PLOS ONE: Les microARN-217 Fonctionne comme un suppresseur de tumeur potentielle dans le cancer gastrique par ciblage GPC5

Résumé

Le cancer gastrique (GC) est l'une des tumeurs malignes les plus courantes dans le monde entier. De nouvelles preuves ont montré que l'expression aberrante de microARN (miARN) joue un rôle important dans la progression du cancer. Cependant, on sait peu sur le rôle potentiel de miR-217 en GC. Dans cette étude, nous avons étudié le rôle de miR-217 sur la prolifération des cellules GC et l'invasion. L'expression de miR-217 a été régulée à la baisse dans les cellules et les tissus GC GC humaines. expression forcée de miR-217 cellules GC a inhibé la prolifération et l'invasion. En outre, Glypican-5 (GPC5), une nouvelle ocncogene, a été identifiée comme la cible potentielle de miR-217. En outre, la surexpression de miR-217 ayant une déficience promotion induite GPC5-prolifération et l'invasion des cellules GC. En conclusion, ces résultats ont révélé que miR-217 a fonctionné comme un suppresseur de tumeur et inhibait la prolifération et l'invasion des cellules du GC en ciblant GPC5, ce qui pourrait par conséquent servir de cible thérapeutique pour les patients du GC

Citation:. Wang H , Dong X, Gu X, Qin R, Jia H, Gao J (2015) Le microARN-217 Fonctionne comme un suppresseur de tumeur potentielle dans le cancer gastrique par ciblage GPC5. PLoS ONE 10 (6): e0125474. doi: 10.1371 /journal.pone.0125474

Editeur: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, CHINE

reçues: 10 Octobre 2014; Accepté le 24 Mars 2015; Publié le 22 Juin, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Wang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

financement:.. les auteurs ont pas de soutien ou de financement pour signaler

intérêts concurrents:. les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

introduction

le cancer gastrique (GC) est le quatrième tumeurs malignes humaines les plus courantes et la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde, avec environ un million de nouveaux cas par an [1-4]. Malgré les progrès récents dans la méthode de diagnostic, la technique chirurgicale et les nouveaux protocoles de chimiothérapie, le taux de survie à long terme pour GC est encore assez faible [5, 6]. Chez de nombreux patients, GC est diagnostiqué à un stade avancé avec une vaste invasion et la métastase lymphatique. stratégies thérapeutiques efficaces sont limitées et le taux de mortalité est élevé [7]. Par conséquent, il est urgent d'étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents fondamentaux de la résistance aux médicaments, l'hétérogénéité histologique, et le développement de métastases à identifier de nouveaux marqueurs pour le diagnostic et le traitement pour GC
.

microARN (miARN) sont de petite taille, environ 22 nucléotide, des ARN qui fonctionnent comme des régulateurs négatifs de gènes codant pour des protéines au niveau post-transcriptionnel non codante [8, 9]. En se liant à des séquences complémentaires dans les régions non traduites en 3 '(3' UTR) de leurs ARNm cibles miARN peuvent induire une dégradation de l'ARNm ou de l'inhibition directe de la traduction [10-13]. Des preuves croissantes a montré que les miARN sont impliqués dans de nombreux processus biologiques importants, y compris la prolifération cellulaire, la différenciation, l'apoptose, l'angiogenèse et la réponse immunitaire. La déréglementation des miARN peut conduire à l'expression génique aberrante dans diverses maladies, y compris le cancer gastrique [14-16]. Cependant, la compréhension du rôle et de la fonction des miARN dans la GC est encore au stade précoce. De même, les rôles de nombreux autres miARN aberrantly exprimées dans le développement de GC sont encore inconnues.

La régulation négative de miR-217 est un événement fréquent dans divers cancers, suggérant son rôle important dans la tumorigenèse [17-19]. Cependant, on sait peu sur le rôle potentiel de miR-217 en GC. Dans cette étude, l'expression de miR-217 a été réduite dans les lignées cellulaires et les tissus GC. En outre, une plus faible expression de miR-217was associée à l'étape de pTNM. La surexpression de miR-217 a supprimé l'invasion des cellules GC et la prolifération. En outre, la luciférase dosage rapporteur et western blot a confirmé que la fonction miR-217might comme un suppresseur de tumeur dans GC par targetingGlypican-5 (GPC5).

