PLoS: Het remmende effect van Pseudolaric Acid B op maagkanker en multidrug resistance via Cox-2 /PKC-α /P-gp Pathway

De abstracte

Doel

Om het remmende effect van pseudolaric zuur B op subcutane xenotransplantaten van menselijke adenocarcinoom van de maag en de onderliggende moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de multidrug resistentie te onderzoeken.

methoden

Human maagdarmkanker SGC7901 cellen en resistente SGC7901 /ADR-cellen werden geïnjecteerd in naakt muizen een subcutane xenograft model vast te stellen. De effecten van zuur pseudolaric B met of zonder adriamycine behandeling werden vergeleken door bepaling van de tumorgrootte en gewicht. Cyclo-oxygenase-2, eiwit kinaseC-α en P-glycoproteïne expressie niveaus werden bepaald door immunohistochemie en western blot.

Resultaten

Pseudolaric acid B aanzienlijk onderdrukt de groei van de tumor veroorzaakt door SGC7901 cellen en SGC7901 /ADR-cellen. De combinatie van zuur pseudolaric B en de traditionele chemotherapie geneesmiddel adriamycine vertoonden krachtiger remmende effecten op de groei van maagkanker in vivo dan behandeling met zuur pseudolaric B of adriamycine alleen. Eiwitexpressie niveaus van cyclo-oxygenase-2, eiwit kinaseC-α en P-glycoproteïne geremd door alleen of in combinatie met adriamycine in SGC7901 /ADR cel xenotransplantaten pseudolaric B zuur.

Conclusie

Pseudolaric acid B een significant remmend effect en een additief remmend effect in combinatie met adriamycine op de groei van maagkanker in vivo, waarbij de multidrug resistentie van maag neoplasma chemotherapie drugs keert neerwaarts reguleren van de Cox-2 /PKC-α /P- gp /MDR1 signaleringsroute

Visum:. Zon Q, Li Y (2014) het remmende effect van Pseudolaric Acid B op maagkanker en multidrug resistance via Cox-2 /PKC-α /P-gp pathway. PLoS ONE 9 (9): e107830. doi: 10.1371 /journal.pone.0107830

Editor: Soumitro Pal, Children's Hospital Boston & Harvard Medical School, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 15 mei 2014; Aanvaard: 20 augustus 2014; Gepubliceerd: 24 september 2014

Copyright: © 2014 Zon, Li. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. De auteurs bevestigen dat alle gegevens waarop de bevindingen zijn volledig beschikbaar zonder beperking. Alle relevante gegevens zijn binnen het papier

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door Science Program Foundation van Shenyang gemeentelijke Science and Technology Bureau (1091136-9-02). De financier had geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

maagkanker is wereldwijd een van de meest voorkomende vormen van kanker [1], en chemotherapie is een belangrijke strategie tegen maagkanker [2]. Omdat meerdere chemotherapeutische geneesmiddelen van verschillende klassen worden gebruikt ter behandeling maagkanker, de gevoeligheid van antikankergeneesmiddelen maagkanker geleidelijk afneemt, en resistentie tegen verschillende geneesmiddelen met verschillende chemische structuren en verschillende werkingsmechanismen optreden. Dit type van resistentie wordt multidrug resistentie (MDR) en vermindert aanzienlijk de efficiëntie van de behandeling op maagkanker. MDR is een groot probleem voor een succesvolle behandeling van kanker [3]. Er is ontdekt dat de belangrijkste reden voor MDR in kanker is de overexpressie van P-glycoproteïne (P-gp), een product van het humane MDR1 gen. P-gp een ATP-afhankelijke efflux pomp geneesmiddelaccumulatie kan afnemen in kankercellen. Er wordt voorgesteld dat P-gp, een goed geaccepteerd biomarker van MDR, ook als doelwit moet worden beschouwd in multiresistente kanker [4]. Recente studies hebben aangetoond dat kankercellen met MDR, de expressieniveaus van cyclo-oxygenase-2 (COX-2) en een isovorm eiwit kinaseC (PKC-α) beide opgereguleerd en hun remming kan omkeren neoplastische MDR [5] - [10].

