PLoS ONE: Restauratie van miR-1228 * Expression Onderdrukt-mesenchymale transitie in Gastric Cancer

Abstract

ontregelde miRNAs spelen cruciale rol tijdens de carcinogenese en de progressie van kanker. In deze studie, de functie van miR-1228 * in het reguleren kankervooruitgang onderzocht bij maagkanker. Verminderde expressie van miR-1228 * waargenomen in menselijke maagkanker weefsels in vergelijking met normale weefsels. Vervolgens heeft de rol van miR-1228 * werd geëvalueerd In vivo
met behulp van de tumor xenograft model. In dit model, miR-1228 * overexpressie onderdrukt xenograft tumorvorming. Verder hebben we aangetoond dat miR-1228 * negatief gereguleerd NF-KB-activiteit in SGC-7901 maagkanker cellen en vond dat CK2A2 was een doelwit van miR-1228 *. Opregulatie van miR-1228 * verminderde de expressie van mesenchymale markers en verhoogde de epitheliale marker E-cadherine, suggereert haar mogelijke rol in het onderdrukken van epitheliale-mesenchymale transitie. Tezamen zijn deze bevindingen bieden het eerste bewijs dat miR-1228 * speelt een belangrijke rol in het reguleren van de maag de groei van kanker en suggereren dat selectieve restauratie van miR-1228 * kan gunstig zijn voor maagkanker therapie

Visum:. Jia L , Wu J, L Zhang, Chen J, Zhong D, Xu S, et al. (2013) Herstel van miR-1228 * Expression Onderdrukt-mesenchymale transitie bij maagkanker. PLoS ONE 8 (3): e58637. doi: 10.1371 /journal.pone.0058637

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Ontvangen: 25 oktober 2012; Aanvaard: 5 februari 2013; Gepubliceerd: 12 maart 2013

Copyright: © 2013 Jia et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. De auteurs hebben geen steun of financiering aan te melden

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

MicroRNAs (miRNAs) zijn een klasse van korte ( 20-23 nucleotiden lang), endogene enkelstrengs RNA's die genexpressie reguleren door het veroorzaken translationele repressie of mRNA degradatie [1], [2]. Via deze moleculaire mechanismen miRNAs bezitten normale biologische functies zoals regulering van celproliferatie, differentiatie en apoptose. Bovendien zijn ontregelde miRNAs aangetoond cruciale rol spelen bij het reguleren kanker en kanker progressie [3], [4]. Abberant miRNAs expressie waargenomen in vele soorten van maligniteiten zoals maagkanker [5].

-mesenchymale transitie (EMT) is een biologische herprogrammering waarmee epitheelcel meerdere biochemische wijzigingen in een mesenchymale cel verwerven ondergaan fenotype. Terwijl EMT is essentieel voor een passende embryonale ontwikkeling meer gegevens suggereren dat de afwijkende activering van EMT leidt tot kwaadaardige tumor progressie [6]. Het is aangetoond dat EMT is een sleutelproces bijdraagt ​​tot de ontwikkeling van kanker, gekenmerkt door het verlies van de epitheliale marker E-cadherine, een verhoging van de mesenchymale marker vimentine, en een toename van de migratie en invasieve gedrag [7], [8].

In onze eerdere studie, door analyse van de miRNA reeks pancreaskanker bolletjes werd miR-1228 * aangetroffen als een kankergerelateerde miRNAs (gegevens niet getoond). Hier hebben we aangetoond dat miR-1228 * werd down-gereguleerd bij maagkanker weefsels in vergelijking met normale weefsels. Restauratie expressie van miR-1228 * bij maagkanker cellen significant remt celmigratie en tumorgroei. Mechanistisch, hebben we aangetoond dat miR-1228 * remt NF-KB-activering en potentieel onderdrukt EMT.

Materialen en methoden

Cell Culture

Human maagkanker cellijnen SGC-7901 , AGS en BGC-823 werden aangekocht van het Instituut voor Biochemie en Celbiologie (Chinese Academie van Wetenschappen). Een normale maag epitheel cellijn GES-1 werd gekocht van het Beijing Institute for Cancer Research. Deze cellen werden bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator in RPMI-1640 (SGC-7901 en BGC-823), F-12K (AGS) of DMEM (GES-1) medium aangevuld met 10% foetaal runderserum [ ,,,0],9], [10].

