Plos ONE: Obnova pokoj-1228 * Expression Zavira epitelijskih-mezenhimskih Prehod iz želodca Cancer

Povzetek

Dysregulated miRNAs igrajo ključne vloge v kancerogenosti in napredovanju raka. V tej študiji je bila funkcija miR-1228 * v, ki ureja napredovanje raka raziskovali pri raku želodca. Zmanjšana je izraz miR-1228 * opazili človeške želodčne rakavih tkiv primerjali z običajnimi tkiva. Kasneje je bila vloga miR-1228 * ocenili in vivo
uporabo modela tumor ksenotransplantskih. V tem modelu, miR-1228 * prekomerno zatreti formaciji ksenogenskega tumorjev. Poleg tega smo dokazali MIR-1228 * negativno urejeno NF-κB dejavnost SGC-7901 raka želodca celice in ugotovila, da CK2A2 bil tarča pokoj-1228 *. Uravnavanjem miR-1228 * zmanjšala izražanje mezenhimskih označevalcev in povečala epitelne marker E-kadherina, kar kaže na njeno morebitno vlogo pri zatiranju epitelne-mezenhimskih prehod. Kolektivno, te ugotovitve predloži prvi dokaz, da * predvaja miR-1228 pomembno vlogo pri uravnavanju rasti raka želodca in kažejo, da * lahko selektivna obnova pokoj-1228 koristna za terapijo raka želodca

Navedba. Jia L Wu J Zhang L, Chen J, Zhong D Xu S, et al. (2013) Obnova pokoj-1228 * Expression Zavira epitelijskih-mezenhimskih Prehod iz želodca raku. PLoS ONE 8 (3): e58637. doi: 10,1371 /journal.pone.0058637

Urednik: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japonska

Prejeto: 25. oktober 2012; Sprejeto: 5. februar 2013; Objavljeno: 12. marec 2013

Copyright: © 2013 Jia et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Avtorji nimajo podpore ali sredstva za sporočanje

nasprotujočimi si interesi.. avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

MicroRNAs (miRNAs) so razred kratek ( 20-23 nukleotidov), endogeni, enoverižna RNA, ki regulirajo izražanje genov, ki jih povzroča premočrtno zatira ali mRNA degradacijo [1], [2]. Prek teh molekularnih mehanizmov, miRNAs imajo normalno bioloških funkcij, kot so ureditev celično proliferacijo, diferenciacijo in apoptozo. Poleg tega so bili dysregulated miRNAs pokazala, da igrajo ključne vloge pri urejanju kancerogenosti in napredovanja raka [3], [4]. Abberant miRNAs izraz so opazili veliko različnih vrst rakavih bolezni, vključno z rakom želodca [5].

epitelijskih-mezenhimskih prehod (EMT) je biološka reprogramiranje dogodek, ki omogoča epitelijskih celic, da opravijo več biokemične spremembe za pridobitev mezenhimske celice fenotip. Medtem EMT je ključnega pomena za ustrezen embrionalni razvoj, povečanje dokazi kažejo, da je odklonski aktivacija EMT vodi maligne napredovanja tumorja [6]. Dokazano je, da EMT je ključni proces prispeva k razvoju raka, označen z izgubo epitelijskih označevalne E-kadherina, povečanje mezenhimskega marker vimentina in povečanje migracijski in invazivne obnašanje [7] [8].

V naši prejšnji študiji z analizo Mirni niz trebušne slinavke krogel raka, je miR-1228 * dalo kot enega miRNAs povezane z rakom (podatki niso prikazani). Tukaj smo predložili dokaze, da je bila miR-1228 * navzdol urejeno v želodčnih tkivih raka v primerjavi z običajnimi tkiva. Obnova izraz pokoj-1228 * v želodčnih rakavih celic močno zavirajo migracijo celic in rast tumorja. Mehanično, smo dokazali, da miR-1228 * zavira aktivacijo NF-κB in potencialno zavira EMT.

Materiali in metode

Cell Culture

linije človekovih želodčni rak celic SGC-7901 , AGS in BGC-823 so bile kupljene z inštituta za biokemijo in biologijo celice (kitajske akademije znanosti). Ena normalne želodca epitelijskih celic linije GES-1 je bila kupljena z Inštituta Pekingu za raziskave raka. Te celice smo vzdrževali pri 37 ° C v 5% CO2 inkubatorju v RPMI-1640 (SGC-7901 in BGC-823), F-12K (AGS) ali DMEM (GES-1) medij, dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma [ ,,,0],9], [10].

