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PLoS ONE: Lumaca-regolamentato miR-375 inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule cancro gastrico di mira JAK2

Astratto

I microRNA (miRNA) sono stati segnalati a svolgere un ruolo critico nella invasione del cancro e metastasi. Il nostro precedente studio ha dimostrato che miR-375 di frequente downregulated nel carcinoma gastrico sopprime la proliferazione delle cellule di mira Janus chinasi 2 (JAK2). Qui, abbiamo inoltre riscontrato che il livello di espressione di miR-375 è significativamente diminuita nei tessuti carcinoma gastrico metastatico rispetto ai controlli non-metastasi. espressione ectopica di miR-375 inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico parzialmente di mira JAK2. Inoltre, miR-375 espressione è regolata negativamente dalla metastasi associata fattore di trascrizione lumaca, che si lega direttamente al promotore putativo di miR-375. Inoltre, l'iperespressione di lumaca può parzialmente invertire l'inibizione della migrazione delle cellule cancro gastrico causato da miR-375. Presi insieme, questi dati suggeriscono che miR-375 può essere regolata negativamente da lumaca e coinvolti nella migrazione cellulare cancro gastrico e l'invasione potenzialmente di mira JAK2

Visto:. Xu Y, Jin J, Liu Y, Z Huang, Deng Y, si T, et al. (2014) Lumaca-regolamentato miR 375-inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule cancro gastrico di mira JAK2. PLoS ONE 9 (7): e99516. doi: 10.1371 /journal.pone.0099516

Editor: Ming Tan, University of South Alabama, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 7 Febbraio, 2014; Accettato: 15 maggio 2014; Pubblicato: 23 Luglio, 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stata sostenuta da Natural scientifico Fondazione della Cina (31301149, 31071221, 31190063, 31125017 e 31100975), Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2013CB945603, 2012CB945004 e (2011CBA01001), Ministero della Pubblica Istruzione della Cina (20.110.101,110103 millions e (20.130.101,120001 millions), scientifico naturale Fondazione della provincia di Zhejiang, Cina (LQ13H160013, LQ14H160003, Z2100247 e Y2100106), il 111 Progetto (B13026), fondi per la ricerca fondamentale per l'università centrali (2014QNA7015) e Zhejiang Programma Provinciale per la coltivazione di alto livello talenti sanitari innovativi. il finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che nessun interesse facente concorrenza esiste

Introduzione

le metastasi sono gli aspetti più terribili di cancro ed è stato studiato per più di 100 anni [1], [2]. Nel cancro gastrico, l'alto tasso di mortalità attribuisce principalmente alla diagnosi ritardata a causa della mancanza di sintomi specifici in fase iniziale. E metastasi è responsabile per la mortalità per cancro gastrico legati [3], [4]. La migrazione e l'invasione delle cellule tumorali sono processi essenziali durante il cancro processione metastatico che consiste in una serie di passaggi interconnessi, tra cui la proliferazione, il distacco, la circolazione, il trasporto, l'arresto di organi, aderenza alla parete del vaso, stravaso, la creazione di un microambiente, e la proliferazione di organi distanti. Nel cancro gastrico, le cellule invasione nei tessuti circostanti è un primo passo fondamentale [3], [5]. Tuttavia, i meccanismi di gastrica cellule tumorali migrazione, invasione e metastasi non sono stati pienamente compreso.

Negli ultimi anni, varie molecole, per esempio, fattori di crescita, citochine, molecole della matrice extracellulare-rimodellamento, e alcuni fattori di trascrizione come la lumaca, Twist e ZEB1 [6], [7], [8], [9], [10], [11], sono stati rivelati per guidare il progresso delle cellule tumorali migrazione, invasione e metastasi. Ultimamente, è diventato evidente che, oltre ad anomalie nei geni codificanti proteine, alterazioni in geni non codificanti possono anche contribuire alla migrazione delle cellule tumorali, invasione e metastasi, come miRNA, che sono una classe di piccoli singolo filamento codificanti non molecole di RNA che regolano l'espressione genica con un grande potenziale e sono stati implicati nella regolazione delle cellule tumorali migrazione, invasione e metastasi come attivatori o soppressori [12], [13], [14], [15], [16] . Ad oggi, sono stati studiati una serie di miRNA essere implicati nella progressione del cancro metastasi gastrico, per esempio, miR-218, miR-9, miR-7, e miR-146a [6], [17], [18], [19]. Abbiamo studiato l'associazione tra specifiche dysregulated miRNA e passo le metastasi specifico del cancro gastrico, che fornirà approfondimenti sui potenziali meccanismi di gastrico cellule tumorali migrazione, invasione e metastasi.