Klinische monsters

Vijftig paren van maagkanker en naburige niet-kanker weefselmonsters werden verkregen uit patiënten die chirurgische resectie de tweede Affiliated Hospital, College of Medicine , Zhejiang University. De gevonden niet-kanker aangrenzende weefsels werden minimaal 5 cm van de tumor verkregen. Geen van de patiënten had radiotherapie of chemotherapie ondergaan voorafgaand aan de operatie. Weefselmonsters werden verzameld, snel bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot gebruik [11]. Alle weefsels werden histologisch bevestigd gastrische adenocarcinomen zijn. De studie werd goedgekeurd door de Tweede Affiliated Hospital ethische commissie van Zhejiang University College of Medicine. De ondertekende geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers of van vertegenwoordigers van patiënten indien directe toestemming niet kon worden verkregen.

RNA-extractie en Real-time PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de gekweekte cellen of weefsels met behulp TRIzol (Invitrogen), en de concentratie van totaal RNA werd bepaald. Synthese van cDNA en real-time PCR werd uitgevoerd met de TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) en TaqMan MicroRNA Assay Kit (Applied Biosystems), respectievelijk. Real-time PCR werd uitgevoerd op een Applied Biosystems StepOnePlus ™ Real-Time PCR systeem volgens het protocol. De expressie niveau van miR-1228 * werd genormaliseerd naar RNU6B. De real-time PCR-reacties werden uitgevoerd in drievoud. De relatieve expressie van miRNAs werd berekend met de vergelijking Ct methode [12].

tumorinoculatie Assay in Naakt Muizen

Vrouwelijke BALB /c athymische naakt muizen op de leeftijd van 4 weken werden verkregen van de Shanghai Laboratory Animal Center (Chinese Academie van Wetenschappen). Alle procedures waarbij dieren werden goedgekeurd door Experimental Animal Ethics Committee, College of Medicine, Zhejiang University. miR-1228 * of miR-NC stabiele transfectie SGC-7901 cellen schorsingen (2,5 x 10 ^{7 cellen /ml) in 200 ul serumvrij medium werden subcutaan geïnjecteerd in de flanken van naakt muizen, respectievelijk. De tumorgroei werd tweemaal per week onderzocht gedurende 5 weken en het tumor volume (V) werd gevolgd door de lengte (L) en breedte (W) van de tumor met schuifmaten en berekend met de formule V = 1/2 (L x W × w) [13].}

Cell migratie

De migratie vermogen van miR-1228 * of miR-NC stabiele transfectie SGC-7901-cellen werden gedetecteerd met behulp van Transwells (8-mm poriegrootte, Corning). De Transwells werden in de 24 putjes gebracht. Vers getrypsiniseerd en gewassen cellen werden gesuspendeerd in 100 ul serumvrij RPMI 1640 bevattende 1% foetaal runderserum. Ongeveer 1 x 10 ^{5 cellen /putje werd geplaatst in de bovenste kamer van elke insert. 200 gl RPMI1640 bevattende 20% foetaal runderserum werd toegevoegd in de onderkamer. Na incubatie gedurende 24-48 uur bij 37 ° C in een 5% CO _{2 bevochtigde incubator, werden de cellen gefixeerd met 95% absolute ethanol en gekleurd met kristalviolet [14]. De cellen in de binnenkamer werden verwijderd met een wattenstaafje en de cellen die aan de onderzijde van het membraan werd geteld en afgebeeld onder een omgekeerde microscoop bij 200 x vergroting boven vijf willekeurige velden in elk putje. Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd.}}