Klinični vzorci

Petdeset parov raka želodca in sosednjih vzorcev nerakave tkiva so bili pridobljeni pri bolnikih, ki so doživeli kirurško resekcijo v bolnišnici drugi pridružen, College of Medicine , Zhejiang University. Izravnana nerakave sosednja tkiva smo dobili vsaj 5 cm stran od mesta tumorja. Nihče od bolnikov so prestali radioterapijo ali kemoterapijo pred operacijo. Vzorce tkiva zberemo, snap-zamrznemo v tekočem dušiku in shranili pri -80 ° C do uporabe [11]. Vsa tkiva smo histološko potrjeno želodčnih adenokarcinomi. Študija je odobrila drugo odvisnimi Odbor za etiko bolnišnice Zhejiang University College of Medicine. Podpisan privolitev je bila pridobljena od vseh udeležencev in predstavnikov pacientov, če neposredna soglasja ni bilo mogoče dobiti.

RNA Pridobivanje in Real-time PCR

Total RNA je bila vzeta iz gojenih celic ali tkiva uporabljajo TRIzola (Invitrogen) in koncentracija celotnega RNA smo določili. Sinteza cDNA in PCR v realnem času smo izvedli z uporabo TaqMan MicroRNA povratne Transcription Kit (Applied Biosystems) in TaqMan MicroRNA analiznega kompleta (Applied Biosystems) oz. PCR v realnem času smo izvedli na Applied Biosystems StepOnePlus ™ v realnem času PCR sistem v skladu s protokolom. Stopnja izraz miR-1228 * je normalizirana na RNU6B. realnem času PCR reakcije so bile izvedene v treh izvodih. Relativna izraz miRNAs je bila izračunana z uporabo primerjalne metode Ct [12].

Tumor Cepljenje Vsebnost v golih miših

Ženska BALB /c gole miši pri starosti 4 tedne so bili kupljeni od Shanghai Laboratory Center za živali (Chinese Academy of Sciences). Vsi postopki, ki vključujejo živali, je odobril odbor eksperimentalno živali etiko, College of Medicine, Zhejiang University. MIR-1228 * ali miR-NC stabilno transfekcijo suspenzije celic SGC-7901 (2,5 x 10 ^{7 celic /ml) v 200 ul mediju brez seruma smo subkutano injiciramo v boki golih miši, oz. Rast tumorja je bila preučena dvakrat tedensko 5 tednov in volumen tumorja (V) smo spremljali z merjenjem dolžine (L) in širino (W) tumorja z čeljusti in izračunana s formulo V = 1/2 (L x W × W) [13].}

Cell migracije

migracija sposobnost pokoj-1228 * ali miR-NC stabilen transfekcijskih SGC-7901 celic so odkrili s pomočjo Transwells (velikost por 8 mm, Corning). V Transwells se je začela 24-vdolbinami za. Sveže tripsinizirali in izperemo celice smo suspendirali v 100 ul RPMI1640 brez seruma, ki vsebuje 1% fetalnega govejega seruma. Okoli 1 x 10 ^{5 celic /jamico damo v zgornji komori vsak vložek. 200 xl RPMI1640, ki vsebuje 20% fetalnega govejega seruma smo dodali v spodnje komore. Po inkubiranju 24-48 ur pri 37 ° C v 5% CO _{2 navlaženem inkubatorju smo celice določen z 95% absolutni alkohol in obarvamo z kristal vijoličnim [14]. Celice v notranjo komoro smo odstranili z vato in celice pritrjena na spodnji strani membrane preštejemo in posneta pod obrnjenem mikroskopom na x 200 povečavi več kot pet naključnih polj vsako vdolbino. Vsak poskus smo izvedli v treh izvodih.}}

