PLoS ONE: De mikroRNA-217 Fungerer som en potensiell Tumor lyddemper i magekreft ved å målrette GPC5

Abstract

Magekreft (GC) er en av de vanligste kreftformen i verden. Emerging bevis har vist at avvikende uttrykk for microRNAs (miRNAs) spiller viktige roller i kreft progresjon. Men lite er kjent om den potensielle rolle MIR-217 i GC. I denne studien undersøkte vi rollen til mir-217 på GC-celleproliferasjon og invasjon. Uttrykket av MIR-217 ble nedregulert i GC celler og menneske GC vev. Tvangs uttrykk for MIR-217 hemmet GC celler spredning og invasjon. Videre Glypican-5 (GPC5), en ny ocncogene, ble identifisert som potensielt mål av MIR-217. I tillegg overekspresjon av MIR-217 svekket GPC5-indusert fremme spredning og invasjonen i GC-celler. I konklusjonen, disse funnene viste at MIR-217 fungerte som en tumor suppressor og hemmet spredning og invasjonen av GC-celler ved å målrette GPC5, som kan dermed tjene som et terapeutisk mål for GC pasienter

Citation. Wang H Dong X, Gu X, Qin R, Jia H, Gao J (2015) The mikroRNA-217 Fungerer som en potensiell Tumor lyddemper i magekreft ved målretting GPC5. PLoS ONE 10 (6): e0125474. doi: 10,1371 /journal.pone.0125474

Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, KINA

mottatt: 10 oktober 2014; Godkjent: 24 mars 2015; Publisert: 22 juni 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den fjerde mest vanlige menneskelige malignitet og den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, med anslagsvis en million nye tilfeller per år [1-4]. Til tross for de siste fremskritt innen diagnostisk metode, kirurgisk teknikk og nye kjemoterapiregimer, er den langsiktige overlevelsen for GC fortsatt ganske lav [5, 6]. I mange pasienter, er GC diagnostisert på avansert stadium med omfattende invasjon og lymfatiske metastasering. Vellykket terapeutiske strategier er begrenset, og dødeligheten er høy [7]. Derfor er det haster å undersøke de grunnleggende molekylære mekanismene bak legemiddelresistens, histologisk heterogenitet, og utvikling av metastaser til å identifisere nye markører for diagnose og behandling for GC.

microRNAs (mirnas) er små, ca 22 -nucleotide, ikke-kodende RNA som fungerer som negative regulatorer av proteinkodende gener på posttranskripsjonelt nivå [8, 9]. Ved binding til de komplementære sekvenser i de 3'-utranslaterte regioner (3'-UTR) av sine mål mRNA, kan mirnas indusere direkte mRNA degradering eller translasjonsbevegelse inhibering [10-13]. Økende bevis har antydet at mirnas er involvert i mange viktige biologiske prosesser, inkludert celle proliferasjon, differensiering, apoptose, angiogenese og immunrespons. Deregulering av mirnas kan føre til avvikende genekspresjon i forskjellige sykdommer, inkludert magekreft [14-16]. Imidlertid er forståelse av rollen og funksjon av mirnas i GC fortsatt i tidlig stadium. På samme måte rollene til mange andre abnormt uttrykt mirnas i GC utvikling er fortsatt ukjent.

nedregulering av MIR-217 er en hyppig hendelse i ulike kreftformer, noe som tyder på sin viktige rolle i tumorigenesis [17-19]. Men lite er kjent om den potensielle rolle MIR-217 i GC. I denne studien ble ekspresjonen av MIR-217 redusert i GC-cellelinjer og vev. I tillegg lavere uttrykk for Mir-217was forbundet med pTNM scenen. Overekspresjon av MIR-217 trykt GC celle invasjon og spredning. Videre luciferase reporter analysen og western blot bekreftet at Mir-217might fungere som en tumor suppressor i GC ved targetingGlypican-5 (GPC5).