Nel nostro precedente studio, miR-375 è stato significativamente downregulated nel cancro gastrico e inibito cellule di cancro gastrico proliferazione di mira JAK2 [20]. È interessante notare che, nel presente studio, abbiamo riscontrato, inoltre, che il livello di espressione di miR-375 era ancora più bassa in campioni di cancro gastrico da pazienti metastasi positivi confrontato con quello dei pazienti senza metastasi. Così, abbiamo proposto che miR-375 potrebbe avere un ruolo causale nella metastasi del cancro gastrico. I nostri studi hanno scoperto che l'espressione ectopica di miR-375 ha inibito la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico anche parzialmente di mira JAK2. Abbiamo inoltre spinti a scoprire come espressione di miR-375 è stato regolamentato nel cancro gastrico. I risultati hanno indicato che il miR-375 era un bersaglio delle metastasi associata fattore di trascrizione Lumaca e la sua espressione era inversamente correlata con la lumaca nel cancro gastrico. Sovraespressione di lumaca può parzialmente invertire l'inibizione della migrazione delle cellule cancro gastrico causato da miR-375. Così, i nostri risultati dimostrano che miR-375 inibisce la migrazione gastrica cellule tumorali e l'invasione attraverso Lumaca /miR-375 /regolazione JAK2 percorso.

Materiali e Metodi

campioni clinici (Etica Statement) e delle cellule linee

campioni di cancro gastrico clinici e loro campioni gastrici non maligne coppia corrispondenza provenienti da 39 pazienti sottoposti a resezione cancro gastrico sono stati forniti da Ospedale Sir Run Run Shaw (Hangzhou, Cina). Tutti i campioni sono stati raccolti con il consenso scritto da parte dei pazienti, come descritto in precedenza [20]. Entrambi i tessuti tumorali gastriche e adiacenti tessuti gastrici nontumorous raccolti dopo l'intervento chirurgico sono stati e diviso in due parti. Uno è stato congelato in azoto liquido immediatamente per ulteriore uso, un'altra parte è stato immagazzinato in formalina per analisi patologia. I pazienti coinvolti nel nostro studio sono stati divisi in metastasi libero e gruppi metastasi-positivo (9/30). Le linee di cancro gastrico cellulari (AGS e MGC-803) e una linea di cellule epiteliali gastriche non maligno (GES-1) sono state descritte in precedenza [20].

RNA estrazione

L'RNA totale da campioni e linee cellulari gastrico è stato estratto utilizzando il kit di isolamento Mirvana miRNA (Ambion, TX, USA) seguendo il protocollo del produttore.

quantitativa real-time PCR analisi

l'espressione del miR-375 è stato analizzati utilizzando il Taqman MicroRNA Assays (Applied Biosystems, CA, USA) con primer specifici (P /N: 4.373.151, Applied Biosystems). reazione di trascrizione inversa è stata effettuata a partire da 10 ng di RNA totale utilizzando i primers loop. Quantitativa real-time PCR (qRT-PCR) è stata eseguita utilizzando il protocollo standard Taqman microRNA saggi su ABI7500 Real-Time PCR Detection System. Il metodo ΔΔCt per il parente quantizzazione è stata utilizzata per determinare l'espressione miRNA. Il Ct è il numero di cicli frazionata in cui la fluorescenza di ciascun campione supera la soglia fissa. Il ΔCt è stato calcolato sottraendo il Ct del snRNA U6 (RNU6B, P /N: 4.373.381, Applied Biosystems) dal Ct della miRNA di interesse. Il ΔΔCt stato calcolato sottraendo il ΔCt del campione di riferimento (accoppiato tessuto non maligno per campioni chirurgici, tessuti normali e GES-1 cellula per linee cellulari di cancro gastrico) dal ΔCt di ciascun campione. Piegare il cambiamento è stato determinato come 2 -ΔΔCt.