Western Blot

Skupaj proteinov smo izmerili z BCA komplet (Pierce) po protokolu proizvajalca. Proteini celic smo deljeno z elektroforezo na 12% SDS poliakrilamidnem gelu in elektro osušili na nitrocelulozi (NC) membrane za 2,5 ure na 200 V. NC membrane inkubiramo z 1 uro pri sobni temperaturi pufru za blokiranje, čemur sledi obdelava čez noč s primarnim protitelesom pri 4 ° C, in nato z HRP-konjugiranega sekundarnega protitelesa (MBL). Po pranju, so bile odkrite reaktivne trakovi pomočjo ECL Western komplet za odkrivanje madež (Millipore), v skladu z navodili proizvajalca. Protitelesa, ki se uporabljajo v tem poskusu so rabbit monoklonsko anti-E-kadherina (Epitomics), anti-vimentina (Epitomics), anti-β-catenin (Epitomics), anti-Polž (Cell signalizacija), anti-Slug (Cell signalizacija), anti -ZEB1 (Cell signalizacija), anti-ZEB2 (santa Cruz), anti-CK2A2 (santa Cruz) in miško anti-GAPDH (KangChen Biotech).

Imunohistokemija

Parafinski profili, 3- im debeline so pekli 2 uri pri 60 ° C in deparaffinized. Antigen Preiskovalna smo izvedli z uporabo citratnega pufra natrijev (pH 7,2) pri 95 ° C 15 minut in nato smo drsi ohladimo pri sobni temperaturi 30 minut. Potem se zdravijo s 3% vodikovega peroksida na 15 minut, da blokira endogenega peroksidazo, so odseki obdelamo z običajnimi kozji serum neprepustni tekočino za 30 minut za zmanjšanje nespecifične vezave in nato zajec poliklonski anti-E-kadherina (Santa Cruz) ali kunec monoklonsko anti-vimentina (Epitomics) je bil inkubiran odseke 12 ur pri 4 ° C. Po Ponovno segrevanje 1 h in izpiranjem za 5-krat, smo sekcije inkubirali s sekundarnim protitelesom 30 minut pri sobni temperaturi. Diaminobenzidine je bila uporabljena za barvne reakcije.

plazmida Gradbena in Cell Transfekcija

MIR-1228 * izražanje vektor (miR-1228 *) ali negativno kontrolo (miR-NC) je bil zgrajen s kloniranjem oligonukleotidov, ki je vsebovalo optimizirana miR-1228 * steblo-zanka (oligonukleotidi so bili zasnovani kot so: zgornji sklop, 5'-TGC TGG TGG GCG GGG GCA GGT GTG TGG TTT TGG CCA CTG ACT GAC CAC ACA CCC CCC CGC CCA C-3 ';. spodnji sklop, 5'-SCT GGT GGG CGG GGG GGT GTG TGG TCA GTC AGT GGC CAA AAC CAC ACA SCT GCC CCC GCC CAC C-3 ') ali negativna kontrola izvornih loop v pcDNA6.2-GW /EmGFP vektorja ( Invitrogen) [15]. 2-kb miR-1228 * promotor regija je bila dopolnjena (primerji so bili zasnovani kot: naprej, TAG 5'-ATC GGT ACC CTC ACT TGG AG CCA CAC AGA-3 ", zaustavitve, 5-GAC TGA AGA TCT ACC STS AGA GTT GGG GTG TG-3 ".) in coloned za pGL3-Enhancer Vector (Promega) [16], imenovan kot pGL3-miR-1228 * -promoter. Prazen pGL3-Enhancer Vector deloval kot negativno kontrolo (pGL3-kontrola). MIR-1228 * ciljna regija zaporedja CK2A2 3'UTR je kemično sintetizirane Shanghai Biotech in vstavi dolvodno od luciferazno plazmida v pMIR-POROČILO (Applied Biosystems), imenovan kot pMIR-CK2A2. PReceiver-c-Rel ORF klon z GFP-tag je bila kupljena od GeneCopoeia. Če želite ustvariti stabilne transfektiranih celic, so bile MIR-1228 * in miR-NC izraz konstrukti transfektirali v skladu z SGC-7901 celic z uporabo Lipofectamine 2000 (Invitrogen), v skladu z navodili proizvajalca. Po 48 urah, blasticidin (14 g /ml) smo dodali k mediju. PGL3-miR-1228 * -promoter /kontrola, GFP-c-Rel /nadzor, pMIR-CK2A2 /nadzor ali NF-κB reporter vektor (Promega) so začasno transfektirali v SGC-7901 celic z uporabo Lipofectamine 2000, PRL-TK ( Promega) je bila uporabljena kot notranji normalizacije [17].