Materialer og metoder

Etikk erklæringen

Alle pasientene ble enige om å delta i studien og ga skriftlig informert samtykke. Denne studien og samtykke ble godkjent av den etiske styret for Institutt for Affiliated Yanan Hospital of Kunming Medical University og følges Helsinkideklarasjonen.

Vevsprøver

Prøver av menneskelige GC vev og sammenkoblede -adjacent ikke-tumor mage vev som var lengre enn 5 cm fra svulstene ble oppnådd fra 50 pasienter som gjennomgikk kirurgi reseksjon ved The Affiliated Yanan Hospital of Kunming Medical University. Friske prøver var hurtigfrosset inliquid nitrogen umiddelbart etter reseksjon og lagret ved -80 ° C. Alle prøvene ble oppnådd med pasientens informerte samtykke og ble histologisk bekreftet ved farging med hematoksylin-eosin. Den histologisk grad av kreft ble vurdert etter kriterier fastsatt av Verdens helseorganisasjon. Ingen av pasientene, radioterapi eller kjemoterapi før kirurgi. Karakteristikken av pasienter er beskrevet i S1 tabell.

Cellelinjer og cellekultur

Menneskelige mage kreft cellelinjer SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 og en normal gastrisk epitel cellelinje GES-en (som kontroll) ble kjøpt fra institutt for biokjemi og cellebiologi ved Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 ble dyrket i RPMI 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og GES-1 ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Invitrogen). Alle media ble supplert with10% føtalt bovint serum. Cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2.

RNA-ekstraksjon og QRT-PCR

Total RNA ble ekstrahert fra frosne prøver (eller celler) ved anvendelse av Trizol ( Invitrogen) etter produsentens guide. 1 ml av RNA ble brukt til å måle uttrykket av MIR-217 ved kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) med TaqMan miRNA revers transkripsjon kit andtheTaqMan miRNA analysespesifikke RT primere for MIR-217 i henhold til instruksjonene fra produsenten (Applied Biosystems, Foster City, California). Ekspresjon av U6 ble benyttet som intern kontroll. Real-time PCR ble utført med 1 ml av hver cDNA på en Step One Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, California) i duplikater. Ekspresjonen av MIR-217 ble definert basert på terskelen syklus (Ct), og relative uttrykk nivåer ble beregnet as22 ^{- [(Ct av MIR-217) - (Ct av U6)] etter normalisering med henvisning til ekspresjon av U6 liten kjernefysiske RNA [20, 21] (S2 tabell).}

Western blot

Totalt protein ble hentet fra frosne prøver (eller celler) ved hjelp av en Total protein Extraction Kit (KeyGen, Nanjing , Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Måling av proteinkonsentrasjonen ble gjort ved hjelp av en BCA Protein Assay Kit (KeyGen). Western blot-analyse ble utført som tidligere beskrevet [22]. De primære antistoffer som brukes for western blot var kanin polyklonale anti-GPC5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), mus monoklonalt anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

Cell transfeksjon

Mir-217 etterligne, etterligner kontroll (rykke), MIR-217-hemmer, hemmer kontroll, Pez-GPC5 og kontroll vektor ble kjøpt fra RiboBio (Guangzhou, Kina). De HGC-27-celler ble sådd ut i seks-brønns plater ved 30% konfluens en dag før transfeksjon. Lipofectamine2000 (Invitrogen) ble anvendt for transfeksjon av plasmid alene eller sammen med RNA-oligonukleotider.

luciferase-analyser

celler av 8 x 10 ^{3 ble sådd ut i 96-brønners plater. Etter 24-hincubation, en blanding av 100 ng pLUC-3'-UTR, 5-pmol negativ kontroll, MIR-217mimic ble kotransfektert med 20 ng Renilla inn i celler ved anvendelse av Lipofectamine 2000. Tjuefire hoursafter transfeksjon, firefly og Renilla luciferase-aktivitet var målt med en Dual-luciferaserapportørplasmid System (Promega, Madison, WI, USA). Transfeksjonseffektiviteten ble normalisert ved kotransfeksjon med en Renilla reporter vektor.}

