1228 * gátolja a daganat növekedését xenograft gyomorrák sejtek in vivo katalógusa.

NF-kB aktiválás felelős az alsó Expression miR-1228 * a gyomor rák katalógusa

az újabb kutatások kimutatták, hogy a legtöbb miRNS van transzkripciós faktor (TF) kötőhelyek és számos tanulmány arról számolt be, hogy a miRNS-ek útján lehet szabályozni TF [19]. Itt kihasználtuk bioinformatikai program (Promoter 2.0 és P-mérkőzés) a potenciális szabályozó miRNS-1228 * [16], [17]. Találtunk három c-Rel kötő domének a 2-KB miR-1228 * promoter régió (ábra. 3A). Mivel a C-Rel alegység tagja az NF-kB családja és hiperaktivációja NF-kB aktivitását kimutatták, hogy kapcsolatban áll a gyomorrákkal [20], [21]. Feltételeztük, hogy az NF-kB aktiválás tulajdonítják, hogy a downregulációját miR-1228 * gyomorrákban. Katalógusa

Annak bizonyítására hipotézisünket, létrehoztunk egy luciferáz konstrukciót miR-1228 * promoter régiót és értékelik tevékenységét válasz NF-kB aktiválást. Egy kísérletet hajtunk végre tenyésztésével SGC-7901 sejteket 8 órán jelenlétében a TNF-α (50 vagy 100 ng /ml-es, klasszikus NF-kB útvonal aktivátor) és /vagy pirrolidin ditiokarbamát (PDTC, 100 uM), egy széles körben használt inhibitora a transzkripciós faktor NF-kB [22]. SGC-7901 sejteket transzfektáltunk pGL3-miR-1228 * -promoter vagy pGL3-Control, 24 órával később, transzfektált SGC-7901 sejteket tettünk ki 8 órán keresztül, hogy a TNF-α vagy anélkül PDTC annak vizsgálatára, hogy az NF-kB aktiválás szabályoz miR-1228 * promoter aktivitását. Megfigyeltük, hogy a TNF-α kezelés jelentősen gátolta miR-1228 * promoter aktivitásának gátlása és a NF-kB a PDTC megakadályozta a TNF-α-mediált alulszabályozása az aktivitás szintjének (ábra. 3B), ami arra utal, hogy az NF-kB is negatívan szabályozzák miR 1228 * kifejezést. Ahhoz, hogy tovább meghatározására, hogy az NF-kB alegység C-Rel felelős deregulációja miR-1228 *, azt transzfektált SGC-7901 sejtek miR-1228 * -promoter vagy anélkül GFP-C-Rel és szignifikáns csökkenés a luciferáz aktivitás GFP -c-Rel-csoport, mint a kontroll (3C.). Együttesen az adatok arra utalnak, hogy az NF-kB alegységek c-Rel funkcionálisan hozzájárul a downregulációját miR-1228 * gyomorrákban. Katalógusa

miR-1228 * Megszünteti az NF-kB aktivitás és CK2A2 Expression az SGC-7901

Annak érdekében, hogy vizsgálja meg a hatása a miR-1228 * a NF-kB jelátviteli NF-kB riporter konstrukciót transzfektáltunk vagy miR-1228 * vagy miR-NC stabilan transzfektált SGC-7901 sejtek és a tevékenység NF-kB luciferáz után határozzuk meg 48 órán át. Eredményeink azt mutatták, hogy a tevékenység az NF-kB jelentősen csökkentette túltermelése miR-1228 * (4A.), Jelezve a negatív visszacsatolás között miR-1228 * expresszió és NF-kB aktivitását. További azonosítására downstream célpontok a miR-1228 * Az NF-kB útvonal végeztünk bioinformatikai elemzés és megállapította CK2A2 volt az egyik feltételezett célgének, amelyeket előre. Segítségével Miranda RNA22 [23], [24], mi található egy potenciális kötõhelye miR-1228 * A 3'UTR a CK2A2 (ábra. 4B). CK2A2 egyik alegység a protein kináz CK2, amely részt vesz az NF-kB utat [25], [26] és annak expresszióját figyelték meg, hogy legfeljebb szabályozott több rákok, beleértve a gyomorrákot [27], [28]. További vizsgálatok közötti összefüggés CK2A2 és miR-1228 * kimutatták, hogy a fehérje szintje CK2A2 volt egyidejűleg leszabályozott upon miR-1228 * stabil túltermelése SGC-7901 sejtek (ábra. 4C). Annak ellenőrzésére, hogy CK2A2 egy igazi cél a miR-1228 *, a szegmens a CK2A2 3'UTR tartalmazó kötőhely klónozva 3'UTR luciferáz gén pMIR-jelentés plazmid [29]. A fluoreszcens intenzitás a riporter gén szignifikánsan csökkent a csoportban volt kotranszfektáltuk pMIR-CK2A2 és miR-1228 * a kontrollhoz képest (ábra. 4d). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a miR-1228 * együttműködik a CK2A2 mRNS 3'UTR. Katalógusa