luciferaza Reporter Vsebnost

luciferaza novinar test je bil izveden v SGC-7901 celic. Celice smo sprali s PBS dvakrat in liziramo v Pasivna liznega pufra (Promega) in luciferazni dejavnosti so izmerili od 20 ul lizata z Dual-luciferazno Reporter preskusnega sistema (Promega) na GloMax 20/20 Luminometer (Promega). Vsi podatki so bili pridobljeni z izračunom povprečja rezultatov iz najmanj treh neodvisnih ponovitev.

Statistična analiza

Razlike med izražanjem MIR-1228 * pri bolnikih z rakom želodca so določena z Wilcoxonovim Test podpisan-rank. Klinični podatki so bili analizirani s testom hi-kvadrat. T-test in ANOVA smo uporabili za analizo in vitro
in vivo
podatkov. Vse
P vrednosti so dvostranski in razlike so bile opredeljene kot statistično značilne za P
< 0,05. Rezultati so bili analizirani s pomočjo V.16.0 programske opreme SPSS (SPSS Inc). * P < 0,05, ** P < 0.01.

Rezultati

miR-1228 * je pogosto Dol-urejeno v humani Rak želodca

Prvič, da se ugotovi, ali je miR-1228 * je različno izražena v človeški primarni želodca raka, je preučila raven izraz zrele miR-1228 * uporabo TaqMan PCR v realnem času v 50 parov človeških želodca tkiv rakom in pari ujema sosednjih noncancerous želodčnega tkiva. Naši rezultati so pokazali, da je nivo izražanja miR-1228 * bistveno zmanjšal v želodčnih tkivih raka v primerjavi s sosednjimi noncancerous želodčnega tkiva (sl. 1A). Okoli 72% vzorcev tumorjev so bile nižje, izraženo z miR-1228 * (sl. 1B). Uporaba 2 ^{-ΔΔCT vrednote, kratno spremembo Mira-1228 * < 1.0 je zdelo tako nizko, medtem ko ji > 1.0 je bilo obravnavano kot visoko ekspresijo [18]. miR-1228 * izraz je bila ocenjena tudi v želodčnih raka celičnih linijah in eden ovekovečil normalno želodčne sluznice epitelne celične linije (GES-1). Kot je prikazano na sliki. 1C, miR-1228 * je precej nizka izraz v vseh rak celičnih linijah v primerjavi z GES-1. Če povzamemo, ti rezultati zagotavljajo trdne dokaze, da je bil miR-1228 * down-urejeno v raka želodca.}

Poleg tega miR-1228 * izraz so bili ocenjeni glede na zastavljene clinicopathological značilnosti bolnikov. Vsi bolniki so imeli razdalje metastaze in vsa tkiva so bili histološko potrjeni s želodčnih adenokarcinome. V vseh primerih (n = 50) bili razdeljeni v dve skupini: miR-1228 * nizko izražanje (n = 36) in miR-1228 * visoka ekspresija (n = 14). miR-1228 * nizko izraz skupina je imela nagnjenja v smeri večje velikosti tumorja. Vendar pa ni bilo bistvenih odnosi med MIR-1228 * izražanje in druge clinicopathologic funkcije, kot so starost, spol, histološki tip ali stopnjo TNM (tabela 1).