Western Blot

Totale eiwitten werden gemeten met de BCA kit (Pierce) volgens het protocol van de fabrikant. De eiwitten cellen werd gefractioneerd door elektroforese op 12% SDS-polyacrylamidegel en elektrisch geblot op nitrocellulose (NC) membranen gedurende 2,5 uur bij 200 V. De NC membranen werden geïncubeerd met blokkerende buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd, gevolgd door overnacht behandeling met het primaire antilichaam bij 4 ° C, en vervolgens met een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (MBL). Na wassen werden de reactieve banden gedetecteerd met een ECL Western blot detectie kit (Millipore) volgens de instructies van de fabrikant. Antilichamen die in dit experiment werden konijnen monoklonaal anti-E-cadherine (Epitomics), anti-vimentine (Epitomics), anti-β-catenine (Epitomics), anti-slak (Cell Signaling), anti-Slug (Cell Signaling), anti -ZEB1 (Cell Signaling), anti-ZEB2 (Santa Cruz), anti-CK2A2 (Santa Cruz) en muis anti-GAPDH (Kang Chen Biotech).

Immunohistochemie

Paraffinecoupes, 3- urn dik, werden gebakken gedurende 2 uur bij 60 ° C en van paraffine ontdaan. Antigeenterugtrekking werd uitgevoerd met natrium citraat buffer (pH 7,2) bij 95 ° C gedurende 15 minuten en daarna werden objectglaasjes bij kamertemperatuur gekoeld gedurende 30 minuten. Na behandeling met 3% waterstofperoxide gedurende 15 minuten om endogeen peroxidase te blokkeren, werden de coupes behandeld met normaal geitenserum beperken vloeistof voor 30 minuten om aspecifieke binding en konijn polyklonaal anti-E-cadherine (Santa Cruz) verminderen of konijn monoklonaal anti-vimentine (Epitomics) geïncubeerd secties gedurende 12 uur bij 4 ° C. Na opwarmen gedurende 1 uur en wassen voor 5 tijden werden secties geïncubeerd met secundair antilichaam gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Diaminobenzidine werd gebruikt voor kleur reacties.

Plasmid Bouw en celtransfectie

De miR-1228 * expressievector (miR-1228 *) of negatieve controle (miR-NC) werd geconstrueerd door het klonen van oligonucleotiden die de geoptimaliseerde miR-1228 * stam-lus bevatten (oligonucleotiden werden ontworpen als: bovenste streng, 5'-TGC TGG TGG GCG GGG GCA GGT GTG TGG TTT TGG CCA CTG ACT GAC CAC ACA CCC CCC CGC CCA C-3 ';. onderste streng, 5'-CCT GGT GGG CGG GGG GGT GTG TGG TCA GTC AGT GGC CAA AAC CAC ACA CCT GCC CCC GCC CAC C-3 ') of negatieve controle stam-loop in pcDNA6.2-GW /EmGFP vector ( Invitrogen) [15]. De 2-kb miR-1228 * promotorregio werd versterkt (primers werden ontworpen als: vooruit, 5'-ATC TAG GGT ACC CTC ACT TGG AG CCA CAC AGA-3 ', omgekeerde, 5'-GAC TGA AGA TCT ACC TCA AGA GTT GGG GTG TG-3 '.) en coloned om pGL3-Enhancer Vector (Promega) [16], genoemd als pGL3-miR-1228 *-promotor. De lege pGL3-enhancer Vector fungeerde als negatieve controle (pGL3-controle). De miR-1228 * doelgebied van de CK2A2 3'UTR sequentie werd chemisch gesynthetiseerd door Shanghai Biotech en stroomafwaarts van de PMIR-RAPPORT luciferase plasmide (Applied Biosystems), genoemd als PMIR-CK2A2 geplaatst. De preceiver-c-Rel ORF kloon met GFP-tag werd gekocht van GeneCopoeia. Om stabiel getransfecteerde cellen te genereren, de miR-1228 * en miR-NC expressie constructen werden getransfecteerd in de SGC-7901-cellijn met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. Na 48 uur, blasticidine (14 ug /ml) werd toegevoegd aan medium. De pGL3-miR-1228 *-promotor /control, GFP-c-Rel /control, PMIR-CK2A2 /control of NF-KB reporter vector (Promega) werden tijdelijk getransfecteerd in SGC-7901 cellen met behulp van Lipofectamine 2000, pRL-TK ( Promega) werd gebruikt als interne normalisatie [17].