Déclaration d'éthique de matériaux et méthodes

Tous les patients ont accepté de participer à l'étude et ont donné leur consentement éclairé par écrit. Cette étude et le consentement a été approuvé par le comité d'éthique de l'Institut de l'Hôpital affilié YanAn de l'Université médicale de Kunming et respecter la Déclaration d'Helsinki.

Des échantillons de tissus

Des échantillons de tissus GC humaines et appariés non-tumorales tissus gastriques -adjacent qui étaient plus de 5 cm des tumeurs ont été obtenues à partir de 50 patients ayant subi une chirurgie exérèse au The Affiliated Hospital YanAn de l'Université médicale de Kunming. Les échantillons frais ont été l'azote inliquid congelés pression immédiatement après résection et stockés à -80 ° C. Tous les échantillons ont été obtenus avec le consentement éclairé des patients et ont été confirmées par coloration histologique à l'hématoxyline-éosine. Le grade histologique des cancers a été évaluée selon les critères fixés par l'Organisation mondiale de la santé. Aucun des patients n'a reçu radiothérapie ou une chimiothérapie avant la chirurgie. Les caractéristiques des patients sont décrits dans le tableau S1.

Les lignées cellulaires et la culture
cellulaire

lignées cellulaires de cancer gastrique humaine SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 et une normale lignée de cellules épithéliales gastriques GES-1 (comme témoin) ont été achetés auprès de l'Institut de biochimie et de biologie cellulaire à l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 ont été propagées dans du milieu RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et GES-1 a été reproduit dans le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Invitrogen). Tous les médias ont été complétées avec 10 sérum bovin foetal%. Les lignées cellulaires ont été cultivées à 37 ° C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2.

Extraction de l'ARN et qRT-PCR

ARN total a été extrait à partir d'échantillons congelés (ou les cellules) en utilisant du Trizol ( Invitrogen) en suivant le guide du fabricant. 1ml de l'ARN a été utilisé pour mesurer l'expression de miR-217 par RT-PCR quantitative (qRT-PCR) avec les TaqMan miRNA kit de transcription inverse andtheTaqMan miRNA spécifiques essai amorces RT pour miR-217 selon les instructions du fabricant (Applied Biosystems, Foster City, CA). L'expression de la U6 a été utilisé comme contrôle interne. PCR en temps réel a été réalisée avec 1 ml de chaque ADNc sur une étape du système One Plus Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) en double. L'expression de miR-217 a été défini sur la base du cycle seuil (Ct), et les niveaux d'expression relatifs ont été calculés AS22 ^{- [(Ct de miR-217) - (Ct de U6)] après la normalisation en référence à l'expression de U6 petit ARN nucléaire [20, 21] (S2 Tableau).}

Western blot

la protéine totale a été extrait à partir d'échantillons congelés (ou les cellules) en utilisant un kit d'extraction totale des protéines (KeyGen, Nanjing , Chine) selon les instructions du fabricant. Mesure de la concentration en protéines a été effectuée en utilisant un kit BCA Protein Assay (KeyGen). L'analyse Western blot a été réalisée comme décrit précédemment [22]. Les anticorps primaires utilisés pour western blot étaient polyclonaux de lapin anti-GPC5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), monoclonal de souris anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

Cellule transfection

Le miR-217 mimique, le contrôle synoptique (scramble), miR-217 inhibiteur, le contrôle inhibiteur, PEZ-GPC5 et vecteur de contrôle ont été achetés à RiboBio (Guangzhou, Chine). Les cellules HGC-27 ont été ensemencées dans des plaques à six puits à une confluence de 30% un jour avant la transfection. Lipofectamine2000 (Invitrogen) a été utilisée pour la transfection du plasmide seul ou conjointement avec des oligonucléotides d'ARN.

dosages de luciferase

cellules de 8 x 10 ^{3 ont été étalées dans des plaques à 96 puits. Après 24 hincubation, un mélange de 100 ng Pluc-3 'UTR, 5 pmol de contrôle négatif, miR-217mimic a été cotransfecté avec 20 ng Renilla dans les cellules en utilisant la Lipofectamine 2000. Vingt quatre hoursafter la transfection, les activités de luciférase de luciole et de Renilla ont été mesurée à l'aide d'un système de Reporter Dual-Luciferase (Promega, Madison, WI, USA). L'efficacité de transfection a été normalisé par cotransfection avec un vecteur rapporteur Renilla.}

La prolifération cellulaire

Cells (3000 /puits) ont été collectées et ensemencées dans 96 wellplates et incubées à 37 ° C après la transfection. Après une incubation de 1 à 5 jours, on a ajouté les médias de chaque puits 10% Décompte Cellulaire Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japon), et les plaques ont ensuite été incubées pendant 3 heures à 37 ° C. Ensuite, le milieu a été remplacé par 150 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO, Sigma-Aldrich) et l'absorbance a été mesurée à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaque (Sunrise). Le test a été répété 3 fois avec six répétitions.