Povečana miR-1228 * Expression Zavira ksenotransplantskih tumorje Formation

da bi ocenili funkcionalno vlogo pokoj-1228 * pri raku želodca je optimizirana miR-1228 * izvornih loop smo klonirali v pcDNA6.2-GW /EmGFP vektor. Želodca celične linije celic SGC-7901 so transfekciji s pcDNA6.2-GW /EmGFP-miR-1228 * ali pcDNA6.2-GW /EmGFP-NC vektorske in stabilno celičnih linij smo ustvarili in ga poimenovali miR-1228 * ali miR-NC, oz. Kot je bilo pričakovati, analizo RT-PCR je pokazala, da je imel miR-1228 * stabilnih celic, kar je za zrelo pokoj-1228 * izražanja pri primerjavi z miR-NC stabilnih celic (sl. 2A). Ni bilo sprememb morfološka v miR-1228 * stabilnih-transfekcije celic v primerjavi z nontransfected celic. SGC-7901 celic z ali brez transfekciji pokoj-1228 * so podkožno vsadili v boki golih miškah, da oceni možne učinke pokoj-1228 * na rast raka želodca in vivo
. Prekomerno miR-1228 * bistveno zavre rast tumorja (sl. 2B). Ob koncu poskusnega obdobja, velikost in mokra teža tumorjev z miR-1228 * prekomerno bil bistveno manjši in manjši kot pri kontrolni skupini (sl. 2C-D). Tako, podatki kažejo, da miR-1228 * zavira ksenotransplantskih rast tumorja želodca rakavih celic in vivo
.

NF-κB Aktiviranje je odgovoren za Spodnje izražanju pokoj-1228 * želodčnega rak

Najnovejše delo je pokazalo, da ima večina miRNAs transkripcijski faktor (TF) veznih mest in številne študije so poročali, da bi lahko miRNAs ureja TF [19]. Tu uporabljeni bioinformatika programi (Promotor 2,0 in P-match) za prepoznavanje morebitnih regulatorji miRNA-1228 * [16], [17]. Našli smo tri c-Rel vezavo domene v 2-kb miR-1228 * promotorska regija (sl. 3A). Ker je c-Rel podenota je član družine NF-κB in hiperaktivnih NF-κB dejavnosti je bilo dokazano, da so povezani z rakom želodca [20], [21]. Domnevali smo, da je aktiviranje NF-κB pripisati downregulation Mira-1228 * raka želodca.

Da bi dokazali svojo hipotezo, smo ustvarili luciferaza konstrukt s pokoj-1228 * promotor regije in oceniti svoje dejavnosti v odgovor aktivacije NF-κB. Poskus smo opravili z gojenjem SGC-7901 celic za 8 ur v prisotnosti TNF-a (50 ali 100 ng /ml, klasična NF-κB pot aktivator) in /ali pirolidinskega ditiokarbamat (PDTC, 100 uM), ki se pogosto uporablja zaviralec transkripcijski faktor NF-κB [22]. SGC-7901 Celice so transfekciji s pGL3-pokoj-1228 * -promoter ali pGL3-control, 24 ur kasneje, transfektirane SGC-7901 celice smo izpostavili za 8 ur na TNF-a, z ali brez PDTC, da razišče, ali NF-κB aktiviranja regulira miR-1228 * promotor dejavnost. Ugotovili smo, da se zdravljenje TNF-alfa močno zavrla miR-1228 * promotor dejavnost in zaviranje NF-κB z PDTC preprečiti TNF-alfa-posredovano downregulation od stopenj aktivnosti (sl. 3b), kar kaže, da lahko NF-κB negativno regulacijo miR- 1228 * izraz. Da bi še ugotoviti, ali je NF-κB podenote c-Rel odgovoren za deregulacijo miR-1228 *, smo transfektirali SGC-7901 celice miR-1228 * -promoter z ali brez GFP-c-Rel in opazili precejšnje zmanjšanje luciferazne aktivnosti v GFP -c-Rel skupino kot kontrolo (sl. 3C). Kolektivno, podatki kažejo, da NF-κB podenote c-Rel funkcionalno prispeva k downregulation Mira-1228 * raka želodca.