Celleproliferasjon

Cells (3000 /brønn) ble oppsamlet og utsådd i 96-wellplates og inkubert ved 37 ° C etter transfeksjon. Etter inkubering i 1 til 5 dager, til mediet i hver brønn ble det tilsatt 10% Celletelling leder-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan), og platene ble ytterligere inkubert i ytterligere 3 timer ved 37 ° C. Deretter ble mediet erstattet med 150 ml dimetylsulfoksid (DMSO, Sigma-Aldrich), og absorbansen ble målt ved 450 nm ved anvendelse av en mikroplateleser (soloppgang). Analysen ble gjentatt 3 ganger med seks replikater.

Northern blot

Total RNA ble isolert fra hverandre vev ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen Life Technologies) og Northern blotting ble gjennomført som tidligere beskrevet [23] . Etter Perfekt Hyb Plus hybridisering ved 68 ° C, ble membraner utviklet og analysert. Northern blot hybridisert med en 18S ribosomal RNA (rRNA) cDNA ble anvendt som kontroller.

Cell invasjons

bølgen analyser ble utført in triplo ved bruk av Transwell invasjons kamre som er belagt med Matrigel (BD, USA) som beskrevet i produsentens protokoll. -Celler ble transfektert withmiR-217 etterligner, inhibitor eller negativ kontroll-oligonukleotid, dyrket i 48 timer, og så overført på toppen av Matrigel-belagte invasjons kamre i et serum-fritt DMEM (1 x 10 ^{5 celler pr Transwell). DMEM inneholdende 10% føtalt kalveserum ble tilsatt til de nedre kamre. Etter inkubering i 24 timer, celler som forble på toppen av filteret ble skrubbet av, og cellene som migrerte til den nedre overflate ble fiksert in90% alkohol og etterfulgt av krystall-fiolett flekk.}

Histologi

Histologisk diagnose var i henhold til trippel-området mage biopsi metoden. Vev ble løst over natten i bufret formalin, innstøpt i parafin, skåret i tre-mikrometer tykkelse, og farget med hematoksylin-eosin (H & E). Farging

Statistisk analyse

Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 17.0 statistiske programvarepakken. Forsøkene ble gjentatt uavhengig av hverandre minst tre ganger, og data presentert som gjennomsnitt ± SD. Sammenhengen mellom MIR-217 og GPC5 ble analysert ved hjelp av Spearmans korrelasjon test. Sammenligninger mellom grupper for statistisk signifikans ble gjennomført med Student paret to halet t-test eller Enveis ANOVA. P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.

Resultat

Uttrykket av MIR-217 er nedregulert i GC cellelinjer

Vi først kvantifisert uttrykk nivået av MIR-217 i fire menneskelige GC cellelinjer (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) og GES-en ved hjelp av Northern blot (fig 1A). Ekspresjonsnivået av MIR-217 wasdecreased i GC-cellelinjer sammenlignet med GES-1. QuantitativeRT-PCR viste også at ekspresjon av MIR-217 ble redusert i GC-cellelinjer (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) sammenlignet med GES-1, en normal gastrisk epitelcellelinje (fig 1B ).

MiR-217 er nedregulert i GC vev

Kvantitativ RT-PCR ble brukt til å undersøke Mir-217 uttrykk i 50 GC vev og deres sammenkoblede tilstøtende noncancerous vev. De representative histologiske karakteristika GC og dets tilstøtende sammenkoblede noncancerous vev er vist i fig 2A. Blant 50 tumorvev, 44 tilfellene utviste redusert MIR-217 ekspresjon sammenlignet med de tilstøtende normale vev (88%, 44 50, figur 2B). Uttrykket av MIR-217 var lavere i GC vev enn i tilstøtende noncancerous vev (Fig 2C). Videre lavere nivåer av Mir-217 uttrykk knyttet til pTNM stadium av GC pasienter (fig 2D).