Pseudolaric acid B (PAB, figuur 1), een diterpeen zuur geïsoleerd van de wortel en de stam schors van de boom Pseudolarix kaempferi
Gordon (Pinaceae), wordt gebruikt in traditionele Chinese geneeskunde om zijn brede spectrum aan biologische functies, zoals anti-schimmel werking en anti-vruchtbaarheidseffecten. Bovendien zijn anti-angiogene effecten zijn ook geleidelijk opgenomen in de afgelopen jaren [11], [12]. Recente studies hebben aangetoond dat PAB groeiremming induceert, celcyclus en apoptose. Bovendien PAB keert de multidrug resistentie van kankercellen [13], [14]. PAB onderdrukt de groei van de maag neoplastische AGS cellijn en induceert de apoptose [15]. Ons eerder onderzoek aangetoond dat PAB heeft ook een dramatisch remmend effect op menselijke maagkanker SGC7901 cellen in vitro [16]. In vitro studies van het antikanker effect van PAB zijn zeldzaam, en noch de in vivo werkzaamheid van dit nieuwe kruidenmengsel tegen tumoren noch de precieze moleculaire mechanisme tegen MDR is uitgebreid onderzocht.

Het doel van de onderhavige studie is het anti-neoplastisch effect van PAB in vivo geëvalueerd, met inbegrip van de omkering van MDR, met een xenograft model in naakt muizen en onderzoeken of moleculaire mechanisme PAB is gerelateerd aan de remming van MDR via de Cox-2 /PKC-α /P-gp-route.

Materialen en methoden

Materials

RPMI-1640 kweekmedium en foetaal runderserum (FBS) voor celkweek werden gekocht van Gibco BRL, Gaithersburg , MD, USA. Konijnen anti-COX-2 monoklonaal antilichaam, muis anti-PKC-α en muis anti-P-gp monoklonale antilichamen werden verkregen van Santa Cruz Corporation, CA, USA. Secundaire antilichamen tegen het konijn en muis-antilichamen, streptavidine-peroxidase (SP) kits, en 3,3'-diaminobenzidine (DAB) werden verkregen van Beijing Zhongshan Biotechnology, China. BCA eiwit assay kits en SDS-PAGE gel voorbereiding kits werden verkregen uit de Beyotime Instituut voor Biotechnologie, Shanghai, China. PAB werd gekocht van de Liaoning Institute for Drug Control, China No. 201.003 (de zuiverheid: > 98%). Adriamycine (ADR) werd verkregen van Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., China No. 120906. Tween80 en polyethyleenglycol werden gekocht van Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA.

Cell cultuur

Human adenocarcinoom SGC7901 cellen werden gekweekt in het centrale laboratorium van Shengjing Hospital Affiliated naar China Medical University [16], en adriamycine-resistente SGC7901 /ADR-cellen werden begaafd van Institute of maag Lever Darm in Xijing Ziekenhuis verbonden aan Vierde Militaire Medische Universiteit [17]. Menselijke maagdarmkanker SGC7901 cellen en adriamycine-resistente SGC7901 /ADR-cellen werden gekweekt in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS en antibiotica (100 U /ml penicilline en streptomycine) met 5% CO _{2 in een bevochtigde incubator bij 37 ° C. ADR (1 ug /ml) werd toegevoegd aan de SGC7901 /ADR celkweekmedium voor het behoud van hun MDR. Cellen in de logaritmische groeifase werden gecentrifugeerd en verdund met RPMI-1640 medium tot eencellige suspensies te bereiden met een concentratie van 2,5 x 10 ^{6 /ml te zaaien.}}

