L'interleuchina-26 (IL-26) è una delle citochine secrete dalle cellule Th17 il cui ruolo nei tumori umani rimane sconosciuto. Qui, abbiamo studiato l'espressione e il ruolo potenziale di IL-26 nel carcinoma gastrico umano (GC). L'espressione di IL-26 e molecole correlate come IL-20R1, STAT1 e STAT3 è stata esaminata mediante real-time PCR e immunohistochemisty. Gli effetti di IL-26 sulla proliferazione cellulare e l'apoptosi indotta da cisplatino sono stati analizzati mediante saggio cooperazione BrdU e PI-annessina V co-colorazione rispettivamente. Lentivirali siRNA mediata è stato utilizzato per esplorare il suo meccanismo d'azione, e segnalazione IL-26 relativa è stata analizzata mediante western blotting. tessuti GC umani hanno mostrato un aumento dei livelli di IL-26 e delle sue molecole correlate e attivazione di STAT3 segnalazione, mentre attivazione STAT1 non differiva in modo significativo tra GC e tessuti gastrici normali. Inoltre, IL-26 è stato prodotto principalmente dalle cellule Th17 e NK. IL-26 ha promosso la proliferazione e la sopravvivenza di MKN45 e cellule di cancro gastrico SGC-7901 in modo dose-dipendente. Inoltre, IL-20R2 e IL-10R1, che sono due recettori essenziali per IL-26 di segnalazione, sono stati espressi in entrambe le linee cellulari. IL-26 attiva STAT1 e STAT3 segnalazione; tuttavia, l'upregulation dell'espressione di Bcl-2, Bcl-XL e c-myc indicato che l'effetto di IL-26 è mediata dall'attivazione STAT3. Knockdown di STAT1 e di espressione di STAT3 ha suggerito che gli effetti proliferativi e anti-apoptotici di IL-26 sono mediati dalla modulazione dell'attivazione /STAT3 STAT1. In sintesi, i livelli elevati di IL-26 in GC umano promuovere la proliferazione e la sopravvivenza modulando la segnalazione STAT1 /STAT3
Visto:. Si W, Tang Q, Zhang C, Wu J, Gu C, Wu Z, et al. (2013) IL-26 promuove la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule tumorali umane gastrico per regolare l'equilibrio di STAT1 e STAT3 attivazione. PLoS ONE 8 (5): e63588. doi: 10.1371 /journal.pone.0063588
Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Stati Uniti d'America
Ricevuto: 11 ottobre 2012; Accettato: 2 Aprile 2013; Pubblicato: 21 maggio 2013
Copyright: © 2013 È et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati
Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Foundation naturale (81170415 per XC) e Talenti Programma chiave Provinciale di Jiangsu (RC2011079 per QT e RC2007056 per XC). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto
Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione
Introduzione
cancro gastrico (GC) è la seconda causa più comune di morte per cancro nel mondo. GC è difficile da curare, anche nei paesi occidentali perché è spesso non rilevato fino agli stadi avanzati della malattia [1]. Sebbene un certo numero di fattori sono associati con lo sviluppo e la progressione di GC, un legame tra infiammazione gastrica cronica come gastrite atrofica indotta da Helicobacter pylori ed il rischio di GC è diventato evidente negli ultimi anni [2]. L'infiammazione cronica che porta a GC è un processo lungo e complicato che si verifica nel corso di molti anni ed è caratterizzata da un danno infiammatorio alla mucosa gastrica, citochine indotta sintesi del DNA e la proliferazione delle cellule, iperplasia e cancerogenesi [3].
Il associazione tra infiammazione cronica e il sistema immunitario è stato ben studiato, e linfociti sono i principali mediatori della cancerogenesi infiammazione-promosso [4]. cellule Th17 sono un nuovo tipo di linfociti T che esprimono RORγT e secernono diverse citochine tra cui IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22 e IL-26. La differenziazione delle cellule Th17 è regolata da diverse citochine tra cui IL-1β, IL-6, IL-23, fattore di necrosi tumorale (TNF-α), e fattore di crescita trasformante beta (TGF-β) [5], [6] . Recenti studi clinici hanno dimostrato che le cellule Th17 possono essere strettamente correlate a H. pylori patologia associata e carcinogenesi di GC [7], [8], [9], [10]. Sebbene diverse citochine Th17 correlati sono stati studiati, poco si sa interleuchina-26 (IL-26) in relazione ai tumori gastrici.