Migrazione e saggio di invasione

Le cellule sono state trasfettate con 20 nM pre-miR-375 o negativa controllo utilizzando Transfection Agent (Ambion, TX, USA) seguendo il protocollo di fabbricazione in piastre da 24 pozzetti. 24 ore dopo la trasfezione, test di migrazione Transwell e saggio di invasione Matrigel sono state effettuate separatamente utilizzando 24 pozzetti Transwell inserti con 8 dimensione dei pori micron (Corning Costar Corp). Per il saggio di migrazione Transwell, 2 × 10 4 AGS o 3 × 10 4 MGC-803 cellule sospese in 100 ml terreno di coltura corrispondente senza siero fetale bovino (FBS) sono stati caricati nella camera superiore del transwell inserto con non Rivestiti membrana. Per saggio di invasione Matrigel, 5 × 10 4 AGS o MGC-803 cellule sono state piastrate in 100 microlitri terreno privo di siero nella camera Matrigel rivestite superiore invece. In entrambi i saggi, la camera inferiore è stato contenente 600 microlitri di media con il 20% FBS. Le cellule sono state poi lasciati migrato o invaso per 12 ore a 37 ° C. Le cellule che migrati o invaso nella camera di fondo sono state fissate, macchiato con 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1000), visualizzati al microscopio a contrasto di fase e fotografato. Numero totale di cellule migrate o invaso è stato contato dal IPP software (Immagine-Pro Plus 6.0). Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti in modo indipendente almeno tre volte.

Scratch-guarigione delle ferite test

Le cellule sono state trasfettate come descritto in precedenza e ha permesso di crescere fino a confluenza. Le cellule sono state poi coltivate in terreno corrispondente senza FBS per 12 ore e poi graffiato con un puntale. aree ferite sono stati segnalati e fotografati a 0 h, 12 h, 24 he 36 h, rispettivamente. Il tasso di migrazione delle cellule è stata valutata sia da fotografare e quantificare la distanza migrato delle cellule spostato dal bordo della ferita verso il centro utilizzando il sistema IPP 6.0. Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte.

costrutti

Per produrre pGL3-375pro plasmide, la sequenza di DNA che contiene pri-miR-375 (primaria miR-375) promotore è stato amplificato mediante RT-PCR usando i primer 5'-ATCG CTCGAG ACA GAC CCT GCT AAG CGA CTC-3 'e 5'-ATCG AAGCTT ACG CCT TGG AGC TTG TCC-3' e poi clonati nel vettore pGL3-base (Promega). Per costruire il plasmide che esprime Lumaca nelle cellule, la griglia di lettura aperta (ORF) sequenza di lumaca è stato clonato in espressione di mammifero vettore pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA) utilizzando i primer 5'- ATCG AA GCT TCG ATG CCG CGC TCT TTC CTC G-3 'e 5'-ATCG GGA TCC TCA GCG GGG ACA TCC TGA GCA-3'. Per l'espressione ectopica di JAK2 FLAG-tagged, JAK2 umano con regione codificante è stato clonato in pCMV-Tag 2C vettoriale. Per costruire il plasmide che esprime miR-375 in cellule di mammifero, gli oligonucleotidi accoppiati in base alla sequenza primaria di è-miR-375 e le sue regioni fiancheggianti sono stati clonati in espressione di mammifero vettore pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA). Tutti i costrutti sono stati confermati mediante sequenziamento.

luciferasi test

Quarantamila cellule sono state seminate in piastre da 24 pozzetti 24 h prima della trasfezione. Le cellule sono state trasfettate sia con pGL3-375pro o vettore pGL3-base. Il vettore prl-TK (Promega, WI, USA) contenente Renilla
luciferasi è stato anche cotransfected come controllo di riferimento. Firefly e renilla
attività luciferasi sono stati misurati utilizzando Dual-reporter luciferasi Assay (Promega) 24 ore dopo la trasfezione. Firefly attività luciferasi è stata normalizzata per l'attività luciferasi Renilla.