Vaststelling van een naakt muis xenograft model

De in vivo anti-tumor effect van PAB werd in een muizen xenograft model onderzocht. Voor het model, 4-6 weken oude immunodeficiënte mannelijke en vrouwelijke BALB /c (nu /nu) muizen met een gewicht van 18 tot 22 gram werden verkregen van Beijing HFK Bioscience Co., Ltd. (China) en bewaard in erkende voorzieningen onder standaard voorwaarden voor knaagdieren (SPF graad) bij de afdeling Proefdierkunde. Vijftig muizen werden geselecteerd en willekeurig ingedeeld in twee groepen (25 per groep). Een totaal van 25 muizen werden subcutaan geïnjecteerd met 2,5 x 10 ^{6 /ml SGC7901 cellen in 0,2 ml RPMI-1640 medium in de linker axillaire, en de andere 25 muizen werden geïnjecteerd met SGC7901 /ADR-cellen in de rechter axillaire regio onder kiem-vrije omstandigheden.}

experimentele groepen en medicatie

Zeven dagen na implantatie cel, de tumoren werd voelbaar (ongeveer 3 mm x 3 mm in diameter), en de twee groepen geïnjecteerd met twee verschillende typen cellen werden willekeurig verdeeld in vijf subgroepen (5 muizen per groep): normale zoutoplossing (NS) controlegroep, TWEEN controlegroep ADR groep, PAB groep en PAB + ADR groep. Voor de PAB groepen, PAB (25 mg /kg /d in 0,1 ml) opgelost in een waterige oplossing van 6% polyethyleenglycol, 3% ethanol en 1% Tween80 werd intraperitoneaal (i.p.) toegediend per dag gedurende 20 dagen [13]. Een identiek volume van waterige oplossing of NS werd geïnjecteerd in de tween controlegroep of NS controlegroep, respectievelijk. Voor de ADR-groep, ADR (1,25 mg /kg in 0,1 ml) verdund in NS werd i.p. dag gedurende 20 dagen [18]. Tumordragende muizen werden zowel PAB (25 mg /kg /d) en ADR (1,25 mg /kg /dag) toegediend i.p. voor dezelfde periode in het PAB + ADR-groep. Na behandeling werden de muizen uit elke groep opgeofferd en tumormonsters bilaterale okselstreek werden gewogen en uitgesneden voor immunohistochemische en Western blot analyses. Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Het protocol werd goedgekeurd door het Comité voor de ethiek van dierproeven van de Shengjing Hospital Affiliated naar China Medical University (Permit Number: 2013PS144K). De muizen werden opgeofferd onder de 10% chloraalhydraat verdoving, en alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren.

Meting en berekening van de tumor volume en gewicht

Het lichaamsgewicht werd gevolgd elke dag, en twee loodrechte diameters (lengte en breedte in mm) tumoren werden elke twee dagen gemeten met calipers gedurende de behandelingsperiode. Tumor volumina werden geschat met tweedimensionale metingen en berekend als volgt: tumorvolume (mm ^{3) = lengte (mm) x breedte 2 (mm) /2. De relatieve tumorvolume (RTV) als volgt berekend: RTV = (gemiddelde volume tumor tijdens de behandeling) /(gemiddelde tumorvolume bij het begin van de behandeling). De antitumor effecten van PAB en /of ADR werden geschat met de gemiddelde inhibitieverhouding (IR) van tumorgroei met de volgende formule: IR (%) = [(1-gemiddelde RTV of met geneesmiddel behandelde groep /gemiddelde RTV NS controlegroep ) x 100] [19]. De relatieve lichaamsgewicht van muizen werd berekend met de W _{t /W 0 index, waarin W t was het lichaamsgewicht op de dag van de meting en W 0 is het lichaamsgewicht bij de eerste dag van de behandeling. De verandering in lichaamsgewicht op dag 1 en 20, die het begin en einde van het experiment, respectievelijk, werd gebruikt om de effecten van geneesmiddelen op het lichaamsgewicht [20] evalueren en te analyseren.}}

