fehlregulierte miRNAs spielen eine entscheidende Rolle bei der Krebsentstehung und Progression von Krebs. In der vorliegenden Studie wurde die Funktion von miR-1228 * bei der Regulierung der Tumorprogression bei Magenkrebs untersucht. Verminderte Expression von * miR-1228 wurde in menschlichen Magenkrebsgewebe im Vergleich zu normalen Geweben beobachtet. Anschließend wurde die Rolle der miR-1228 * ausgewertet in vivo Citation:. Jia L , Wu J, Zhang L, Chen J, Zhong D, Xu S, et al. (2013) Die Wiederherstellung der miR-1228 * Expression Unterdrückt Epithelial-mesenchymale Transition in Magenkrebs. PLoS ONE 8 (3): e58637. doi: 10.1371 /journal.pone.0058637 Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan Empfangen: 25. Oktober 2012; Akzeptiert: 5. Februar 2013; Veröffentlicht: 12. März 2013 Copyright: © 2013 Jia et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden Finanzierung:. Die Autoren haben keine Unterstützung oder Finanzierung zu berichten konkurrierende Interessen:.. Die Autoren, dass keine Interessenkonflikte bestehen erklärt haben Einführung MicroRNAs (miRNAs) eine Klasse von kurzen ( 20-23 Nukleotide lang), endogene, einzelsträngigen RNAs, die die Genexpression durch Abbau verursacht translationale Repression oder mRNA regulieren [1], [2]. Über diese molekularen Mechanismen besitzen miRNAs normalen biologischen Funktionen, wie Regulierung der Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose. Darüber hinaus haben dysregulated miRNAs gezeigt worden, eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Karzinogenese und Tumorprogression [3], [4] zu spielen. Abberant miRNAs Ausdruck wurden in vielen Arten von bösartigen Tumoren, einschließlich Magenkrebs beobachtet [5]. Epithelial-mesenchymale Transition (EMT) ist ein biologisches Umprogrammierung Ereignis, das von Epithelzellen ermöglicht mehrere biochemische Veränderungen zu durchlaufen eine mesenchymale Zelle zu erwerben Phänotyp. Während EMT kritisch für geeignete Embryonalentwicklung ist es Hinweise darauf, dass die Erhöhung aberrante Aktivierung von EMT führt zu malignen Tumorprogression [6]. Es hat sich gezeigt, dass EMT ein Schlüsselprozess zur Entwicklung von Krebs beiträgt, ist, die durch den Verlust der epithelialen Marker E-Cadherin, eine Erhöhung der mesenchymalen Marker Vimentin gekennzeichnet, und eine Erhöhung der Migrations- und Invasionsverhalten [7], [8]. In unserer früheren Studie, die von der miRNA-Array von Bauchspeicheldrüsenkrebs Sphären zu analysieren, miR-1228 * als einer der durch Krebs verursachten miRNAs (Daten nicht gezeigt) gefunden wurde. Hier haben wir Beweise dafür, dass miR-1228 * wurde herunterreguliert im Magenkrebsgewebe im Vergleich zu normalen Geweben. Restoration Expression von miR-1228 * bei Magenkrebs Zellen signifikant die Zellmigration und das Tumorwachstum hemmen. Mechanistisch wir gezeigt, dass miR-1228 * hemmt die NF-kappaB Aktivierung und EMT unterdrückt potenziell. Zellkultur menschlichen Magenkrebszelllinien SGC-7901 , AGS und BGC-823 wurden vom Institut für Biochemie und Zellbiologie (Chinese Academy of Sciences) erworben. Eine normale Magen-epithelialen Zell-Linie GES-1 wurde aus dem Peking-Institut für Krebsforschung erworben. Diese Zellen wurden bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator in RPMI-1640 aufrechterhalten (SGC-7901 und BGC-823), F-12K (AGS) oder DMEM (GES-1) -Medium mit 10% fötalem Rinderserum [ ,,,0],9], [10]. klinischen Proben Fünfzig Paare von Magenkrebs und benachbarten nicht-Krebsgewebeproben wurden von Patienten erhalten, die chirurgische Resektion beim Zweiten Affiliated Hospital, College of Medicine unterzog , Zhejiang University. Die angepaßten Nicht-Krebs benachbarte Gewebe wurden entfernt Stelle aus dem Tumor mindestens 5 cm erhalten. Keiner der Patienten hatte eine Strahlentherapie oder eine Chemotherapie vor der Operation unterzogen. Gewebeproben wurden gesammelt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 ° C gelagert, bis sie verwendet [11]. Alle Gewebe wurden histologisch bestätigt Magenadenokarzinomen zu sein. Die Studie wurde von der Zweiten Affiliated Hospital Ethikkommission der Zhejiang University College of Medicine zugelassen. Die unterzeichnete Einverständniserklärung wurde von allen Teilnehmern erhalten oder von Patientenvertretern, wenn keine direkte Zustimmung nicht erhalten werden konnte. Gesamt-RNA wurde aus den kultivierten Zellen extrahiert oder Gewebe TRIzol (Invitrogen) und die Konzentration von gesamt-RNA wurde unter Verwendung. Synthese von cDNA und real-time PCR wurden mit dem TaqMan MicroRNA Reverse Transkription-Kit (Applied Biosystems) und die TaqMan MicroRNA Assay Kit (Applied Biosystems) ausgeführt sind. Echtzeit-PCR wurde auf einem Applied Biosystems StepOnePlus ™ Real-Time-PCR-System durchgeführt nach dem Protokoll. Die Expression von miR-1228 * wurde auf RNU6B normalisiert. Die Echtzeit-PCR-Reaktionen wurden dreifach durchgeführt. Die relative Expression von miRNAs wurde mit der Vergleichs Ct Methode berechnet [12]. Weibliche BALB /c Nacktmäusen ohne Thymus im Alter von 4 Wochen wurden gekauft von der Shanghai Laboratory Animal Center (chinesische Akademie der Wissenschaften). Alle Verfahren mit Tieren wurden durch experimentelle Tierethikkommission, College of Medicine, Zhejiang Universität genehmigt. miR-1228 * oder miR-NC stabile Transfektion SGC-7901-Zellen Suspensionen (2,5 x 10 7 Zellen /ml) in 200 &mgr; l serumfreiem Medium wurden subkutan in die Flanken von Nacktmäusen injiziert, respectively. Das Tumorwachstum wurde für 5 Wochen zweimal wöchentlich untersucht, und das Tumorvolumen (V) wurde durch Messung der Länge (L) und Breite (W) des Tumors mit Sätteln und berechnet nach der Formel V = 1/2 (L × W überwacht × B) [13]. Zellmigration Die Migrationsfähigkeit von miR-1228 * oder miR-NC stabile Transfektion SGC-7901-Zellen wurden Transwells (8-mm Porengröße erfasst verwenden, Corning). Die Transwells wurden in den Platten mit 24 Vertiefungen setzen. Frisch trypsinisiert und gewaschenen Zellen wurden in 100 &mgr; l serumfreiem RPMI1640, enthaltend 1% fötales Rinderserum suspendiert. Etwa 1 × 10 5 Zellen /Vertiefung wurde in der oberen Kammer jedes Einsatzes angeordnet. 200 ul RPMI1640 20% fötales Rinderserum enthielt, wurde in die untere Kammer gegeben. Nach Inkubation für 24-48 h bei 37 ° C in einer 5% CO 2 befeuchteten Inkubator wurden die Zellen mit 95% absoluten Alkohol fixiert und mit Kristallviolett gefärbt [14]. Die Zellen in der inneren Kammer wurden mit einem Baumwolltupfer entfernt und die an der Unterseite der Membran haftenden Zellen wurden unter einem umgekehrten Mikroskop bei 200 × Vergrßerung in fünf zufälligen Feldern in jeder Vertiefung gezählt und abgebildet. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt. Gesamtproteine wurden die BCA-Kit gemessen (Pierce) gemß dem Protokoll des Herstellers. Die Proteine der Zellen wurden für 2,5 Stunden bei 200 V. Die NC-Membranen durch Elektrophorese auf 12% SDS-Polyacrylamidgel und elektro-geblottet auf Nitrocellulose (NC) -Membranen fraktioniert wurden mit Blockierungspuffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer Behandlung über Nacht mit dem primären Antikörper bei 4 ° C, und dann mit einem HRP-konjugierten sekundären Antikörper (MBL). Nach dem Waschen wurden die reaktiven Banden entsprechend den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung eines ECL-Western-Blot-Nachweis-Kits (Millipore) nachgewiesen. Antikörper verwendet in diesem Experiment wurden Kaninchen monoklonale Anti-E-Cadherin (Epitomics), anti-Vimentin (Epitomics), anti-β-Catenin (Epitomics), Anti-Snail (Cell Signaling), anti-Slug (Cell Signaling), anti -ZEB1 (Cell Signaling), Anti-ZEB2 (Santa Cruz), Anti-CK2A2 (Santa Cruz) und Maus-Anti-GAPDH (KangChen Biotech). Immunhistochemie Paraffinschnitte, 3- um Dicke, wurden bei 60 ° C für 2 h gebacken und entparaffiniert. Antigen Retrieval wurde 15 Minuten bei Verwendung von Citrat-Natriumpuffer (pH 7,2), 95 ° C durchgeführt und dann wurden die Objektträger für 30 Minuten bei Raumtemperatur abgekühlt. Nach 15 Minuten mit 3% Wasserstoffperoxid behandelt wird, um die endogene Peroxidase zu blockieren, wurden die Schnitte für 30 Minuten mit normalem Ziegenserum Sperrflüssigkeit behandelt unspezifische Bindung zu reduzieren und dann polyklonalen Kaninchen-anti-E-Cadherin (Santa Cruz) oder Kaninchen monoklonale anti-Vimentin (Epitomics) wurden die Schnitte für 12 h bei 4 ° C inkubiert. Nach der Wiedererwärmung für 1 h und Waschen für 5 Mal wurden die Schnitte für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit sekundärem Antikörper inkubiert. Diaminobenzidin wurde für Farbreaktionen verwendet. Die miR-1228 * Expressionsvektor (miR-1228 *) oder Negativkontrolle (miR-NC) durch Klonen konstruiert wurde von geglüht Oligonukleotide, die die optimierte miR-1228 * Stamm-Schleife enthalten (Oligonukleotide wurden entworfen als: Obertrum, 5'-TGC TGG TGG GCG GGG GCA GGT GTG TGG TTT TGG CCA CTG ACT GAC CAC ACA CCC CCC CGC CCA C-3 ';. Untertrum, 5 'CCT GGT GGG CGG GGG GGT GTG TGG TCA GTC AGT GGC CAA AAC CAC ACA CCT GCC CCC GCC CAC C-3') oder negative Kontrolle Stamm-Schleife in pcDNA6.2-GW /EmGFP Vektor ( Invitrogen) [15]. Das 2-kb miR-1228 * Promotorregion wurde verstärkt (Primer wurden so entworfen: vorwärts, 5'-ATC TAG GGT ACC CTC ACT TGG AG CCA CAC AGA-3 '; umkehren, 5'-GAC TGA AGA TCT ACC TCA AGA GTT GGG GTG TG-3 '.) und coloned zu pGL3-Enhancer Vektor (Promega) [16], mit dem Namen als pGL3-miR-1228 * -Promotors. Der leere pGL3-Enhancer Vektor diente als Negativkontrolle (pGL3-Kontrolle). Die miR-1228 * Zielregion des CK2A2 3'UTR-Sequenz wurde chemisch durch Shanghai Biotech synthetisiert und nach dem PMIR-REPORT Luciferase-Plasmid (Applied Biosystems), benannt als PMIR-CK2A2 eingefügt. Die Preceiver-c-Rel ORF-Klon mit GFP-Tag wurde von GeneCopoeia gekauft. Zur Erzeugung stabil transfizierten Zellen