MIR-217 hemmer GC celleproliferasjon og invasjon

Uttrykket av MIR-217was økt i transfekterte HGC-27 celler ved hjelp av Mir-217 etterligner (fig 3A) og redusert ved hjelp av MIR-217 inhibitor (figur 3B). Utbredelsen ble redusert i HGC-27 celler transfektert withmiR-217 ligner sammenlignet med celler transfektert med krafse eller ubehandlet (Fig 3C). I mellomtiden ble øket spredning i HGC-27-celler transfektert withmiR-217inhibitor sammenlignet med celler transfektert med kontroll eller ubehandlet (figur 3D). Den invasivitet av celler transfektert med Mir-217 etterligner ble redusert sammenlignet med de rykke gruppe eller kontroll gruppe celler og MIR-217 inhibitor økt celle invasjon sammenlignet med de rykke gruppe eller kontroll gruppe celler (figur 3E).

MIR -217 posttranskripsjonelt reduserer GPC5 uttrykk ved direkte rettet mot sine 3'UTR

analyse ved hjelp av tilgjengelige algoritmer indikerte at GPC5 var en teoretisk target gen av MIR-217 (figur 4A) [24]. For å bevise at MIR-217 direkte rettet mot GPC53'UTR, utførte vi luciferasereportergenet analyser. Ektopisk av MIR-217 redusert luciferase aktivitet i GPC5 villtype reporter genet, men ikke den muterte GPC5 3'UTR, noe som indikerer at MIR-217 direkte målrettet GPC5 3'UTR (fig 4B). MRNA nivået av GPC5 ble redusert etter transfeksjon med Mir-217 etterligner og økte etter transfeksjon med MIR-217 inhibitor hjelp QRT-PCR (fig 4C). I samsvar med dette resultatet, ble evnen til MIR-217 for å regulere uttrykk for GPC5 protein verifisert av western blotting (fig 4D).

Restaurering av MIR-217 hemmer GPC5-mediert GC celleproliferasjon og invasjon

Overuttrykte av GPC5 fremmet GC celleproliferasjon og invasjon. Når MIR-217 etterligne og Pez-GPC5 ble transfektert inn HGC-27 celler, Mir-217 uttrykk redusert GPC5-indusert GC celleproliferasjon og invasjon (Fig 5A og 5C). Inhibering av GPC5 redusert GC celleproliferasjon og invasjon. Når MIR-217 hemmer og shGPC5 ble transfektert inn HGC-27 celler, MIR-217 inhibitor fremmet shGPC5-hemmet celleproliferasjon og invasjon (Fig 5B og 5D).

GPC5 er oppregulert i GC cellelinjer og prøver

ekspresjon av GPC5 var høyere i GC-cellelinjer (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) sammenlignet med GES-1, en normal gastrisk epitel cellelinje (figur 6A). Protein nivåer av GPC5 var også høyere i GC vev enn i tilstøtende noncancerous vev ved hjelp av western blot (fig 6B).

Diskusjoner

GC forårsaker nesten en million dødsfall på verdensbasis per år [25] . Nylig har akkumulere bevis antydet at mirnas spille en avgjørende rolle i patogenesen av GC gjennom regulering av celleproliferasjon, apoptose, migrasjon, annonser invasjonen [26-28]. I denne studien ble MIR-217 hyppig nedregulert i humane GC cellelinjer og vev og det lavere nivået av MIR-217 var forbundet med pTNM stadium av GC. Videre forsøk viste at overekspresjon av MIR-217 kan undertrykke GC celle migrasjon og invasjon. GPC5 ble identifisert som en direkte og funksjonell målet på MIR-217. Vi konkluderer med at MIR-217 synes å være en ny tumor suppressor i GC, og at downregulated MIR-217 kan bidra til tumor utvikling og progresjon i GC pasienter. Nedregulering av MIR-217 er en hyppig hendelse i ulike kreftformer, noe som tyder på sin viktige rolle i tumorigenesis [17-19]. Li og hans kolleger viste at MIR-217 ble nedregulert i klarcellet nyrecellekarsinom (ccRCC) sammenlignet med paret normalt vev [29]. Lavere MIR-217 uttrykksnivå var assosiert med høyere svulst klasse og scene. I denne studien ble MIR-217 ofte nedregulert i GC. Forbløffende nok pasienter med lavere uttrykk for MIR-217 hadde en tendens til å ha mer avansert TNM stadium, noe som tyder på at lav uttrykk ofmiR-217was forbundet med GC progresjon. Videre studier viste at overekspresjon av MIR-217 trykt GC celle invasjon og spredning. Sammen med tidligere resultater, disse data tyder på at Mir-217might spiller en avgjørende rolle i GC vev homeostase og deregulatedmiR-217 kan bidra til utvikling av en mage neoplasi.