IL-26 è una proteina secreta che funziona sia come un monomero o un omodimero. È stato originariamente descritto da Knappe et al. [11] con il nome di AK155. IL-26 è debole ma significativa omologia di sequenza di IL-10, e la sua proteina codificata è quindi un membro della famiglia IL-10 di citochine, che appartengono principalmente alla citochina famiglia di classe-2. IL-26 può essere secreto dalle cellule T primarie, cellule NK e cloni di cellule T e di solito è co-espresso con altri importanti citochine IL-10-correlati, quali IL-22 [12], [13]. IL-26 si lega ad un distinto complesso recettore sulla superficie cellulare costituito da catene IL-20R1 e IL-10R2, e le sue attività funzionali sono diverse da quelle mediate da IL-10. funzioni IL-20R1 come la specifica catena di ligando vincolante per IL-26 e IL-10R2 è una seconda catena essenziale per completare il montaggio del complesso recettoriale attiva. Anticorpi neutralizzanti contro sia la catena IL-10R2 IL-20R1 o può bloccare l'induzione di IL-26 di segnalazione [12]. Una volta assemblato, il complesso recettoriale subisce un cambiamento conformazionale (s) che induce l'attivazione dei recettori associati Janus chinasi tirosina, JAK1 e Tyk2, e successivo aggancio transitorio e fosforilazione delle proteine STAT, STAT1 e STAT3 [14], [15 ].
Come una citochina Th17 correlata, il ruolo di iL-26 nei tumori non è stata studiata. Qui, abbiamo esaminato il potenziale coinvolgimento di IL-26 in GC umana per la prima volta e esplorato il suo pro-sopravvivenza e gli effetti proliferativi in vitro I pazienti il presente studio ha incluso 60 pazienti con GC sottoposti a chirurgia 2006-2009 presso il primo Ospedale Affiliato di Nanjing Medical University, Nanjing, provincia di Jiangsu (Tabella 1). Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki. consensi informato scritto per l'espressione genica analisi in tessuti sono stati ottenuti da tutti i pazienti prima di un intervento chirurgico o di esame endoscopico. Le procedure di protocollo e di consenso di studio sono stati approvati dal comitato etico del Primo Ospedale Affiliato di Nanjing Medical University. La diagnosi e la stadiazione del cancro gastrico è stata eseguita secondo la AJCC (TNM) Staging System. reazioni trascrizione inversa sono state eseguite utilizzando il First-Strand Synthesis sistema SuperScript ( Invitrogen, CA) dopo il trattamento di modelli di RNA con DNasi I per evitare l'inquinamento DNA genomico. Per determinare il livello relativo di cDNA nei campioni trascrizione inversa, real-time PCR è stata eseguita con la Roche LightCycler480 (Roche Diagnostics, USA) utilizzando primer per IL-26 come segue: in avanti, AAGCAACGATTCCAGAAGACC e indietro, AAGTCCTCCACAAAGCGTATTTT, con un amplificato lunghezza di 175 bp. GAPDH è stato utilizzato come controllo con i seguenti primers: forward, AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC; invertire, GGGGTCATTGATGGCAACAATA; lunghezza amplificata, 102 bp. La reazione di real-time PCR è stata eseguita secondo le istruzioni fornite nel kit SYBR® Premix Ex Taq ™ (Takara, Giappone). I dati sono stati normalizzati ai livelli GAPDH nei campioni. concentrazione di IL-26 nel siero dei pazienti CG e controlli sani è stata misurata utilizzando kit ELISA sandwich disponibili in commercio (Biotang Inc., MA). Western Blot analisi Le proteine sono stati estratti da MKN45, SGC7901 e la loro STAT1 e STAT3 siRNA modificato linee cellulari, e quantificato usando un test di proteine (Bio-Rad Laboratories, CA). campioni proteici (30 ug) sono stati frazionati mediante SDS-PAGE e trasferite su una membrana di nitrocellulosa. Immunoblotting è stata effettuata utilizzando anticorpi contro IL-26, IL-20R1, IL-10R2, p-STAT3 (S727), STAT3, p-STAT1 (Y701), STAT1, Bcl-2, Bcl-XL, c-Myc e α- tubulina (tutti acquistati da Abcam, MN). I risultati sono stati visualizzati con un sistema di rilevamento chemiluminescente (ECL Pierce substrato occidentale sistema di rilevamento Blot, Thermo Scientific, IL) e l'esposizione a pellicola autoradiografia (pellicola Kodak XAR). I tessuti sono stati raccolti e fissati in paraformaldeide al 4% per una notte a 4 ° C, elaborati e tagliate a 5 micron sezioni spesse. La colorazione immunoistochimica di sezioni è stata eseguita con anticorpi contro IL-26, IL-20R1, tecniche di p-STAT3 (S727), e p-STAT1 (Y701) utilizzando descritto in precedenza [16]. BrdU Cell Proliferation Assay cellule coltivate sono state piastrate ad una densità di 1 × piastre 10 4 cellule /pozzetto in 96 pozzetti. La proliferazione cellulare a 0, 12, 24, 48, 60 e 72 h è stata valutata utilizzando la cella BrdU kit di saggio di proliferazione. soluzione BrdU (Cell Signaling Technology MA) è stato aggiunto ad ogni pozzetto secondo le istruzioni del produttore per 12 ore. Il tasso di proliferazione delle cellule è stata determinata misurando l'assorbanza a 450 nm usando un computer controllato micropiastre-reader. tessuti tumorali freschi sono stati lavati due volte in RPMI 1640 . Fatty, connettivo e tessuto necrotico è stato rimosso. I tessuti sono stati sminuzzati in pezzi di 1-2 mm in RPMI 1640, trasferito in 15 o 50 provette coniche ml e incubate con mezzo digestione enzimatica contenente tripla DNasi (30 U /mL), ialuronidasi (0,1 mg /mL), e collagenasi (1 mg /ml) per 2 ore a temperatura ambiente agitando delicatamente. I tessuti sono stati risospesi in 10 ml di RPMI 1640 e filtrato attraverso un colino cella di 70 micron (BD Pharmigen). Le cellule intrappolati dal filtro sono stati collocati in pozzetti individuali contenenti 1 ml di terreno di coltura delle cellule T in un 24-pozzetti per l'ulteriore rilevamento mediante citometria di flusso. Th17 sono stati ottenuti da in vitro Per intracellulare colorazione citochine, le cellule sono state stimolate a 37 ° C per 5 h con un cocktail di attivazione dei leucociti (BD Pharmingen). Le cellule sono state poi colorate con marcatori di superficie, fissi, e permeabilizzate con IntraPre Reagent (Beckman Coulter), ed infine colorate con marcatori intracellulari. I dati sono stati acquisiti su un FACSVantage SE e analizzati con il software CellQuest. anticorpi monoclonali coniugati a fluorocromi contro IL-26, CD3, CD4, CD8, CD16, CD56 e RORγT sono stati acquistati da BD Pharmingen. Cisplatino apoptosi indotta e citometria a flusso Analisi Le cellule sono state coltivate analizzate in terreno completo con 1 mg /mL cisplatino per 24 h. Le cellule sono state ulteriormente analizzate mediante citometria di flusso (FACSCalibur ™, BD Biosciences, NJ). Utilizzando un kit PI /annessina colorazione (BD Biosciences) siRNA di progettazione e lentivirus Produzione e trasduzione L'siRNA mira STAT1 e STAT3 sono stati progettati e sintetizzati da GenScript Co. (Nanjing, Cina) come segue: siRNA mira STAT1, GGACAAGGTTATGTGTATA; e siRNA mira STAT3, GGACATCAGCGGTAAGACC. I siRNA sintetizzati sono stati subclonati nel vettore lentivirale pLL3.7 da Hapi Analisi statistica I risultati sono espressi come media ± SD di a tre esperimenti indipendenti. I confronti tra i gruppi sono stati eseguiti con il test di Mann-Whitney U. La correlazione di espressione di IL-26 e di varie caratteristiche cliniche è stato analizzato utilizzando il test del Chi-quadro. valori di P < 0,05 sono stati considerati come statisticamente significativi Risultati 1.. Una maggiore attivazione di IL-26 e relativi STAT3 Signaling in gastriche umane cancro IL-26 espressione