Analisi statistiche

I dati sono rappresentati come media ± errore standard (SE) di tre esperimenti indipendenti. I rapporti tra l'espressione di miR-375 e l'espressione di mRNA lumaca sono stati esplorati da
coefficiente di correlazione di Pearson, che è stato descritto in precedenza [20]. Studente di t
-test e X
2 di prova sono state eseguite per determinare la significatività statistica. P
< 0.05 è stato considerato statisticamente significativo

Risultati

miR-375 è drammaticamente inibiti in cellule di cancro gastrico e tessuti di pazienti metastasi positivi
.

Per capire se miR-375 è associata con gastrica metastasi del cancro, in primo luogo abbiamo rilevato il livello di espressione di miR-375 in primarie tessuti di cancro gastrico da pazienti metastasi-positivi e libera da metastasi. Quando confrontato con campioni di pazienti senza metastasi, il livello di espressione di miR-375 era quasi due volte la riduzione nei tessuti di pazienti metastasi-positivi ( P
< 0,05) (Figura 1A). In sintonia con questo risultato, il livello di espressione di miR-375 in linee cellulari gastrico è associata negativamente con la capacità di cellule migrazione e invasione. Le proprietà metastatiche di linee cellulari epiteliali gastriche (GES-1, MGC-803, AGS) sono stati caratterizzati. Come mostrato nella Figura 1C e 1D, migrazione e invasione capacità di linea di cellule AGS erano maggiori di quella di MGC-803 e-1 GES linee cellulari ( P
< 0.01). Inversamente, miR-375 espressione in cellule AGS era inferiore a quella di MGC-803 e cellule GES-1 ( P
< 0.01) (Figura 1B). In una parola, miR-375 è downregulated nei tessuti di cancro gastrico da pazienti metastasi-positivi e in cellule di cancro gastrico con maggiori capacità di migrazione e l'invasione. Questa correlazione indica che miR-375 potrebbe avere un ruolo causale nella metastasi del cancro gastrico.

sovraespressione di miR-375 inibisce la migrazione gastrica cellule tumorali e l'invasione

Per esplorare il ruolo di miR-375 in gastrica metastasi del cancro, abbiamo esaminato l'effetto di miR-375 sovraespressione sulla migrazione e l'invasione di AGS e MGC-803 cellule di cancro gastrico con bassa espressione endougenous di miR-375. Le cellule sono state trasfettate sia con miR-375 precursore (miR-375) o oligonucleotidi controllo dei precursori-negativi (negativo) o nessuno di quanto sopra (Mock). Il test di migrazione Transwell dimostrato che la sovraespressione di miR-375 notevolmente inibita la migrazione di AGS (Figura 2A, 2B) e MGC-803 cellule (Figura S1A, S1B). In linea con questi risultati, il test scratch-guarigione delle ferite ha anche rivelato che le velocità di AGS (Figura 2C, 2D) e MGC-803 cellule (Figura S1C, S1D) di migrazione verso la zona della ferita sono stati significativamente ridotti dopo sovraespressione di miR-375 . Abbiamo impiegato più saggio di invasione Matrigel e abbiamo scoperto che la sovraespressione di miR-375 ha portato ad una riduzione di più di due volte nelle proprietà invasive di AGS (Figura 3a, 3b) e MGC-803 cellule (Figura 3C, 3D). Collettivamente, questi risultati indicano che la sovraespressione di miR-375 è sufficiente a inibire sia la migrazione e l'invasione capacità di cellule di cancro gastrico.