Immunohistochemische kleuring voor expressie Cox-2, werden PKC-α en P-gp

tumormonsters gefixeerd met paraformaldehyde, routinematig verwerkt door inbedding in paraffine, en gesneden in 4-um secties. Na hematoxyline en eosine (HE) kleuring werden cellen van maagkanker xenotransplantaten waargenomen onder een lichtmicroscoop. De expressieniveaus van Cox-2, PKC-α en P-gp in geoogste tumorcellen werden bepaald met de SP methode. Kort na was ontdaan en gerehydrateerd schijfjes werden geïncubeerd in 0,3% H _{2O 2 oplossing en in een magnetron in citroenzuurbuffer gedroogd gedurende 15 minuten op antigenen te halen. De plakjes werden geblokkeerd met normaal geitenserum gedurende 30 minuten bij 37 ° C en gehybridiseerd met een konijn monoklonaal antilichaam tegen Cox-2 en muis monoklonale antilichamen tegen PKC-α en P-gp bij 4 ° C overnacht (alle antilichamen werden verdund tot 1 :300). Gebiotinyleerd anti-konijnen-IgG en anti-rat IgG toegevoegd en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 minuten voordat enzym geconjugeerd HRP-streptavidine toegevoegd. Bovendien, 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) werd gebruikt als chromogeen. Dia's werden met hematoxyline, gedehydrateerd in alcohol, en gemonteerd op neutraal balsem. Controles werden bereid met alleen secundaire antilichamen. Vijf velden van elke sectie van elke muis in elke groep werden geselecteerd voor het inzameling. De resultaten werden statistisch geanalyseerd en vergeleken door NIS-elementen Br 3,0 software, en de gemiddelde optische dichtheid werd verkregen om de expressie niveaus van Cox-2, PKC-α en P-gp.}

Western blot van Cox kwantificeren -2, PKC-α en P-gp in naakt muizen xenotransplantaten

Een totaal van 100 mg van vers bevroren tumorweefsels uit ten minste drie muizen van elke groep werden gewogen en aangevuld met radio immunoprecipitatie assay (RIPA) lysisbuffer [bevattende 100 ug /ml fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF)]. Na verpulverd met een schaar, werden extracten gehomogeniseerd met behulp van echografie. Na centrifugeren bij 14.000 rpm bij 4 ° C gedurende 30 min werd een monster supernatant ingevroren bij -80 ° C voor western blotting. De eiwitconcentratie van de extracten werd bepaald met een bicinchoninezuur (BCA) eiwitbepalingskit. Een totaal van 100 ug eiwit per muis onder denaturerende omstandigheden (100 ° C, 5 min) werd aan elektroforese met behulp van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) op 8% scheiding gel electroforese op PVDF-membranen met een natte overdracht systeem 100 V (Cox-2, PKC-α, β-actine van 100 min en P-gp 3 uur). Na het blokkeren met 5% magere melkpoeder in 1 x TBST (Tris-gebufferde zoutoplossing die 0,1% Tween 20) gedurende 90 minuten werden de membranen geïncubeerd met het primaire antilichaam [konijn monoklonaal antilichaam tegen Cox-2 (1:400) of muis monoklonale antilichamen tegen PKC-α (1:200) en P-gp (1:200) met β-actine als een interne controle voor eiwitbelading] gedurende de nacht bij 4 ° C. De antilichaambinding werd zichtbaar gemaakt onder toepassing van een peroxidase-gekoppeld secundair geit anti-konijn antilichaam (1:2000) en geit anti-muis antilichaam (1:2000) gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur geroerd. Vervolgens werden de membranen gevisualiseerd door verhoogde chemiluminescentie (ECL) reagens. De resultaten werden geanalyseerd met Image J software.

Statistische analyse

Alle gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde waarden ± standaarddeviatie en meerdere vergelijkingen tussen twee van de behandelde groepen werden geëvalueerd door een- ANOVA, met behulp van SNK en LSD methoden met SPSS 17.0 software. De relatie tussen lichaamsgewicht verandering en tumorvolume werden geanalyseerd door Pearson correlatie analyse. p waarden kleiner dan 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