Luciferase Reporter assay

Luciferase reporter assay werd uitgevoerd in SGC-7901 cellen. De cellen werden gewassen met PBS en gelyseerd in tweemaal Passive Lysis Buffer (Promega) en de luciferase activiteiten werden gemeten van 20 pl lysaat met het Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) op GloMax 20/20 Luminometer (Promega). Alle gegevens werden verkregen door het middelen van de resultaten van ten minste drie onafhankelijke herhalingen.

Statistische analyse

Verschillen tussen de expressieniveaus van de miR-1228 * bij maagkanker patiënten werden bepaald door de Wilcoxon ondertekende-rank test. De klinische gegevens werden geanalyseerd met behulp van de chi-kwadraat test. T-toets en ANOVA werden gebruikt om de In vitro Kopen en In vivo
gegevens te analyseren. Alle P
waarden waren tweezijdig en verschillen werden gedefinieerd als statistisch significant voor P
< 0,05. Resultaten werden geanalyseerd met behulp van SPSS V.16.0 software (SPSS Inc.). * P < 0,05, ** P < 0.01.

Resultaten

miR-1228 * is vaak down-gereguleerd in Human MaagKanker

In de eerste plaats, om te bepalen of de miR-1228 * is differentieel tot expressie in menselijke primaire maagkankers, het expressieniveau van het rijpe miR-1228 * werd onderzocht onder toepassing van TaqMan real-time PCR in 50 paren van menselijke maagkanker weefsels en pair afgestemd aangrenzende goedaardige gastrische weefsels. Onze resultaten toonden dat het expressieniveau van miR-1228 * significant verlaagd bij maagkanker weefsels in vergelijking met de aangrenzende goedaardige gastrische weefsels (fig. 1A). Ongeveer 72% van de tumor monsters waren lager geuit miR-1228 * (Fig. 1B). Met behulp van 2 ^{-ΔΔCT waarden voudige verandering van miR-1228 * < 1.0 werd beschouwd als laag, terwijl het > 1,0 werd beschouwd als hoge expressie [18]. miR-1228 * expressie werd ook geëvalueerd bij maagkanker cellijnen en een geïmmortaliseerde normale maagslijmvlies epitheliale cellijn (GES-1). Zoals getoond in Fig. 1C, miR-1228 * was significant lage expressie in alle kanker cellijnen in vergelijking met GES-1. Tezamen bieden deze resultaten leveren sterke aanwijzingen dat miR-1228 * werd down-gereguleerd bij maagkanker.}

Bovendien, miR-1228 * expressie werden geëvalueerd met betrekking tot de klinisch-pathologische kenmerken van de patiënten. Alle patiënten hadden geen metastasen en alle weefsels werden histologisch bevestigd met maag adenocarcinomen. Alle gevallen (n = 50) werden in twee groepen verdeeld: miR-1228 * lage expressie (n = 36) en miR-1228 * hoge expressie (n = 14). De miR-1228 * low-expressie groep had neigingen naar grotere grootte van de tumor. Er waren echter geen significante relatie tussen de miR-1228 * expressie en andere clinicopathologic kenmerken, zoals leeftijd, geslacht, histologische type of TNM stadium (tabel 1).

Verhoogde miR-1228 * Expression Onderdrukt Xenograft tumorvorming

om functionele rol van miR-1228 * bij maagkanker te beoordelen, de geoptimaliseerde miR-1228 * stam-lus werd gekloond in pcDNA6.2-GW /EmGFP vector. Maag-cellijn SGC-7901-cellen werden getransfecteerd met pcDNA6.2-GW /EmGFP-miR-1228 * of pcDNA6.2-GW /EmGFP-NC vector en stabiele cellijnen werden gegenereerd en noemde miR-1228 * of miR-NC, respectievelijk. Zoals verwacht, RT-PCR analyse toonde aan dat miR-1228 * stabiele cellen hadden een toename van volwassen miR-1228 * expressie bij het vergelijken miR-NC stabiele cellen (Fig. 2A). Er was geen morfologische verandering in miR-1228 * stabiele getransfecteerde cellen ten opzichte van niet-getransfecteerde cellen. SGC-7901-cellen met of zonder transfectie van miR-1228 * werden subcutaan geïmplanteerd in de flanken van naakt muizen om de mogelijke effecten van miR-1228 * op de maag de groei van kanker te evalueren In vivo
. Overexpressie van miR-1228 * onderdrukt significant de tumorgroei (Fig. 2B). Tegen het einde van de experimentele periode, de grootte en het natte gewicht van tumoren met miR-1228 * overexpressie significant kleiner en lager dan die van de controlegroep (Fig. 2C-D). Zo, de gegevens blijkt dat miR-1228 * remt xenograft tumor groei van maagkanker cellen In vivo
.