nel carcinoma gastrico umano è stata esaminata in 60 tessuti tumorali freschi e tessuti dello stomaco normali adiacenti accoppiati da 60 pazienti GC. Real-time PCR ha mostrato una significativa sovra-espressione di IL-26 mRNA in GC umana rispetto ai normali tessuti gastrici (p = 0,004, da Mann-Whitney test U) (Figura 1A). Sierici di IL-26 livelli erano significativamente più elevati nei pazienti GC rispetto ai controlli sani (p = 0,0064, da Mann-Whitney test U) (Figura 1B). Inoltre, l'analisi dell'espressione della proteina IL-26 in 60 campioni di tessuto inclusi in paraffina mostrato espressione positiva in 47 campioni GC, e debolmente positivo (n = 14) o negativo (n = 46) espressione in tessuti normali adiacenti. Le cellule positive IL-26 erano situate principalmente nei tessuti non parenchimali, che possono consistere in cellule immunitarie circostanti e infiltranti in cancro o tessuti normali gastriche. Inoltre, la quantificazione dei risultati IHC di colorazione con più di Image-Pro (versione 5.0) in cinque campi aleatori per vetrino ha dimostrato che l'IL-26 espressione era significativamente più alta nei tessuti GC che nei tessuti normali adiacenti (P = 0,0087, da Mann-Whitney U test). Rilevazione e quantificazione dell'espressione di IL-20R1, un recettore di IL-26, hanno mostrato che si è espressa a livelli significativamente più elevati GC umana che nei tessuti normali (P = 0,0041, con il test di Mann-Whitney U). Lo stato di attivazione di STAT1 e STAT3, che sono importanti fattori di segnalazione a valle di IL-26, è stato indagato dalla IHC con anticorpi specifici contro i residui fosforilati. Un aumento significativo di p-STAT3 (S727) è stato rilevato nei tessuti GC, mentre sono stati rilevati livelli di differenze statisticamente significative nella p-STAT1 (Y701) tra i tessuti umani GC e tessuti normali (P = 0,0094 per STAT3 e P = 0,392 per STAT1 , da Mann-Whitney U test) (Figura 1C, D). Analisi della correlazione tra iL-26 espressione e caratteristiche clinicopatologiche mostrato associazioni statisticamente significative tra iL-26 espressione e dimensioni del tumore e H . pylori 2. Th17 e cellule NK sono i cellulari principali fonti di IL-26 in gastriche umane Cancer Le fonti cellulari di IL-26 sono le cellule T primarie, le cellule natural killer (NK) e cloni di cellule T dopo stimolazione con antigeni specifici o lectine mitogene [14]. Pertanto, per definire la fonte di IL-26 in GC umana, tumore leucociti infiltranti (TIL) sono stati isolati da 20 campioni di tessuto GC umani freschi e co-colorati con diversi marcatori. IL-26 espressione era significativamente più alta nelle cellule positive CD3 (cellule T) da TIL GC umani che in cellule T derivate da cellule del sangue periferico mono-nucleare (PBMC) (16,52 ± 9,32% per T-TIL vs 3.78 ± 2.91% per T-PBMC, P < 0,0001) che era coerente con i risultati di real-time PCR e IHC (figura 2a1, a2). Tra il numero totale di cellule T, 13,5 ± 3,71% di cellule T CD4 positive espresso IL-26 mentre solo 3,21 ± 2,61% delle cellule T CD8 erano positivi per IL-26 (Figura 2a3, a4). Inoltre, co-colorazione di IL-26 con CD4 e RORγt, un marker per le cellule Th17, è stato osservato, con 53,21 ± 16,82% di cellule Th17 esprimono IL-26 in campioni di cancro gastrico umano (Figura 2A5, A6). L'espressione di IL-26 in cellule NK, un'altra fonte cellulare frequentemente riportata di IL-26, è stata analizzata misurando il numero di CD3-, CD16 +, CD56 + cellule co-colorazione con IL-26, che ha dimostrato che 43.81 ± 19.44% di cellule totali NK secernono IL-26 (Figura 2A7, A8). Nel loro insieme, i nostri risultati hanno indicato che le principali fonti cellulari di IL-26 in GC umana erano cellule Th17 e NK e la percentuale