miR-1228 * Zavira NF-κB dejavnosti in CK2A2 Izražanje v SGC-7901

da bi raziskali vpliv pokoj-1228 * na NF-κB signalnih poti, so NF-κB reporter konstrukti transfektirali v vsaki pokoj-1228 * ali miR-NC stabilne transfekcije SGC-7901 celic in aktivnosti NF-κB luciferazno določimo po 48 urah. Naši rezultati so pokazali, da je bila aktivnost NF-κB znatno zmanjšal s prekomerno miR-1228 * (sl. 4A), kar kaže na negativne povratne zanke med pokoj-1228 * izražanja in NF-κB dejavnosti. Za opredelitev nadaljnjim ciljev miR-1228 * v NF-κB poti, smo izvedli bioinformatiÄŤnih analizo in ugotovili, CK2A2 je bil eden od domnevnih ciljnih genov, ki so bile predvidene. Uporaba Miranda in RNA22 [23], [24], smo se nahaja en potencialno vezavno mesto za pokoj-1228 * na 3'UTR CK2A2 (sl. 4B). CK2A2 je ena podenota protein kinaze CK2, ki je vključen v NF-κB poti [25], [26] in je bilo opaziti njen izraz, ki se up-urejena na več vrst raka, vključno z rakom želodca [27], [28]. Nadaljnje študije o povezavi med CK2A2 in pokoj-1228 * pokazala, da je raven beljakovin v CK2A2 sočasno navzdol urejen z miR-1228 * stabilno prekomerno v SGC-7901 celic (si. 4c). Da bi preverili, ali je CK2A2 pravi cilj miR-1228 *, je segment CK2A2 3'UTR vsebuje vezavno mesto klonirali v 3'UTR gena luciferaze v pMIR-POROČILO plazmida [29]. Fluorescentna intenzivnost reporterskega gena je bistveno nižja v skupini, ki je sočasno transfektirana z pMIR-CK2A2 in miR-1228 * primerjavi s kontrolo (sl. 4D). Ti rezultati kažejo, da miR-1228 * sodeluje s CK2A2 mRNA 3'UTR.

miR-1228 * Zavira EMT

To so poročali, da je aktivacija NF-κB igrajo pomembno vlogo pri EMT za napredovanja raka [30], [31] ter z inhibicijo aktivnosti NF-κB v nekaterih celičnih linijah tumorskih povzročil preobrat EMT [32]. Ker pokoj-1228 * zdi, da negativno ureja NF-κB dejavnost, zato smo raziskali, če miR-1228 * lahko tudi negativno urediti EMT na raka želodca. Western blot je pokazala, da prekomerno miR-1228 * v SGC-7901 celic down-regulirane mezenhimske označevalci (vimentina, β-catenin, polž, polž, in ZEB1 /2), medtem ko je do regulirane epitelijskih dvojno podajo E-kadherina (sl. 5A ). Poleg tega miR-1228 * prekomerno povzročila zmanjšanje migracije celic (sl. 5B-C). Imunohistokemijsko je bila uporabljena za nadaljnjo potrditev povezane z EMT beljakovine spremembe pokoj-1228 * transficirane SGC-7901 celice v modelu ksenotransplantskih. Pokazalo se je, da izraz vimentina zmanjšala in izražanje E-kadherina povečana v primerjavi s katerimi v kontrolnih celicah (sl. 5d). Podobne ugotovitve so bile v drugi želodčni rak celične linije AGS (sl. S1) opazili. Podatki zagotovil prvo dokaze, da miR-1228 * obnova raka želodca negativno uravnava EMT.

Pogovor

Rak želodca je četrti najpogostejši maligni tumor na svetu in trenutno je drugi najpogostejši vzrok povezane z rakom smrtnost [33], [34]. Čeprav je sedanja praksa, ki združuje kemoterapijo ali obsevanjem, zdravljenje s kirurško resekcijo močno povečala skupno preživetje bolnikov z rakom želodca, splošno 5-letno preživetje je še vedno nizka. Želodca nastanek raka, se šteje, da je več dejavnikov in večstopenjski proces, ki vključuje aktiviranje onkogeni in inaktivacijo zaviralnih genov [35].