NF-KB activering is verantwoordelijk voor de lagere expressie van miR-1228 * in Gastric kanker

Recent onderzoek heeft aangetoond dat de meeste miRNAs hebben transcriptiefactor (TF) bindingsplaatsen en veel studies hebben gemeld dat miRNAs kan worden gereguleerd door TF's [19]. Hier benut we bio-informatica-programma's (Promotor 2.0 en P-match) om potentiële regulatoren van miRNA-1228 * [16], [17] te identificeren. We hebben drie c-Rel bindende domeinen in de 2 kb-miR-1228 * promotorgebied (Fig. 3A). Omdat c-Rel subeenheid is een lid van de familie NF-KB en hyperactivation van NF-KB-activiteit werd aangetoond geassocieerd te worden met maagkanker [20], [21]. Onze hypothese was dat NF-KB-activering wordt toegeschreven aan de neerwaartse regulatie van miR-1228 * bij maagkanker.

Om onze hypothese te bewijzen, hebben we een luciferase construct met miR-1228 * promoter regio en geëvalueerd zijn activiteit in reactie NF-KB activering. Een experiment werd uitgevoerd door het kweken SGC-7901 cellen gedurende 8 uur in aanwezigheid van TNF-α (50 of 100 ng /ml, klassiek NF-kB route activator) en /of pyrrolidine dithiocarbamaat (PDTC, 100 pM), een veel gebruikte remmer van de transcriptiefactor NF-KB [22]. SGC-7901-cellen werden getransfecteerd met pGL3-miR-1228 *-promotor of pGL3-controle, 24 uur later getransfecteerd SGC-7901 cellen werden blootgesteld gedurende 8 uur aan TNF-α met of zonder PDTC te onderzoeken of NF-KB-activering reguleert miR-1228 * promotor activiteit. We vonden dat TNF-α behandeling aanzienlijk remde miR-1228 * promotoractiviteit en remming van NF-KB met PDTC voorkomen TNF-α-gemedieerde downregulatie van de activiteit (Fig. 3B), wat suggereert dat NF-KB negatief kan reguleren buitenspiegels 1228 * expressie. Om verder te bepalen of NF-KB subunit c-Rel is verantwoordelijk voor de deregulering van miR-1228 *, we getransfecteerde SGC-7901 cellen miR-1228 *-promotor met of zonder GFP-c-Rel en zagen een significante daling van luciferaseactiviteit in GFP -c-Rel groep dan controle (Fig. 3C). Gezamenlijk gegevens suggereren dat NF-KB subeenheden c-Rel functioneel draagt ​​bij aan de neerwaartse regulatie van miR-1228 * bij maagkanker.