JAK2 miR-375-regolata è coinvolto nella regolazione della migrazione gastrica cellule tumorali e l'invasione

Il nostro precedente studio ha identificato JAK2 come bersaglio a valle del miR-375 [20]. Qui, siamo interessati a studiare se JAK2 è coinvolto nella regolazione della migrazione gastrica cellule tumorali e l'invasione. Abbiamo impiegato la tecnica RNAi basati su vettori per esaurire JAK2 endogena e abbiamo trovato che le attività di migrazione e l'invasione di AGS (figura 4) e MGC-803 cellule (figura S2) sono stati entrambi inibiti notevolmente. Allo stesso tempo, abbiamo studiato se JAK2 potrebbero contrastare l'effetto di inibizione della migrazione gastrica cellule tumorali e l'invasione causata da miR-375. Le cellule sono state co-trasfettate con miR-375 e precursore sia JAK2 sovraespressione vettore (miR-375 + JAK2) o controllare vettore vuoto (miR-375 + Vec). Sovraespressione di JAK2 chiaramente promosso cellule migrazione e l'invasione come mostrato nella figura 4 e S2. Così, in linea con la nostra ipotesi, miR-375 può inibire la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico parzialmente di mira JAK2. Abbiamo inoltre stabilito che JAK2 sovraespressione ha alcun effetto sul livello di espressione di miR-375, come mostrato nella Figura S3. Tuttavia, non possiamo escludere la possibilità che la disregolazione di miR-375 interferisce con altri obiettivi necessari per la migrazione gastrica cellule tumorali e l'invasione.

Lumaca downregulates miR-375 espressione

I risultati di cui sopra indicano che miR-375 può essere preso di mira da alcuni fattori di trascrizione che sono associati con l'invasione del cancro e il processo di metastasi. Naturalmente, ci concentriamo su come l'espressione di miR-375 è regolamentato. In primo luogo abbiamo scoperto una regione di DNA conversato a monte del pri-miR-375 gene, che è stato segnalato per contenere il promotore del gene pri-miR-375 [21]. Abbiamo quindi effettuato programma Consite (http://asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite) e abbiamo scoperto che ci sono stati sei siti di legame del fattore di trascrizione Lumaca nella regione del DNA (Figura 5A). La regione di DNA è stato clonato in pGL3-basic vettoriale (Promega) (pGL3-375pro) per misurare l'attività del promotore. In linea con i dati dal gruppo Walker [21] I risultati hanno dimostrato che questa regione di DNA contenente il gene promotore pri-miR-375 ed è in grado di dirigere l'espressione della luciferasi (Figura 5B). l'attività luciferasi è stata efficacemente repressa quando pGL3-375pro vettoriale è stato co-trasfettate con Lumaca vettore di espressione (Chiocciola), ma non quando co-trasfettate con il vettore di controllo vuoto (Mock) (Figura 5C). Inoltre, Lumaca sovraespressione potrebbe ridurre il livello di espressione di miR-375 del 46% (Figura 5D). Per determinare la rilevanza clinica di questi risultati, abbiamo correlato ulteriormente il livello di espressione di miR-375 con il livello lumaca mRNA negli stessi pazienti di cancro gastrico. Come mostrato in figura 5E, è stata trovata una correlazione inversa distinta tra il livello di espressione di miR-375 e Snail mRNA ( P
< 0,05, r = -0.6). Quindi, queste osservazioni dimostrano che Lumaca è un potenziale regolatore a monte del miR-375 espressione.

Lumaca è coinvolto nella regolazione della migrazione cellule di cancro gastrico di mira miR-375

Per chiarire ulteriormente la la correlazione di miR-375 e lumaca, abbiamo studiato se la lumaca è coinvolto nella regolazione della migrazione cellule di cancro gastrico di mira miR-375. Abbiamo impiegato la tecnica vector-based per upregulate livello di espressione Lumaca e abbiamo trovato che l'attività di migrazione delle cellule AGS (Figura 6) sono stati promossi notevolmente. Allo stesso tempo, abbiamo studiato se la lumaca potrebbe contrastare l'effetto di inibizione della migrazione gastrica cellule tumorali causate da miR-375. Le cellule sono state co-trasfettate con miR-375 sovraespressione vettoriale e Lumaca sovraespressione vettore (lumaca + miR-375). Sovraespressione di lumaca chiaramente promosso cellule migrazione e potrebbe parzialmente contrastare l'effetto di inibizione della migrazione gastrica cellule tumorali causata da miR-375 come mostrato nella figura 6. Pertanto, in linea con la nostra ipotesi, lumaca può inibire la migrazione di cellule di cancro gastrico parzialmente di mira miR-375.