miRNAs so endogeni non-protein-kodiranje kratke RNA, ki igrajo pomembno vlogo v celični fiziologija, razvoj in bolezni, ki jih negativno regulacijo izražanja genov. Analize miRNA izražanja profilov so pokazale, da so mnogi miRNAs odklonsko izražena in v korelaciji s tumorigeneze, napredovanja in prognozo različnih hematoloških in solidnih tumorjev, vključno z rakom želodca [36]. Za opredelitev in pojasnitev bioloških funkcij miRNAs deregulacija na raka želodca nam lahko pomaga bolje razumeti patogenezo tej smrtonosni bolezni in zagotavlja nove priložnosti za razvoj terapij, ki temeljijo na Mirni. Na primer, miR-221 in miR-222 se je pokazalo, da se pozitivno regulacijo proliferacije želodčni rak celic in invazijo, kar kaže, da je treba izbrati zaviranje teh miRNAs koristno za zdravljenje želodčnih zdravljenja raka [37]. miRNAs igrajo vlogo v etiologiji in patogenezi raznih raka z usmerjanjem več onkogenov ali tumorskih valov genov. miR-21 je močno izraženi pri H. pylori okuženi želodčne sluznice in želodčnega raka tkiva. Prisilno izraz miR-21 povečuje invazivnost želodčnih rakavih celic, RECK je neposredna tarča miR-21 [38]. miR-218 zavira invazijo in metastaze raka želodca z usmerjanjem Robo1 receptor [39]. Ueda et al [40] je opredelilo 22 do regulirane in 13 navzdol regulirane miRNAs pri raku želodca v primerjavi z ne-tumorske sluznice, Low izražanja oddajal-7g in pokoj-433 in visoko izražanje miR-214 so bili povezani z neugodnim izidom v skupni preživetje odvisen od kliničnih spremenljivk, vključno z globino invazije, limfna vozlišča metastaz, in fazo. miR-375 je pogosto navzdol urejeno z rakom želodca in funkcije kot zaviralnih za regulacijo proliferacije želodčni rak celic lahko z usmerjanjem JAK2 onkogena [10]. Naša druga študija je pokazala, miR-1228 * je bil en rak epitelijskih povezane Mirna (neobjavljeno). Vendar pa so poročali le malo raziskav Mira-1228 *. Guled et al [41] je pokazala, da je bila miR-1228 * zelo izražene v malignih vzorcev mezoteliom v primerjavi z običajnimi vzorci. Toda biološka funkcija tega miRNA še ni bila ocenjena. V tej študiji, smo ugotovili, da je bil miR-1228 * navzdol regulirano v več kot 70% vzorcev raka želodca v primerjavi z njihovimi nontumor kolegi in zagotoviti eksperimentalno dokaze, da lahko deluje kot tumorski supresorski skozi negativno regulacijo EMT in inhibira NF -κB dejavnost.

Naši podatki kažejo, downregulation Mira-1228 * v želodčnih tkivih rakom in želodca raka celičnih linijah. Različne molekularne mehanizme privede do miRNA disregulacijo, kot je genska mutacija, epigenetske aberacije in liberaliziranega transkripcijske aktivnosti [42]. TFS mogli urediti Mirna izraz, ki se veže na promotor regijah, bodisi fizioloških ali patoloških kontekstih [43]. Da bi raziskali, kako miR-1228 * je deregulacije raka želodca, smo analizirali 2-kb promotorja, gorvodno od pokoj-1228 * in našel tri domnevna c-Rel zavezujoče domen. Čeprav je NF-κB najbolj znan po svoji aktivacijo transkripcije funkcijo, nedavno delo z p65, RelB in c-Rel pokazala, da lahko NF-κB navzdol urediti posebne gene [17] [44] [45]. Uporaba MIR-1228 * promotor, novinar konstrukt, ki vsebuje 2-kb fragmente * promotor miR-1228, smo ugotovili, da NF-κB pot aktivator TNF-α zmanjšala miR-1228 * promotor dejavnost. In NF-κB zaviralec PDTC izredno antagonistično TNF-α-posredovano MIR-1228 * promotor nizko aktivnost. Naši podatki tudi pokazala, da je bil Rel c-lahko neposredno veže z miR-1228 * promotorja in negativno urediti njegovo izražanje. Ker je c-Rel podenota je član družine NF-κB, aktiviranje NF-κB phenocopied učinke c-Rel pri urejanju miR-1228 * izraz, kar kaže, da je bil NF-κB pot negativno vključeni v downregulation Mira-1228 * pri raku želodca. Poleg tega miR-1228 * prekomerno vplivale tudi na downregulation od NF-κB dejavnosti. Zato so naši podatki predstavili dvojno negativne povratne zanke med NF-κB in pokoj-1228 *. Natančen mehanizem, kako pride do te negativne povratne informacije je treba dodatno preučiti.