miR-1228 * Onderdrukt NF-KB-activiteit en CK2A2 Expressie in SGC-7901

om de invloed van miR-1228 onderzoeken * op de NF-kB signaalweg NF-KB reporter constructen werden getransfecteerd in ofwel miR-1228 * of miR-NC stabiele getransfecteerde SGC-7901 cellen en de activiteit van NF-KB luciferase werd bepaald na 48 uur. Onze resultaten toonden dat de activiteit van NF-KB aanzienlijk was afgenomen door overexpressie van miR-1228 * (Fig. 4A), hetgeen een negatieve wisselwerking tussen miR-1228 * expressie en NF-KB-activiteit. Om benedenstroomse targets van miR-1228 * nadere specificatie in de NF-kB route, voerden we bioinformatica-analyse en gevonden CK2A2 was een van de vermeende doelgenen die werden voorspeld. Met behulp van Miranda en RNA22 [23], [24], wij zijn gelegen één potentiële bindingsplaats voor miR-1228 * in het 3'UTR van CK2A2 (Fig. 4B). CK2A2 is een subeenheid van proteïnekinase CK2 die is betrokken bij de NF-kB route [25], [26] en zijn expressie is waargenomen worden opgereguleerd in verschillende kankers waaronder maagkanker [27], [28]. Verder onderzoek naar het verband tussen CK2A2 en miR-1228 * aangetoond dat het eiwit niveaus van CK2A2 was gelijktijdig down-gereguleerd op miR-1228 * stabiele overexpressie in SGC-7901-cellen (Fig. 4C). Om na te gaan of CK2A2 is een echte doelwit van miR-1228 *, een segment van de CK2A2 3'UTR met de bindingsplaats werd gekloond in de 3'UTR van het luciferasegen in PMIR-REPORT plasmide [29]. De fluorescentie-intensiteit van het reportergen was significant verminderd in de groep die was gecotransfecteerd met PMIR-CK2A2 en miR-1228 * vergeleken met de controle (fig. 4D). Deze resultaten suggereren dat miR-1228 * samenwerkt met de CK2A2 mRNA 3'UTR.

miR-1228 * remt EMT

Er is beschreven dat activatie van NF-KB een essentiële rol spelen bij EMT voor progressie van kanker [30], [31], en remming van NF-KB-activiteit in sommige tumorcellijnen veroorzaakt een omkering van EMT [32]. Sinds miR-1228 * lijkt negatief reguleert NF-KB-activiteit, hebben we daarom onderzocht of miR-1228 * kan ook negatief EMT bij maagkanker te reguleren. Western blot toonde aan dat overexpressie van miR-1228 * in SGC-7901 cellen down-gereguleerd mesenchymale markers (vimentine, β-catenine, Slak, Slug, en ZEB1 /2), terwijl de up-gereguleerd epitheliale marker E-cadherine (Fig. 5A ). Bovendien, miR-1228 * overexpressie veroorzaakte een daling van de cel migratie (Fig. 5B-C). Immunohistochemische kleuring werd gebruikt om verder te bevestigen EMT-gerelateerde eiwitten veranderingen van miR-1228 * getransfecteerde SGC-7901 cellen in het xenograft model. Er werd aangetoond dat de expressie van vimentine verminderd en de expressie van E-cadherine verhoogd in vergelijking met die in controle cellen (Fig. 5D). De vergelijkbare resultaten waargenomen bij andere maagkanker cellijn AGS (afb. S1). De gegevens bieden het eerste bewijs dat miR-1228 * restauratie in maagkanker negatief reguleert EMT.

Discussie

Maagkanker is de vierde meest voorkomende kwaadaardige tumor in de wereld en op dit moment is de tweede belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte [33], [34]. Hoewel de huidige praktijk die chemotherapie of radiotherapie combineert met chirurgische resectie sterk is toegenomen de algehele overleving van maagkankerpatiënten, de totale 5-jaarsoverleving is nog steeds laag. Maagkanker wordt beschouwd als een multifactoriële en meerdere stappen die de activatie van oncogenen en inactivering van tumor suppressor genen [35] omvat zijn.