remmende effect van PAB op de groei van menselijke maagkanker

De tumoren in alle behandelde groepen direct na gevormd de inplanting van single-cell suspensies, en de vorming bedroeg 100%. Wanneer de xenotransplantaten duidelijk werd, waren er geen significante verschillen in de gemiddelde omvang van de xenotransplantaten over verschillende groepen (Tabel 1), en de tumorvolumina werden gevolgd op verschillende tijdstippen in alle groepen. De curven van de tumorgroei van de twee cellijnen werden geplot (figuur 2A, 2B). Zoals getoond in Tabel 1, voor SGC7901 cellen behandelde groepen, werd geen significant verschil waargenomen tussen de PAB-groep en ADR groep in de gemiddelde relatieve volumes van de xenotransplantaten (p > 0,05), en de IR was 56,4% en 59,0%, respectievelijk. De toevoeging van ADR PAB resulteerde in hogere antitumorale activiteit dan die van PAB alleen of ADR alleen (p <0,05) met een IR van 88,1%. Het remmende effect van de PAB-groep was sterker vergeleken met die van de ADR groep op de xenotransplantaten van SGC7901 /ADR-cellen, en de IR-waarden waren 64,1% en 21,9%, respectievelijk (p < 0,05). Tumorgroeiremming was duidelijker in muizen behandeld met PAB combinatie met ADR, met een IR van 85,8%. De bevindingen van de tumor gewicht in verschillende groepen verder ondersteund onze resultaten met betrekking tot de omvang van de muizen xenotransplantaten. Figuur 2C en 2D geeft het verloop van de relatieve lichaamsgewicht van de muizen in de tien groepen. Het lichaamsgewicht was vergelijkbaar tussen de controlegroepen en behandelde groepen PAB. Echter, het lichaamsgewicht nam in de combinatie-behandelde groepen en groepen ADR, en de daling van de ADR groepen was duidelijker (p < 0,05). Bovendien Figuur 3 geeft een directe vergelijking van de afmetingen van de tumor SGC7901 cellen en SGC7901 /ADR-cellen in verschillende groepen. De relatie tussen lichaamsgewicht verandering en tumorvolume waren niet significant (p > 0,05). De geteste werden goed getolereerd door de muizen doseringen en geen dierlijke letaliteit waargenomen tijdens het experiment.

Immunohistochemische kleuring voor de expressie van Cox-2, PKC-α en P-gp

All tumoren in elke groep, via immunohistochemische kleuring weergegeven positieve uitdrukking van Cox-2, PKC-α en P-gp eiwitten. Cox-2 en PKC-α expressie werd gedefinieerd als positief als het gekleurde gebied van de tumorcellen was in het cytoplasma, en P-gp kleuring werd als positief beschouwd indien kleuring in de membraan en cytoplasma waargenomen. De eiwitten werden geel of bruin onder optische microscoop observatie (figuur 4) gekleurd. Voor de SGC7901 /ADR cellijn, de kleuring van deze eiwitten in de controlegroepen was sterker dan in de andere groepen (p < 0,05). PAB reduceerde de intracellulaire kleuring van Cox-2, PKC-α en P-gp opzichte van de ADR-behandelde groep (p < 0,05). Na PAB en ADR behandeling, de intracellulaire kleuring van deze eiwitten was zeldzamer en zwakker vergeleken met die van de andere groepen. Voor xenotransplantaten van beide NS controlegroepen, de kleuring van P-gp in de SGC7901 cellen was significant lager dan die van de SGC7901 /ADR-cellen (p < 0,05). De analyse van de kleurintensiteit van Cox-2, PKC-α en P-gp expressie leidde tot dezelfde resultaten (Tabel 2).

Effect van PAB op Cox-2, PKC-α en P-gp expressie in muizen xenotransplantaten

Om het moleculaire mechanisme van het effect van omkering PAB op SGC7901 opheldering /ADR xenotransplantaten in vivo de expressie van Cox-2, PKC-α en P-gp in tumoren van verschillende -reagens behandelde groepen werden bepaald door Western blot analyse. Zoals getoond in figuur 5, de NS controlegroep, werden de expressieniveaus van Cox-2, PKC-α en P-gp in de SGC7901 cel xenotransplantaten lager dan niet onder de SGC7901 /ADR cel tumoren (p < 0,05) . Voor tumoren van de SGC7901 /ADR-cellen, de expressieniveaus van de drie eiwitten van belang in de NS controlegroep en TWEEN controlegroep significant hoger in vergelijking met de andere groepen (p < 0,05) en er was geen significant verschil tussen de twee groepen (p > 0,05). De expressieniveaus van Cox-2, PKC-α en P-gp in de PAB-behandelde groep significant lager vergeleken met die van de ADR-behandelde groep (p < 0,05). De expressie van β-actine werd gebruikt als een interne controle, en de expressie van Cox-2, PKC-α en P-gp achtereenvolgens verlaagd bij de controlegroepen, ADR groep PAB groep en PAB + ADR (p < 0,05)