CK2A2 je ena podenota protein kinaze CK2, ki je zelo ohranjena in vseprisotnih protein serin /treonin kinaze. Čezmernim CK2 so opazili pri mnogih vrst raka, vključno s tistimi iz mlečne žleze, prostate, ledvic, pljuč, glave in vratu in želodca [27], [46]. Čezmerno CK2 v mlečnih žlez transgenih miši povzroči hiperplazijo in displazije, ki sčasoma privede do adenokarcinome [47]. CK2 so bili izraženi pri glavi in ​​vratu ploščatoceličnega karcinoma linij in tkiv. Rasklapanje od CK2 podenot različno zaviral IκBα razgradljivosti NF-κB jedrska lokalizacijo, fosforilacijskih, vezava DNK in reporter dejavnosti [25]. CK2 igra pomembno vlogo pri Her-2 /neu signalizacijo, spodbujanje IκB degradacije in aktivacije NF-κB [26]. V tej študiji smo pokazali, da miR-1228 * zmanjšano ekspresijo CK2A2 na ravni proteina. Luciferazni test z reporter vsebuje MIR-1228 * zavezujoče zaporedje na 3'UTR CK2A2 mRNA predlagal, da miR-1228 * neposredno namenjen 3'UTR CK2A2. Če povzamemo, ti podatki kažejo, da * lahko zatiranje NF-κB dejavnosti, ki jih pokoj-1228 s ciljanjem CK2A2 izraz. EMT je znano sedaj vsi pojavijo pri različnih boleznih, vključno napredovanje raka. Znano je, da je EMT pomemben proces, da tvorijo razpršeno histologijo in sproži metastaze z večjo gibljivost tumorskih celic [48]. EMT je urejeno z različnimi onkogenih signalnih poti, kot AKT in NF-κB [49], [50]. Natančneje, je aktiviranje NF-κB dokazano spodbuja EMT, medtem ko zaviranje aktivnosti NF-κB v mezenhimskega celici povzroči preobrat EMT [30]. Izguba E-kadherina izražanja in dobiček vimentina izražanja velja za najpomembnejši molekularni markerji EMT [51]. TFS, kot Polž, Slug, ZEB1 in ZEB2, se je izkazalo, da imajo pomembno vlogo. miRNAs imajo ključno vlogo pri urejanju proces EMT. MIR-200 družina in miR-205 urediti EMT z usmerjanjem ZEB1 in ZEB2, ki je delovala kot transkripcijske represorji za E-kadherina izražanja, s čimer se zmanjša agresivnost rakavih celic [52]. Stabilno ekspresijo miR-155 bistveno zavira celic postopku EMT in inhibira ekspresijo številnih genov, povezanih z indukcijo EMT [53]. Čezmerno CK2 bil vpleten v kancerogenosti in razvoj raka na debelem črevesu s predpisi, povezanih z EMT genov [54]. Aktivacija CK2 in c-Rel povzroča EMT preko receptorja aril ogljikovodikov in Slug signalnih poti [55]. V naši raziskavi, obnova pokoj-1228 * zatreti EMT fenotip in zmanjša migracijo želodčni rak celic, bi to morda pripisati pokoj-1228 * pogojenega downregulation od NF-κB dejavnosti in prek ciljnih CK2A2 izraz.

Diplomsko delo opredeljuje MIR-1228 * kot negativni regulator NF-κB dejavnosti in poudarja svojo vlogo pri preprečevanju EMT in rast raka na želodcu, predlaga, da bi bila selektivna obnova miR-1228 * koristna za terapijo raka želodca.

Podpora Informacije
sliki S1.
Učinek pokoj-1228 * na EMT v AGS celicah. (A) Western analiza blot epitelnega marker E-kadherina in mezenhimskega marker vimentina v pokoj-1228 * stabilne transfekcije AGS celic in nadzora. (B) Transwell migracije testa so pokazali, da je stabilen transfekciji s pokoj-1228 * imela AGS celice nižja migracijskega potenciala v primerjate z miR-NC (x 100)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0058637.s001
( DOC)

Zahvala

avtorji hvala dr Yongliang Zhu v drugi odvisnimi bolnišnica Zhejiang University College of Medicine za tehnično pomoč.

• Plos ONE: Čezmerno CD151 napoveduje prognozo pri bolnikih z odstranjenimi želodca Cancer
• Plos ONE: Superior antitumorsko aktivnost nanodelcev albuminov-Bound Paklitaksel eksperimentalne Rak želodca