miRNAs endogeen niet-eiwit-coderende korte RNAs die een belangrijke rol spelen bij cellulaire fysiologie, ontwikkeling en ziekten negatief reguleren van genexpressie. Analyses van miRNA expressieprofielen gebleken dat veel miRNAs afwijkend tot expressie gebracht en correleerde met het ontstaan ​​van tumoren, voortgang en prognose van verschillende hematologische en vaste tumoren zoals maagkanker [36]. Te identificeren en op te helderen de biologische functies van miRNAs deregulering bij maagkanker kan ons helpen om beter inzicht in de pathogenese van deze dodelijke ziekte en biedt nieuwe mogelijkheden om miRNA-gebaseerde therapieën te ontwikkelen. Bijvoorbeeld zijn miR-221 en miR-222 bleek positief te reguleren maag proliferatie en invasie van kankercellen, wat suggereert dat selecteert remming van miRNAs die gunstig zijn voor maagkanker behandelingen [37] zijn. miRNAs spelen een rol in de etiologie en pathogenese van verschillende soorten kanker door zich te richten een aantal oncogenen of tumor suppressors genen. miR-21 is overexpressie in H. pylori geïnfecteerde maagslijmvlies en maagkanker weefsels. Gedwongen expressie van miR-21 vergroot de invasieve karakter van maagkanker cellen, RECK is het directe doelwit van miR-21 [38]. miR-218 remt de invasie en uitzaaiing van maagkanker door zich te richten de Robo1 receptor [39]. Ueda et al [40] geïdentificeerd 22 up-gereguleerd en 13 down-gereguleerd miRNAs bij maagkanker versus niet-tumor slijmvlies, Lage expressie van laat-7g en miR-433 en de hoge expressie van miR-214 werden geassocieerd met ongunstige uitkomst van de algehele overleving onafhankelijk van de klinische covariaten, met inbegrip van de diepte van de invasie, lymfe-node metastase, en het podium. miR-375 is vaak neerwaarts gereguleerd bij maagkanker en functioneren als een tumor suppressor gastrische kankercelproliferatie potentieel reguleren door de targeting JAK2 oncogen [10]. Onze andere studie toonde aan miR-1228 * werd een epitheliale kanker-gerelateerde miRNA (niet gepubliceerd). Er zijn echter maar weinig onderzoeken van miR-1228 * gemeld. Guled et al [41] aangetoond dat miR-1228 * sterk werd uitgedrukt in maligne mesothelioom monsters in vergelijking met een normale monsters. Maar de biologische functie van dit miRNA nog niet geëvalueerd. In de onderhavige studie hebben we vastgesteld miR-1228 * werd down-gereguleerd in meer dan 70% van maagkanker monsters in vergelijking met hun nontumor tegenhangers en leveren experimenteel bewijs dat het kan functioneren als een tumorsuppressor met negatief reguleren EMT en remming van NF -κB activiteit.

Onze gegevens gaven downregulatie van miR-1228 * bij maagkanker weefsels en maagkanker cellijnen. Diverse moleculaire mechanismen die leiden tot miRNA ontregeling, zoals genetische mutatie, epigenetische aberratie en gedereguleerd transcriptie-activiteit [42]. TF kan miRNA expressie reguleren door te binden aan promotergebieden, in hetzij fysiologische of pathologische situaties [43]. Om te onderzoeken hoe miR-1228 * werd gedereguleerd bij maagkanker, analyseerden we de 2-kb promoter regio stroomopwaarts van de miR-1228 * en vond drie vermoedelijke c-Rel bindende domeinen. Hoewel de NF-KB is het best bekend om zijn transcriptie-activerende functie, recent werk met p65, RelB en c-Rel aangetoond dat de NF-KB kan down-reguleren van specifieke genen [17], [44], [45]. Met een miR-1228 * promotor- reporter- construct die 2 kb fragmenten van de miR-1228 * promoter bevatte, bleek dat NF-kB route activator TNF-α verlaagde miR-1228 * promoteractiviteit. En NF-KB-remmer PDTC opmerkelijk geantagoneerd TNF-α-gemedieerde miR-1228 * promoter lage activiteit. Onze gegevens bleek ook dat de c-Rel was in staat om direct bindt met miR-1228 * promotor en de expressie negatief te reguleren. Omdat c-Rel subeenheid is een lid van de familie NF-KB, NF-KB activering phenocopied het effect van c-Rel bij het reguleren van miR-1228 * expressie, wat suggereert dat NF-kB route negatief was betrokken bij de neerwaartse regulatie van miR-1228 * bij maagkanker. Bovendien miR-1228 * overexpressie resulteerde ook in de neerwaartse regulatie van NF-KB-activiteit. Daarom is onze gegevens schetsen een dubbele negatieve feedback loop tussen de NF-KB en miR-1228 *. Het exacte mechanisme hoe deze negatieve terugkoppeling treedt moet verder worden onderzocht.