miR-1228 * Gátolja EMT katalógusa

Azt jelentette, hogy NF-kB játszanak szerepet EMT a rák kifejlődésének [30], [31], és a gátlás az NF-kB aktivitását az egyes tumorsejtvonalak okozott megfordítása EMT [32]. Mivel a miR-1228 * Úgy tűnik, hogy negatívan szabályozza NF-kB aktivitását, ezért azt vizsgálni, ha a miR-1228 * is negatívan szabályozzák EMT gyomorrákban. Western blot kimutatta, hogy túltermelése miR-1228 * in SGC-7901 sejtek leszabályozott mesenchymalis markerek (Vimentin, β-catenin, Csiga, csiga, és ZEB1 /2), míg fel szabályozott epiteliális marker E-cadherin (ábra. 5A ). Továbbá, a miR-1228 * túltermelése okozta csökkenést sejtek migrációját (ábra. 5B-C). Immunhisztokémiai festést alkalmaztunk, hogy tovább erősítse EMT kapcsolódó fehérjék változása a miR-1228 * transzfektált SGC-7901 sejtek xenograftmodellben. Kimutattuk, hogy a kifejezés a Vimentin csökkent, és a kifejezés a E-cadherin növekedett összehasonlítva, amelyek a kontroll sejtekben (ábra. 5D). A hasonló eredményeket figyeltek meg egy másik gyomorrák sejtvonal AGS (ábra. S1). Az adatok az első bizonyítéka, hogy a miR-1228 * helyreállítás gyomorrákban negatívan szabályozza EMT. Katalógusa

Vita katalógusa

A gyomorrák a negyedik leggyakoribb rosszindulatú daganat világszerte, és jelenleg a második vezető oka rákhoz kapcsolódó mortalitás [33], [34]. Bár a jelenlegi gyakorlat, amely egyesíti a kemoterápia vagy sugárkezelés sebészi reszekció jelentősen növelte a teljes túlélést gyomorrákos betegek, a teljes 5 éves túlélés aránya még mindig alacsony. Gyomor karcinogenezis kell tekinteni egy multifaktoriális, és többlépcsős folyamat, amely magában foglalja az aktiválási onkogének és a inaktiválása tumorszuppresszor gének [35].