di ciascun componente sono stati riassunti in un grafico a torta (Figura 2A9 e A10). Per approfondire la secrezione di iL-26 in cellule Th17 e NK, PBMC sono stati raccolti da 20 volontari sani e stimolate in Th17 condizioni polarizzanti. L'altra fonte principale di IL-26, cellule NK, è stato ottenuto da PBMC utilizzando un kit di isolamento NK umane commerciale. Le caratteristiche di cellule Th17 e NK indotte o isolate sono stati verificati da intracellulare colorazione delle citochine e ulteriormente analizzati mediante citometria di flusso (Figura 2b1, b2). La stimolazione di cellule Th17 e NK con LPS e H. pylori 3. In vitro L'effetto di IL-26 è stato ulteriormente approfondito con una serie di in vitro Studi precedenti hanno dimostrato che il legame di IL-26 per il suo complesso recettore può indurre una rapida attivazione di STAT3 e, in misura minore, STAT1 [ ,,,0],12]. Pertanto, abbiamo prima determinato l'espressione del recettore di IL-26 (IL-20R1 e IL-10R2) in MKN45 e SGC7901 cellule e verificato che entrambi i recettori sono presenti in linee cellulari GC confermare che trasduzione di IL-26 segnali era possibile (Figura 4A). Abbiamo poi esaminato l'attivazione di STAT1 e STAT3 segnalazione e ha mostrato che la fosforilazione del residuo S727 di STAT3 e Y701 di STAT1 è aumentata in risposta a 10 ng /mL di IL-26. IFN-γ (10 ng /ml) e IL-6 (30 ng /mL) sono stati usati come controlli di attivazione per STAT1 e STAT3 rispettivamente (Figura 4B). Sulla base di studi precedenti che mostrano che STAT1 e STAT3 vie di segnalazione hanno effetti opposti sulla tumorigenesi [18], abbiamo studiato bersagli a valle di STAT1 e STAT3 per chiarire ulteriormente i meccanismi alla base delle proliferativi e pro-sopravvivenza effetti di IL-26 mediate da STAT1 e STAT3 segnalazione in linee cellulari GC. I nostri risultati hanno dimostrato che IL-26 stimolazione upregulated l'espressione di Bcl-2, Bcl-XL e c-myc, suggerendo che IL-26 ha un forte effetto sull'attivazione STAT3 che su STAT1 segnalazione direttamente o indirettamente (Figura 4B). Questo risultato contribuisce anche alla nostra comprensione del pro-sopravvivenza e effetto proliferativo di IL-26 in linee cellulari umane GC. L'effetto di IL-26 sull'equilibrio tra STAT1 e l'attivazione di STAT3 è stata studiata usando lentivirus mediata siRNA silenziamento di STAT1 e STAT3 in MKN45 e cellule SGC-7901. Il corrispondente siRNA efficacemente down-regolato l'espressione di STAT1 e STAT3 in entrambe le linee cellulari (Figura 5A). La proliferazione cellulare è stata valutata mediante test cooperazione BrdU in cellule trasfettate controllo siRNA e linee cellulari GC trattati STAT1 e STAT3 siRNA cresciuto in supporti contenenti 10 ng /ml di IL-26. Knockdown di espressione di STAT3 significativamente inibito la crescita delle cellule e MKN45 SGC-7901, mentre STAT1 atterramento non ha avuto effetto sulla proliferazione delle cellule (Figura 5B1, B2). Cisplatino apoptosi indotta è stata valutata mediante PI-Annessina V co-colorazione nelle stesse cellule mantenute in media con 10 ng /mL di IL-26, ed i risultati hanno mostrato una significativa diminuzione dell'effetto pro-sopravvivenza di IL-26 in cellule STAT3 knockdown , mentre non sono state riscontrate variazioni statisticamente significative nel tasso di apoptosi in risposta a STAT1 silenziamento (Figura 5C1, C2). Questi risultati indicano che l'IL-26 ha pro-sopravvivenza e gli effetti proliferativi su linee cellulari GC umana mediata, almeno in parte dalla segnalazione STAT1 /STAT3. Gli studi precedenti hanno dimostrato che l'IL-26 è co-espresso con un altro importante citochina IL-10-correlate, IL-22, che è secreta anche dalle cellule Th17 [19], [20]. Tuttavia, l'espressione e il ruolo di IL-26 nel cancro umano non sono state studiate in dettaglio. Qui, abbiamo esaminato per la prima volta l'espressione di IL-26 nei tessuti umani, GC e ha dimostrato che l'IL-26 e molecole correlate come IL-20R1 sono sovraespressi in tessuti umani GC. IL-26 è co -expressed con IFN-γ e IL-22 nei cloni Th1 umani, ma non in cloni Th2. Inoltre, IL-26 è co-espresso con IL-17 e IL-22 da parte delle cellule Th17, un sottoinsieme importante di cellule T-helper CD4 + che è distinta da Th1 e Th2 cellule [12], [21]. Nel presente studio, IL-26 è risultato essere prodotto principalmente dalle cellule T helper CD4 positive in GC umana, tra i quali quasi la metà delle cellule Th17 secreto IL-26. Abbiamo esaminato un'altra possibile fonte cellulare, le cellule NK, che sono riportati essere correlato al volume del tumore e la diffusione in GC umana [22], [23] e ha mostrato che le cellule NK sono stati anche importanti fonti di IL-26 di produzione. I nostri risultati sono supportati da un recente studio in cui è stato trovato per un romanzo sottogruppo di cellule CD56 + NKp44 + NK co-esprime IL-22 e IL-26, in particolare in risposta al trattamento con IL-23 [24]. Hughes et al iL-26 è stata segnalata per segnalare tramite un complesso recettoriale heterodimeric composto di catene iL-20R1 e iL-10R2. funzioni IL-20R1 come la specifica catena di ligando vincolante per IL-26 e IL-10R2 funzioni come una seconda catena essenziale per completare l'assemblaggio del complesso recettoriale attiva. Anticorpi neutralizzanti contro sia la catena IL-20R1 o IL-10R2 sono in grado di bloccare IL-26 di segnalazione. Una volta assemblato, il complesso recettoriale subisce un cambiamento conformazionale (s) che induce l'attivazione dei recettori associati Janus chinasi tirosina, JAK1 e Tyk2, e il successivo aggancio transitorio e fosforilazione delle proteine STAT, STAT1 e STAT3 [26], [27]. Come uno dei fattori di segnalazione a valle di IL-26, STAT3 è più spesso associato con tumorigenesi ed è anche considerato come un oncogene. STAT3, che è considerato un punto di convergenza per numerose vie di segnalazione oncogeni, è costitutivamente attivata sia nelle cellule tumorali e cellule immunitarie nel microambiente tumorale [28], [29], [30]. In particolare, l'attivazione di STAT3 è stata riportata in circa il 70% dei tumori solidi ed ematologici, compreso il mieloma multiplo, diversi linfomi e la leucemia, il cancro al seno, testa e del collo, cancro alla prostata, carcinoma ovarico, il melanoma, il carcinoma renale, carcinoma del colon-retto e del timo tumori epiteliali [31]. STAT3 è noto per promuovere la proliferazione cellulare e l'angiogenesi e svolgere un ruolo nel tumore immuno-fuga, ma compromette anche l'invasività e potenziale metastatico dei tumori. I nostri risultati hanno dimostrato che STAT3 è attivato nei tessuti umani GC e la sua attivazione può essere associato con eccessiva IL-26 secrezione. D'altra parte, differenze significative sono state rilevate in altro obiettivo valle di IL-26, STAT1, tra tumore e tessuti normali adiacenti. STAT1 e STAT3 sono pensati per svolgere ruoli opposti nella tumorigenesi [18]. STAT1 ha una complessa serie di funzioni in entrambe le cellule tumorali e il sistema immunitario e di solito è considerato come un soppressore del tumore a causa del suo ruolo nella promozione della crescita e l'apoptosi [32]. In sintesi, abbiamo dimostrato che l'IL -26 promuove la crescita cellulare e previene l'apoptosi delle cellule di cancro gastrico umano modulando l'equilibrio di segnalazione STAT1 /STAT3, indicando che l'iL-26 può essere un indicatore prognostico prezioso e target terapeutico in pazienti affetti da cancro gastrico.