CK2A2 is een subeenheid van proteïnekinase CK2, die een sterk geconserveerd en alomtegenwoordig proteïne serine /threonine kinase. Overexpressie van CK2 is waargenomen in een aantal kankers, waaronder die van de borstklier, prostaat, nier, long, hoofd en nek en maag [27], [46]. Overexpressie van CK2 in de melkklieren van transgene muizen veroorzaakt hyperplasie en dysplasie die uiteindelijk leiden tot adenocarcinoom [47]. CK2 werden tot overexpressie gebracht in het hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom lijnen en weefsels. Knockdown van CK2 subeenheden verschillend geremd IKBa afbraak, NF-kB nucleaire lokalisatie, fosforylering, DNA binding en reporter activiteit [25]. CK2 speelt een belangrijke rol bij Her-2 /neu signalering bevorderen IKB afbraak en NF-KB-activering [26]. In deze studie hebben we aangetoond dat miR-1228 * verminderde de expressie van CK2A2 op eiwitniveau. De luciferase test met een verslaggever die de miR-1228 * bindende sequentie in het 3'UTR van CK2A2 mRNA gesuggereerd dat miR-1228 * direct gericht op de 3'UTR van CK2A2. Samengenomen geven deze gegevens aan dat de onderdrukking van NF-KB-activiteit van miR-1228 * kan worden door targeting CK2A2 expressie. EMT nu al bekend is dat er in een aantal ziekten waaronder de progressie van kanker. Erkend wordt dat EMT is een belangrijk proces diffuse histologie vormen en initiëren metastase door verbetering van de motiliteit van tumorcellen [48]. EMT wordt gereguleerd door verschillende oncogene signaalwegen, zoals AKT en NF-KB [49], [50]. Specifiek is activatie van NF-KB aangetoond dat EMT bevorderen terwijl remming van NF-KB-activiteit in mesenchymale cel veroorzaakt een omkering van EMT [30]. Verlies van E-cadherine en versterking van vimentine expressie worden beschouwd als de belangrijkste moleculaire markers EMT [51] zijn. TFS, zoals slak, Slug, ZEB1 en ZEB2 hebben aangetoond dat het een cruciale rol spelen. miRNAs hebben een belangrijke rol in het reguleren van het EMT proces. Het miR-200 en miR-familie 205 regelen EMT doelwit ZEB1 en ZEB2, welke als transcriptionele repressoren van E-cadherine functie, waardoor de agressiviteit van kankercellen [52] verminderen. Stabiele expressie van miR-155 cellen remt significant heeft ondergaan EMT en remt de expressie van een aantal genen betrokken bij de inductie van EMT [53]. Overexpressie van CK2 was betrokken bij de carcinogenese en ontwikkeling van colorectale kanker door regulatie van EMT-gerelateerde genen [54]. Activering van CK2 en c-Rel induceert EMT via een arylkoolwaterstofreceptor en Slug signaleringsroute [55]. In ons onderzoek herstel van miR-1228 * onderdrukte fenotype EMT en verminderde maagkanker celmigratie Dit zou kunnen toeschrijven aan miR-1228 * gemedieerde neerwaartse regulatie van NF-KB-activiteit en door targeting CK2A2 expressie.

De huidige werk identificeert miR-1228 * als een negatieve regulator van NF-KB-activiteit en benadrukt haar rol in het onderdrukken van EMT en maag de groei van kanker, suggereert dat selectieve restauratie van miR-1228 * gunstig voor maagkanker therapie zou kunnen zijn.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
Effect van miR-1228 * op EMT in AGS-cellen. (A) Western blot analyse van epitheliale marker E-cadherine en mesenchymale marker vimentine in miR-1228 * stabiele getransfecteerde cellen AGS en controle. (B) Transwell migratie test toonde aan dat AGS cellen stabiel getransfecteerd met miR-1228 * hadden lagere trekkende potentieel in vergelijking met miR-NC (× 100)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0058637.s001
( DOC)

Dankwoord

De auteurs danken dr Yongliang Zhu in Second Affiliated Hospital van Zhejiang University College of Medicine voor technische ondersteuning.

• PLoS ONE: Overexpressie van CD151 voorspelt Prognose in Patiënten met weggesneden maagkanker
• PLoS ONE: Superior Antitumoractiviteit van nanodeeltjes albumine-gebonden paclitaxel bij Experimental MaagKanker