For å undersøke den molekylære mekanismen av tumor suppressor rolle av MIR-217 i GC, brukte vi luciferase reporter analysen og western blot for å bekrefte at GPC5 var et mål av MIR-217 i GC-celler. For å bekrefte direkte regulering av GPC5 av MIR-217, brukte vi GPC 3 'UTR reporter vektor bærer potensialet MIR-217 bindingsstedet i fluorescerende reporter. Videre QRT-PCR og western blot analyse viste at overekspresjon av MIR-217 hemmet GPC uttrykk. Glypicans er en familie av proteoglykaner som er knyttet til den exocytoplasmic overflate av plasmamembranen via et glycosyl phosphatidylinositol anker [30, 31]. Seks glypicans er blitt identifisert i pattedyr (GPC1 til GPC6) [32, 33]. GPC5 er hovedsakelig uttrykt i utvikling av sentralnervesystemet, lemmer, nyre, lunge og lever [34, 35]. Nylige studier har antydet at noen GPCs, spesielt GPC3 andGPC5, kan spille en viktig rolle i regulering av kreft progresjon [35, 36]. For eksempel Zhang
et al. viste at GPC5 ble sterkt uttrykt i SACC-M (høy cellelinje lunge-metastatisk) og i kliniske prøver av spytt adenoid cystisk karsinom (SACC) tilfeller med lungemetastaser [36]. Den samlede uttrykket nivået av GPC5 i kliniske tilfeller av SACC med lungemetastaser var høyere. Williamson et al. viste at genet som koder for GPC5was amplifisert i 20% av pasienter med alveolær rhabdomyosarkom (RMS), og at denne glypican ble overuttrykt i RMS-pasienter. Videre nedregulering av GPC5 uttrykk av siRNA hemmet spredning rate av RMS celler. En annen studie funnet at høye nivåer av ekspresjon GPC5 forutsagte fattige postsurgical overlevelsestider for curatively respektert NSCLC, noe som tyder på at verdien av GPC5 som molekyl prognostisk indikator [35, 37]. I vår studie, uttrykk for GPC5 var høyere i GC cellelinjer og proteinnivåer GPC5 var også høyere i GC vev enn i tilstøtende noncancerous vev. Inhibering av GPC5 redusert GC celleproliferasjon og invasjon. Restaurering av MIR-217 hemmet GPC5-mediert GC celleproliferasjon og invasjon. Resultatene viste at Mir-217might fungere som en tumor suppressor i magekreft ved å målrette GPC5.

I konklusjonen, denne studien viste at Mir-217was nedregulert i GC vev og cellelinjer. Lave nivåer av MIR-217 ekspresjon var assosiert med pTNM stadium av pasientene. Ektopisk MIR-217 uttrykk resulterte i hemming av GC celleproliferasjon og invasjon. Videre undersøkelser viste at GPC5 var et potensielt mål av MIR-217. MIR-217 kan tjene som en prediktor for prognose og et terapeutisk mål for GC pasienter.

Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Oppsummering av clinicopathological parametere av pasienter med magekreft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125474.s001 plakater (docx)
S2 Table. Primersekvensen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125474.s002 plakater (docx)

• PLoS ONE: mikroRNA-137 Bidrar til Dempet tumorigenesis i Human Gastric Cancer av målretting AKT2
• PLoS ONE: Survival analyse av pasienter med intervallkreft under mage Cancer Screening av Endoscopy