.
Materiali e Metodi
quantitativa Real-time PCR
ELISA
immunoistochimica (IHC)
Isolamento e la coltura di GC umana infiltrata Leucociti
Th17 e NK isolamento delle cellule, la stimolazione, e analisi citometria a flusso cellule
stimolazione delle cellule CD4 positive mononucleate del sangue periferico (PBMC), che sono stati isolati mediante citometria di flusso nelle condizioni (20 ng /ml di iL-1β, 20 ng /mL di IL-6, 20 ng /mL di IL-23, 5 ng /mL TGF-β, 5 mg /mL anti-IL-12, e 5 ug /mL anti-IL-4) precedentemente descritto [17]. Le cellule NK sono stati ottenuti utilizzando un kit di isolamento delle cellule NK acquistato da Miltenyi Biotec (Cat. 130-092-657). Th17 e le cellule NK sono state mantenute in vitro
e stimolato da 100 ng /ml LPS e H. pylori
lisati, rispettivamente, e analizzati mediante intracellulare colorazione citochine
.
e XhoI
(New England Biolab, United Kingdom) insieme a controllo siRNA e denominati pLL3.7-CS, pLL3. 7-STAT1-siRNA e pLL3.7-STAT3-SiRNA. lentivirus ricombinante è stata generata da 293T cellule [16]. Le linee cellulari GC umana MKN45 e SGC7901 sono stati acquistati da Kaiji Biotech Co (Nanjing, Cina) e coltivate in modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero fetale di vitello, 100 U /ml di penicillina e 100 U /mL di streptomicina (Gibco , CA), e trasdotte con lentivirus usando polibrene (8 mg /ml).
infezione (Tabella 1).
lisati ha determinato un significativo aumento della secrezione di IL-26, che indica che l'IL-26 è una risposta citochina fondamentale nel cancro gastrico (Figura 2C).
proliferativa e anti-apoptotica effetti di IL-26
studi eseguiti in due umana linee cellulari GC, MKN45 e SGC-7901. L'effetto di IL-26 sulla proliferazione cellulare è stata valutata con il test incooperation BrdU in cellule trattate con differenti concentrazioni di IL-26 (1, 10 e 50 ng /mL). Non sono state rilevate differenze significative nella proliferazione cellulare tra cellule non trattate e di quelli trattati con 1 ng /mL di IL-26. Tuttavia, il tasso di proliferazione cellulare è aumentata significativamente in risposta a 10 e 50 ng /mL IL-26 rispetto a quella in cellule non trattate (Figura 3A). Inoltre, la valutazione dell'effetto anti-apoptotica di IL-26 da PI-AnnexinV co-colorazione nelle cellule trattate con il cisplatino farmaco chemioterapico per vari punti temporali hanno dimostrato che IL-26 ha un significativo effetto anti-apoptotico anche ad una dose di 1 ng /mL. L'effetto anti-apoptotico aumentato con concentrazioni crescenti di IL-26 a 10 e 50 ng /mL (Figura 3B1, B2). Questi risultati indicano che l'IL-26 ha effetti proliferativi e anti-apoptotici su linee cellulari umane GC, il che spiega in parte l'associazione tra l'espressione di IL-26 e caratteristiche cliniche diverse osservate negli studi clinici. Tuttavia, il meccanismo molecolare alla base deve essere analizzato ulteriormente.
4. Gli effetti proliferativi ed anti-apoptotici di IL-26 sono associati con STAT3 attivazione
5. Il tumore Promuovere effetto di IL-26 dipende dalla STAT1 /STAT3 Balance
Discussione
. descritto un diverso sottoinsieme di cellule NK immature che non esprimono CD56 o NKp44 ma esprimono CD117 e CD161 e costitutivamente espresso IL-22 e IL-26 [25]. Inoltre, i nostri risultati hanno mostrato per la prima volta che l'IL-26 promuove la proliferazione di cellule umane GC modificando l'equilibrio di STAT1 e STAT3 attivazione, fornendo così nuove prove del rapporto tra cellule NK e volume del tumore in GC umana.