Discussione

miRNA sono stati segnalati per regolare la migrazione del tumore, invasione e metastasi tra cui il cancro gastrico [6], [22]. Mir-375 è stato precedentemente dimostrato di giocare un ruolo importante nel gastrica cellule tumorali proliferazione [20], [23]. Tuttavia, i meccanismi regolatori rimangono poco chiari. Nel presente studio, abbiamo esplorato ulteriormente la funzione e potenziali meccanismi di miR-375 nella migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico. Abbiamo scoperto che la sovraespressione di miR-375 inibito la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico parzialmente di mira JAK2. E 'passato più di un decennio da quando JAK2 è stato clonato prima [24]. JAK2 è espresso in quasi tutti i tessuti e associato a molti patologico progredisce. Anche se è evidente che JAK2 agisce come un oncogene in entrambe le malattie mieloproliferative e di alcuni tumori solidi [25], [26], [27], senza coinvolgimento diretto di JAK2 nella migrazione cancro, è stato segnalato invasione o metastasi. La sorpresa, il nostro studio ha dimostrato che prima abbattendo JAK2 da RNAi inibito l'attività di migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico simile a quella della sovraespressione di miR-375. Inoltre, l'iperespressione di JAK2 potrebbe promuovere la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico. Così, abbiamo ipotizzato che JAK2 potrebbe contrastare l'effetto inibitorio sulla migrazione e l'invasione delle cellule causate da miR-375. Dato il ruolo fondamentale di miR-375 e JAK2 come regolatori di perfezionamento in gastrica cellule tumorali proliferazione, la migrazione e l'invasione, ciascuno di essi ha un potenziale terapeutico nel trattamento del cancro gastrico. Pertanto, resta da indagare se vi sia altri obiettivi partecipano miR-375 mediata metastasi gastrica.

Di particolare interesse, abbiamo ulteriormente studiato come miR-375 coinvolti nella carcinogenesi gastrica. Anche se vi è una evidente che la metilazione del DNA e istoni deacetylation sono i possibili meccanismi coinvolti nella sottoregolazione di miR-375 nel carcinoma gastrico [23]. I meccanismi alla base miR-375 disregolazione in gastrica metastasi del cancro sono ancora poco conosciuti. Vi è la possibilità per un blocco trascrizionale dell'espressione genica miR-375 in questo processo. Qui mostriamo che la metastasi associata fattore di trascrizione lumaca è un potenziale regolatore di monte di espressione di miR-375. Snail è una proteina zinc finger DNA-binding e 'stato segnalato come repressore trascrizionale [28]. evidenze dimostrano che Acumulating Lumaca si lega a E-box nel promotore di E-caderina e reprime la trascrizione di regolare lo sviluppo del tumore invasione [29]. Inoltre, è stato trovato sovraespressione di lumaca in tumori di essere associati con metastasi linfonodali, la ricaduta del tumore e la prognosi [30], [31], [32], [33], [34], [35]. In linea con altri rapporti, il nostro studio ha trovato che Lumaca mRNA è sovraespresso nei tessuti cancro gastrico rispetto ai loro tessuti non maligni adiacenti. Come l'attività del promotore di miR-375 potrebbe essere soppresso Lumaca e sovraespressione di lumaca potrebbe ridurre in modo significativo il livello di espressione di miR-375, abbiamo trovato più di una correlazione inversa distinta tra il livello di espressione di miR-375 e il livello di lumaca mRNA nel carcinoma gastrico campioni. Lumaca si trova anche ad essere coinvolto nella regolazione della migrazione cellule di cancro gastrico di mira miR-375.