Discussie

PAB is een van de belangrijkste biologisch actieve componenten van de wortel schors van de medicinale plant Pseudolarix kaempferi Kopen en displays aanzienlijke cytotoxiciteit in de richting van enkele kankercel. lijnen. In vitro studies hebben ook aangetoond dat keert de MDR carcinoom door remming van de overexpressie van P-gp, zonder duidelijke bijwerkingen [13], [15], [20], [21]. Ook is aangetoond dat PAB heeft een antitumoreffect in muizen xenograft modellen van menselijke colonkanker en leverkanker [13], [20], en geen bekende bijwerkingen van PAB op dieren gerapporteerd. Onze eerdere studie toonde aan dat PAB een krachtige remmende werking op de SGC7901 cellijn in vitro en induceert apoptose van maagkanker cellen via caspase pathway [16]. Onze huidige in-vivo-studie levert verder bewijs dat PAB is beschermend tegen de maag tumoren in muizen xenograft modellen met behulp van SGC7901 cellen en SGC7901 /ADR-cellen. Preliminaire experimenten hebben aangetoond dat PAB bij 25 mg /kg niet alleen remt de groei van maagkanker maar ook goed getolereerd door muizen. Bovendien betrekking heeft op het TWEEN controlegroep om de invloed van de waterige oplossing die werd gebruikt om PAB lossen op tumoren [13] sluiten. Voor gevoelige cellen, de anti-kanker effecten van PAB geen significante verschillen ten opzichte van ADR, een traditionele chemotherapie drug. Daarnaast PAB is een biologisch actieve verbinding die het omkeren effect tegen SGC7901 /ADR cellijn tumoren uitgeoefend door zich te richten de signaalweg geactiveerd door P-gp overexpressie in vivo.

P-gp is een 170-kDa membraan eiwit dat fungeert als een medicijn efflux pomp, waardoor een continue defect in de intracellulaire accumulatie van geneesmiddelen [22]. De multidrug resistentie fenotype is de belangrijkste oorzaak van falen tumor chemotherapie en vooral het product van de overexpressie van P-gp in de meeste kankers, waaronder maag tumoren [23]. Bovendien kan de remming van deze route een manier om de MDR omkeren van maagkanker cellen [3], [24].

Cox-2, een induceerbaar enzym dat de omzetting van arachidonzuur katalyseert prostanoïden (be PG) en neemt deel aan verschillende fysiologische en pathologische gebeurtenissen, geïnduceerd door diverse inflammatoire en mitogene stimuli [25]. Een sterke associatie tussen MDR en de overexpressie van Cox-2 is bij talrijke typen tumoren. Deze eerdere resultaten suggereren dat Cox-2 moduleert de expressie en activiteit van P-gp en is betrokken bij de ontwikkeling van het MDR fenotype [26] - [28]. Bovendien heeft opgehoopt hebben aangetoond dat door Cox-2 inhibitoren de kankercellen om anti-proliferatieve effecten van chemotherapeutica sensibiliseren door het veranderen van de activiteit van de ATP-bindende cassette eiwit. Cox-2 remmers kunnen zelfs omkeren MDR blokkeert het cox-2-gemedieerde toename van MDR1 expressie en activiteit bij kanker, zowel in vitro als in vivo [6], [7], [29]. Daarom veronderstellen wij dat Cox-2 de expressie van P-gp in tumorweefsels kunnen reguleren en dat remming van deze route is van groot belang om de weerstand van kanker omkeren chemotherapeutica.