wurden die miR-1228 * und miR-NC-Expressionskonstrukten transfiziert in die SGC-7901-Zelllinie unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach 48 Stunden wurde Blasticidin (14 &mgr; g /ml) zum Medium zugegeben. Der pGL3-miR-1228 * -Promotors /Kontrolle, GFP-c-Rel /Steuerung, PMIR-CK2A2 /Kontrolle oder NF-kappaB-Reportervektor (Promega) wurden in SGC-7901-Zellen unter Verwendung von Lipofectamin 2000 pRL-TK transient ( Promega) wurde als interne Normalisierung [17]. Luciferase Reporter Assay Die Luciferase-Reportertest wurde durchgeführt, in SGC-7901-Zellen verwendet. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in Passive Lysis Buffer (Promega) und die Luciferase-Aktivitäten lysiert von 20 ul Lysat wurden gemessen unter Verwendung des Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) auf Glomax 20/20 Luminometer (Promega). Alle wurden die Daten, die durch die Ergebnisse von mindestens drei unabhängigen Wiederholungen gemittelt werden. Die Unterschiede zwischen den Expressionsniveaus des miR-1228 * in Magenkrebs-Patienten von der Wilcoxon bestimmt wurden Vorzeichen-Rang-Test. Die klinischen Daten wurden mit dem Chi-Quadrat-Test analysiert. Student-t-Test und ANOVA wurden eingesetzt, um die In-vitro-
das Modell Tumorxenotransplantates verwenden. In diesem Modell miR-1228 * Überexpression Xenograft Tumorbildung unterdrückt. Darüber hinaus haben wir gezeigt, miR-1228 * negativ reguliert NF-kappaB-Aktivität in SGC-7901 Magenkrebszellen und festgestellt, dass CK2A2 ein Ziel von miR-1228 * war. Hochregulation von miR-1228 * verringerte sich die Expression von mesenchymalen Marker und erhöhte den epithelialen Marker E-Cadherin, was darauf hindeutet, seine mögliche Rolle in epithelial-mesenchymale Transition zu unterdrücken. Zusammen liefern diese Ergebnisse die ersten Anzeichen dafür, dass miR-1228 * eine wichtige Rolle spielt Magenkrebswachstum bei der Regulierung und deuten darauf hin, dass eine selektive Wiederherstellung von miR-1228 * von Vorteil sein kann für Magenkrebs-Therapie
Materialien und Methoden
RNA-Extraktion und Real-time PCR
Tumorinokulierung Assay in Nacktmäusen
Western Blot
Plasmidkonstruktion und Zelltransfektion
Statistische Analyse
und in vivo
Daten zu analysieren. Alle P
Werte waren zweiseitig und Unterschiede wurden als statistisch signifikant definiert für P
< 0,05. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung des SPSS V.16.0 Software (SPSS Inc.) analysiert. * P < 0,05, ** P < 0,01.
Ergebnisse
Mit FLUOstar Omega neue Darmbakterien untersuchen, die unsere Gesundheit beeinflussen können
Die Gruppe Mikrobielle Biologie und Metagenomik am Diamantina Institute der University of Queensland verwendet den BMG LABTECH FLUOstar Omega Mikroplatten-Reader, um neue Methoden zur Untersuchung des
Mundhygiene und Schweregrad von COVID-19 – die Verbindung
Britische Forscher haben einen Zusammenhang zwischen schlechter Mundhygiene und der Schwere der COVID-19-Erkrankung gefunden, die durch eine Infektion mit dem schweren akuten Atemwegssyndrom Coronavir
Neues Modell für die vaginale Mikrobiom-Transplantation
Bakterielle Vaginose ist eine Erkrankung, von der Tausende von Frauen weltweit betroffen sind. und ist nicht nur mit vaginalen Symptomen, sondern auch mit schwangerschaftsbedingten Komplikationen wie