In conclusione, abbiamo identificato che miR-375 è stato aberrante espresso nei tessuti di cancro gastrico da pazienti metastasi-positivi o cellule di cancro gastrico con una maggiore migrazione e le attività di invasione se confrontato con i tessuti di pazienti senza metastasi o non invasivo gastrica linea di cellule epiteliali GES-1 rispettivamente. Sovraespressione di miR-375 ha ridotto le attività cellule tumorali migrazione e l'invasione gastrici, almeno parzialmente, prendendo di mira JAK2. Inoltre, lumaca può essere un regolatore a monte del miR-375 che regola negativamente l'espressione di miR-375 ed è stato coinvolto nella regolazione della migrazione cellule di cancro gastrico di mira miR-375. Insieme, i nostri risultati forniscono un percorso non descritta, in cui un fattore di trascrizione Lumaca regola l'espressione di miR-375, che sopprime la sua JAK2 bersaglio diretto, portando ad inibire la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico. I nostri dati indicano che il ripristino di miR-375 o l'inibizione di lumaca o di JAK2 potrebbero essere strategie terapeutiche utili per il trattamento del cancro gastrico. Certamente sarà molto interessante per esplorare ulteriormente il potenziale efficacia di tali molecole di targeting miR-375, JAK2 o lumaca nel trattamento del cancro gastrico. Un altro argomento interessante per la ricerca futura sarà l'individuazione di altri possibili obiettivi di miR-375, e, più in particolare, il possibile coinvolgimento di JAK2 in metastasi del cancro gastrico.

Informazioni di supporto
Figura S1.
espressione ectopica di miR-375 sopprime la migrazione di MGC-803 cellule. MGC-803 cellule trasfettate con miR-375 precursore (miR-375), il controllo negativo (negativo) o nessuno di quanto sopra (Mock) sono stati sottoposti a test di Transwell migrazione (A) e ai graffi la guarigione delle ferite analisi (C). (A) Campi rappresentativi di cellule invasive sulla parte inferiore della membrana che sono stati risolti e macchiato con DAPI. (B) Numero totale di cellule migrate sul lato inferiore della membrana è stato contato dal software IPP 6.0. (C) La migrazione delle cellule alla zona ferita è stata fotografata al microscopio a 0 h, 12 h, 24 he 36 h post-ferimento. Le linee tratteggiate indicano le aree prive di cellule. (D) Il tasso di migrazione è stata esaminata misurando la distanza di cellule spostato dal bordo della ferita verso il centro in 36 ore dopo graffi. I dati sono presentati come media ± SE di almeno tre esperimenti indipendenti. Bar, 50 micron. * P
< 0.05, ** P
< 0,01
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s001
(TIF)
Figura S2 .
sovraespressione di JAK2 inverte miR-375 l'inibizione indotta di MGC-803 cellule migrazione e l'invasione. Le cellule trasfettate con i vettori o oligonucleotidi indicati sono stati sottoposti alla migrazione Transwell (A) o saggio di invasione Matrigel (C). Gli esperimenti di salvataggio per miR-375 sovraespressione sono stati eseguiti da espressione ectopica di JAK2 senza 3'-UTR nelle cellule miR-375-trattati. (A, C) sono stati mostrati i campi rappresentativi delle cellule sulla camera inferiore alla migrazione post 12 h o invasione. Barre di scala, 50 micron. (B, D) Il numero totale di cellule migrate o invasive da nove campi scelti a caso è stato contato da IPP 6.0. * P
< 0.05, ** P
< 0,01
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s002
(TIF)
Figura S3 .
JAK2 non ha effetto sulla espressione di miR-375. Le AGS e MGC-803 cellule sono state trasfettate con JAK2 sovraespressione vettore o il controllo vettoriale e sottoposti ad analisi RT-PCR per il livello di espressione di miR-375. Il livello di RNA U6 è stato utilizzato come controllo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s003
(TIF)

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