We vonden dat de SGC7901 /ADR celtumoren, de expressieniveaus van Cox-2 en P-gp in de NS controlegroep waren duidelijk hoger dan die voor de xenotransplantaten van SGC7901 cellen. Na de injectie van PAB, werd een duidelijke daling van deze expressieniveaus waargenomen. Echter, ADR was minder effectief voor de onderdrukking van de Cox-2 en P-gp expressie van de SGC7901 /ADR cel xenotransplantaten, en in combinatie met PAB, werd een lager niveau van eiwitten waargenomen. Zo hebben we voorgesteld dat modulatie van Cox-2 expressie door PAB kan de expressie en activiteit van P-gp verlagen groei te remmen en apoptose, naast samenwerkend handelen ADR in de onderdrukking van resistente tumoren en zelfs de omkering van het MDR fenotype van maagkanker.

PKC is een serine /threonine kinase betrokken bij de signaaltransductie die nodig is voor cellulaire proliferatie en differentiatie [30]. Van PKC isovormen, zijn de overexpressie en verhoogde activiteit van PKC-α nauwst betrokken zijn bij de regulering van het MDR fenotype in menselijke maagkanker [31]. De hier gepresenteerde resultaten ondersteunen het idee dat PKC fosforyleert-α P-gp, moduleert P-gp efflux functie, en uiteindelijk leidt tot resistentie [32]. De remming van PKC-α met een specifieke remmer of neerhalen PKC-α met siRNA leidt tot verminderde MDR1 expressie, verhoogde toxiciteit van geneesmiddelen tegen kanker, en omgekeerd MDR [8] - [10]. Derhalve speculeren wij dat PKC-α signaaltransductiesysteem een ​​rol bij het moduleren MDR1 expressie in maagkanker kan spelen.

Onder normale omstandigheden, PKC inactief in cellen en de activering heeft betrekking op PGE activatie upstream. Cox-2 is gekoppeld met membraangebonden prostaglandine E2 synthase (mPGES-1), en synthese van PGE gemedieerd door deze eiwitten verhogingen en activeert de stroomafwaartse PKC-α pathway [33]. Het is aangetoond dat selectieve Cox-2 remming door specifieke remmers of siRNA heeft een therapeutisch effect op het remmen van de expressie van PKC-α en P-gp, maar ook, tegelijkertijd, het omkeren MDR [26], [34]. Een studie heeft aangetoond dat PGE2 bemiddelt inductie van MDR1 expressie via de PKC pathway [35]. De resultaten van onze experimenten bleek dat PAB PKC-α expressie van xenotransplantaten van de SGC7901 /ADR cellijn, waarvan het effect is sterker dan die van ADR kan remmen. Bovendien, als PAB werd gecombineerd met ADR, de PKC-remming α expressie werkzaamheid was nog sterker. De variatie neiging van PKC-α expressie komt overeen met dat van Cox-2 en P-gp in verschillende reagens behandelde groepen resistente SGC7901 /ADR tumoren. Het is aangetoond dat PAB induceert groeistop en apoptose door middel van het remmen van de Cox-2 pathway in kankercellen [20], [21]. We veronderstellen dat PAB remt de expressie van Cox-2 in SGC7901 /ADR cel xenotransplantaten en dat de koppeling tussen Cox-2 en mPGES-1 vermindert de synthese van PGE, die de activering van stroomafwaartse PKC-α vermindert. Aangezien de fosforylering van P-gp wordt geremd, meer geneesmiddelen accumuleren in kankercellen, de toxiciteit van ADR wordt verbeterd en MDR omgekeerd. Deze resultaten geven inzicht in een nieuwe strategie die het gebruik van PAB MDR remmen van menselijke maagkanker.

Een focus van ons experiment is het remmende effect van pseudolaric zuur B subcutane xenotransplantaten van menselijke maagdarmkanker en de vergelijking anti-tumor effecten van drugs tussen verschillende behandelingsgroepen. Bovendien is het kenmerkend SGC7901 cellen en SGC7901 /ADR-cellen zijn verschillend. Via onze twee pre-experiment en een formele experiment, we vonden het tumorvolume van SGC7901 /ADR-cellen was niet groter dan SGC7901 cellen. We veronderstellen de tumor volume kan worden geassocieerd met het aantal cellen, de groei tijd, kenmerkend voor cellen en andere vormen van factoren. Daarom hebben we niet vergeleken de hoeveelheid tumor tussen SGC7901 cel xenotransplantaten en SGC7901 /ADR cel xenotransplantaten. Bovendien, we speculeren dat de gewichtsverandering muizen voornamelijk betrekking op de toxiciteit van geneesmiddelen kunnen zijn, en zijn niet significant verband met het tumorvolume in ons experiment.