miRNS endogén nem-fehérje-kódoló rövid RNS-ek, hogy fontos szerepet játszanak a celluláris élettan, fejlesztése, és a betegségek által negatívan szabályozó gén expresszióját. Elemzések miRNS expressziós profilok azt mutatják, hogy sok miRNS aberráns kifejezni, és összefügg a tumorigenezis, progresszió és a prognózist különböző hematológiai és szolid tumorok, beleértve a gyomorrák [36]. Azonosítása és tisztázása biológiai funkcióit miRNS dereguláció gyomorrák segíthet, hogy jobban megértsük a patogenezisében a halálos betegség, és új lehetőségeket fejleszteni miRNS-alapú terápiák. Például a miR-221 és miR-222 kimutatták, hogy pozitívan szabályozzák gyomorrák sejt proliferációját és invázióját, ami arra utal, hogy az válassza ki a gátlása azok miRNS előnyös lehet gyomorrák kezelések [37]. miRNS szerepet játszanak etiológiájában és patogenezisében különféle rákok célzásával számos onkogének vagy tumor szupresszor gének. miR-21 overexpresszálódik H. pylori fertőzött gyomornyálkahártya és gyomorrák szövetekben. Erőltetett expressziója a miR-21 növeli a invazivitásának gyomorrák sejtek RECK a közvetlen cél a miR-21 [38]. miR-218 gátolja az invázió és metasztázis gyomorrák megcélozva Robo1 receptor [39]. Ueda és munkatársai [40] azonosított 22-ig szabályozott és 13 lefelé szabályozni miRNS gyomorrákban versus nem-daganatos nyálkahártya, alacsony kifejeződése let-7g és miR-433 és magas kifejezése miR-214 kapcsolatban voltak kedvezőtlen kimenetel a teljes túlélés független klinikai változót, beleértve mélysége invázió, nyirokcsomó-áttétek, és a színpadon. miR-375 gyakran alulszabályozott a gyomorrák és funkciója, mint a tumor szuppresszor szabályozására gyomorrák sejtek proliferációját potenciálisan megcélzásával a JAK2 onkogén [10]. A másik tanulmány kimutatta, miR-1228 * volt egy hámrákos kapcsolatos miRNS (nem publikált). Azonban csak kevesen kutatásai miR-1228 * számoltak be. Guled munkatársai [41] kimutatták, hogy a miR-1228 * nagyra kifejezve rosszindulatú mesothelioma mintákat összehasonlítva a hagyományos minták. De a biológiai funkciója ennek miRNS még nem vizsgálták. A jelen tanulmányban azt állapította meg, hogy a miR-1228 * volt, alulszabályozott több mint 70% a gyomorrák minták képest azok a nem-tumoros társaik, és kísérleti bizonyíték, hogy ez működhet, mint egy tumorszuppresszor keresztül negatívan szabályozó EMT, és gátolja az NF -κB tevékenység. katalógusa

a feltüntetett adatok downregulációját miR-1228 * gyomorrákban szövetek és gyomorrák sejtvonalakon. Különböző molekuláris mechanizmusok vezethetnek miRNS diszreguláció, mint például a genetikai mutáció, epigenetikai aberráció és deregulált transzkripciós aktivitását [42]. TF lehetne szabályozni miRNS expressziós kötődve promóter régiókat, akár a fiziológiai vagy patológiai kontextusban [43]. Hogy vizsgálja meg a miR-1228 * deregulálták gyomorrákban, elemeztük a 2-kb promoter régió elé a miR-1228 * és talált három feltételezett c-Rel kötő domént tartalmaz. Bár NF-kB legismertebb transzkripciós aktivációs függvény, legutóbbi munkája a p65, RelB és c-Rel kimutatták, hogy az NF-kB lehet alul szabályozzák specifikus géneket [17], [44], [45]. Egy miR-1228 * promoter-riporter konstrukciót, amely 2-kb-os fragmenseket, a miR-1228 * promotert, azt találtuk, hogy az NF-kB utat aktivátor a TNF-α csökkent miR-1228 * promoter aktivitását. És az NF-kB inhibitor PDTC figyelemreméltóan antagonizálta a TNF-α-mediált miR-1228 * promoter alacsony aktivitás. Adataink azt mutatják, hogy a c-Rel tudott kötődik közvetlenül a miR-1228 * promoter és negatívan szabályozza a kifejezés. Mivel a C-Rel alegység tagja az NF-kB a család, az NF-kB aktiválás phenocopied hatásainak a c-Rel szabályozásában miR-1228 * kifejezés, ami arra utal, hogy az NF-kB útvonal negatívan részt a downregulációját miR-1228 * a gyomorrák. Továbbá, a miR-1228 * overexpresszió is eredményezte downregulációja az NF-kB aktivitását. Ezért adataink felvázol egy kettős negatív visszacsatolási hurok között NF-kB és miR-1228 *. A pontos mechanizmusa, hogyan ez a negatív visszacsatolás jelentkezik tovább kell tanulmányozni.