De andere focus van ons experiment is de onderliggende moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de multidrug resistentie. Zo hebben we alleen ontworpen NS controlegroep SGC7901 cel xenotransplantaten contrast en bevestigen uitingen van de drie soorten eiwit van SGC7901 /ADR cel xenotransplantaten inderdaad significant hoger dan die van SGC7901 cel xenotransplantaten. Bovendien, aangezien de respons van SGC7901 cellen antikanker drugs eerder gevoeliger dan SGC7901 /ADR-cellen op zowel basis- als klinische experimenten, hoe de gevoeligheid van multidrug resistentie cellen verbeteren geneesmiddelen tegen kanker is het onderzoek gericht. Daarom hebben wij vergeleken de uitdrukking van Cox-2, PKC-α en P-gp voor tumoren SGC7901 en de verschillende behandelingen van deze groep behalve NS controlegroep met western blot en immunohistochemische kleuring.

onze studie ontdekte dat de kruiden diterpenoid PAB niet alleen significant onderdrukt maagkanker SGC7901 cellen in vivo maar ook weergegeven duidelijke remmende effecten tegen tumoren resistente SGC7901 /ADR-cellen. Bovendien kan de combinatie van PAB ADR de groei van maagkanker en de ontwikkeling van xenotransplantaten in naakt muizen remmen. Vermeldenswaard is dat als een soort van de traditionele Chinese geneeskunde, het effect van PAB van het lichaamsgewicht van naakt muizen was vrij lager dan dat van ADR in ons experiment, wat een duidelijk voordeel dat PAB een veiliger en aanvaardbaar drug maakt kankertherapie. PAB kan niet alleen een nieuw effectief geneesmiddel voor de remming van de groei van maagkanker en MDR omkeren, maar het kan ook worden gebruikt als een uitstekend adjuvans met traditionele chemotherapeutische middelen en chirurgische therapie na verdere ontwikkeling en onderzoek.

in het onderhavige onderzoek onderzochten we, voor het eerst, het remmende effect van PAB tegen menselijke maagkanker en de omkering effect over MDR in vivo via een naakt xenograft muismodel. We vastgesteld dat de remming van MDR werd bemiddeld door de Cox-2 /PKC-α /P-gp route, die een cruciale theoretische basis betreffende de moleculaire mechanismen van maagkanker toedient. Echter, we hebben niet onderzocht de MDR-mechanisme met betrekking tot genexpressie en regelgeving. Als de moleculaire mechanismen van omkering MDR buitengewoon ingewikkeld en verschillende soorten eiwitten, genen en factoren betrokken kunnen zijn, kan de lus die wij hebben voorgesteld slechts een deel van het mechanisme voor het omkeren MDR zijn. Meer diepgaande en concrete regelgeving mechanismen moeten worden toegelicht in toekomstige studies.

Tot slot, PAB heeft een significant remmend effect op maagkanker in vivo en kan de MDR van maagkanker te keren op chemotherapie drugs. Het mechanisme tegen MDR ten minste gedeeltelijk gemedieerd via de Cox-2 /PKC-α /P-gp route. Onze studie biedt brede perspectieven voor toekomstige onderzoeken van PAB in maagkanker therapie.

Ondersteunende informatie
Checklist S1.
KOMEN Richtlijnen Checklist
doi:. 10.1371 /journal.pone.0107830.s001
(DOC)

• PLoS ONE: Chemotherapie of doelgerichte therapie als tweede lijn behandeling van gevorderde maagkanker. Een systematische review en meta-analyse van Gepubliceerd Studies
• PLoS ONE: intratumor IL-17-positieve mestcellen zijn de voornaamste bron van de IL-17 die voorspellend is voor overleving bij maagkanker Patients