CK2A2 egyik alegység a protein-kináz CK2, ami egy erősen konzervált és mindenütt jelenlévő protein szerin /treonin kináz. Overexpressziója CK2 észlelték számos rákos megbetegedések, beleértve az emlőmirigy, a prosztata, a vese, a tüdő, fej és nyak és gyomor [27], [46]. Túlexpressziója CK2 emlőmirigyeiben transzgenikus egerek okoz hyperplasia és diszplázia, amely végül a adenocarcinoma [47]. CK2 arra túltermelõdik fej-nyaki laphámrák vonalak és a szöveteket. Kiütése CK2 alegységek differenciálisán gátolta kBa degradáció, NF-kB nukleáris lokalizációs, foszforiláció, DNS-kötő, és riporter aktivitás [25]. CK2 fontos szerepet játszik a HER-2 /neu-jelátvitel, elősegítve IκB lebomlás és az NF-kB aktiválását [26]. Ebben a vizsgálatban kimutattuk, hogy a miR-1228 * Csökkentett expresszióját CK2A2 fehérje szinten. Luciferázvizsgálatban egy riporter tartalmazó miR-1228 * kötelező szekvencia 3'UTR a CK2A2 mRNS azt javasolta, hogy a miR-1228 * közvetlenül célozza 3'UTR a CK2A2. Összefoglalva, ezek az adatok azt jelzik, hogy a szuppresszió az NF-kB aktivitását a miR-1228 * lehet keresztül célzási CK2A2 kifejezést. EMT most minden előfordulása ismert a különböző betegségek, köztük a progresszió a rák. Felismerték, hogy EMT fontos folyamat alkotnak diffúz szövettan, és kezdeményezi metasztázis erősítésével motilitása tumorsejtek [48]. EMT szabályozza különböző onkogén jelátviteli útvonalak, mint AKT és az NF-kB [49], [50]. Pontosabban, NF-kB kimutatták, hogy elősegíti EMT míg gátlása az NF-kB aktivitását mezenzchimasejtek okoz megfordítása EMT [30]. Elvesztése E-cadherin expresszió és gain vimentin expressziót kell tekinteni a legfontosabb molekuláris markerek EMT [51]. TF, mint például a csiga, meztelen csiga, ZEB1 és ZEB2, kimutatták, hogy kritikus szerepet. miRNS további kulcsfontosságú szabályozó EMT folyamatot. A miR-200 család és miR-205 szabályozzák EMT célzásával ZEB1 és ZEB2, amely funkcionálhat transzkripciós represszorok az E-cadherin expresszió, ezáltal csökkentve a agresszivitás rákos sejtek [52]. Stabil expressziója a miR-155 jelentősen gátolja a sejteket a áteső EMT és gátolja az expresszióját számos gén kapcsolódó indukciója EMT [53]. Túlexpressziója CK2 részt vett a karcinogenitási és fejlesztése A vastag- és végbélrák szabályozásán keresztül EMT kapcsolatos gének [54]. Aktiválása CK2 és a c-Rel indukál EMT keresztül egy aril szénhidrogén receptor és meztelencsiga jelátviteli útvonal [55]. Tanulmányunkban helyreállítása miR-1228 * elnyomott EMT fenotípus és csökkent a gyomorrák sejtek migrációját, ez esetleg tulajdonítunk miR-1228 * közvetített downregulációját az NF-kB aktivitás és a célzás CK2A2 kifejezést. Katalógusa

A jelen munka azonosítja miR-1228 * mint negatív szabályozója az NF-kB aktivitását, és kiemeli annak szerepét elfojtásában EMT és gyomorrák növekedés arra utal, hogy a szelektív helyreállítása miR-1228 * hasznos lehet az gyomorrák terápiában.

Támogató Információs katalógusa ábra S1.
hatása miR-1228 * A EMT AGS sejtekben. (A) Western-blot analízis epithelialis marker E-kadherin és mesenchymalis marker Vimentin a miR-1228 * Stabil transzfektált AGS sejtek és ellenőrzés. (B) Transwell migrációs vizsgálat szerint AGS sejtek stabil transzfektált miR-1228 * kisebb volt a migrációs potenciál összehasonlítani miR-NC (× 100). Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0058637.s001 katalógusa ( DOC) hotelben

Köszönetnyilvánítás katalógusa

A szerzők köszönetet mondanak Dr. Yongliang Zhu második Affiliated Kórház Zhejiang University College of Medicine a technikai segítségnyújtás. katalógusa

• PLoS One: túltermelése CD151 jósolja kórjóslatát kimetszett Gyomor Cancer
• PLoS One: Superior daganatellenes hatását nanorészecske albuminhoz kötött paclitaxel Experimental Gyomor Cancer