Northern blot

ARN total a été isolé à partir de chaque tissu en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen Life Technologies) et Northern blot a été réalisée comme décrit précédente [23] . À la suite de l'hybridation parfaite Hyb plus à 68 ° C, les membranes ont été développées et analysées. Northern blots hybridés avec un ARN 18S ribosomique (ARNr) ADNc ont été utilisés comme témoins.

Les tests d'invasion de cellules invasion ont été réalisées en triple, avec Transwell chambres d'invasion revêtues de Matrigel (BD, USA) comme décrit dans le protocole du fabricant. Les cellules ont été transfectées withmiR-217 imite, inhibiteur ou négatif oligonucléotide de contrôle, de culture pendant 48 h, et transférés sur le dessus des chambres d'invasion Matrigel revêtues dans un DMEM sans sérum (1 × 10 ^{5 cellules par Transwell). DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal ont été ajoutés aux chambres inférieures. Après une incubation de 24 h, les cellules qui sont restées sur le dessus du filtre ont été lavés au large et les cellules qui ont migré vers la surface inférieure ont été fixés in90% d'alcool et suivis par le cristal violet tache.}

histologie

le diagnostic histologique a été selon le procédé de biopsie gastrique triple site. Les tissus ont été fixés dans du formol tamponné pendant une nuit, noyées dans de la paraffine, coupées à une épaisseur de 3 um et colorées à l'hématoxyline-éosine (H & E). Coloration

Analyse statistique

Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant le logiciel statistique SPSS 17.0. Les expériences ont été répétées de manière indépendante au moins trois fois, et les données présentées sous forme de moyenne ± SD. L'association entre miR-217 et GPC5 a été analysée en utilisant le test de corrélation de Spearman. Les comparaisons entre les groupes de signification statistique ont été menées avec deux paires test t bilatéral ou One-way ANOVA de l'étudiant. P < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultat

L'expression de miR-217 est downregulated dans des lignées cellulaires de GC

Nous avons tout d'abord quantifié le niveau d'expression de miR-217 en quatre lignées humaines de GC cellulaires (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) et GES-1 en utilisant northern blot (Fig 1A). Le niveau d'expression de miR-217 wasdecreased dans des lignées cellulaires GC par rapport aux GES-1. QuantitativeRT-PCR a également montré que l'expression de miR-217 a été réduite dans les lignées cellulaires du GC (CGS-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) par rapport à GES-1, une lignée cellulaire normale de l'épithélium gastrique (figure 1B ).

miR-217 est downregulated dans les tissus du GC

RT-PCR quantitative a été utilisé pour examiner miR-217 expression dans 50 tissus GC et leurs tissus noncancerous adjacents appariés. Les caractéristiques histologiques représentatives de GC et ses tissus noncancerous adjacents appariés ont été représentés sur la figure 2A. Parmi les tissus 50 tumoraux, 44 cas présentaient une diminution d'expression de miR-217 par rapport aux tissus adjacents normaux (88%, 44 50, figure 2B). L'expression de miR-217 était plus faible dans les tissus du GC que dans les tissus non cancéreux adjacents (figure 2C). En outre, des niveaux inférieurs d'expression miR-217 associés à la phase de pTNM des patients du GC (figure 2D).

miR-217 inhibe la prolifération des cellules GC et de l'invasion

L'expression de miR-217was augmenté dans transfectées HGC-27 cellules en utilisant miR-217 imite (figure 3A) et diminué en utilisant miR-217 inhibiteur (figure 3B). La prolifération a été réduit dans les HGC-27 cellules transfectées withmiR-217 imite par rapport aux cellules transfectées avec scramble ou non traitées (figure 3C). Pendant ce temps, la prolifération a été augmentée en HGC-27 cellules transfectées withmiR-217inhibitor par rapport aux cellules transfectées avec le contrôle ou non traitées (figure 3D). Le invasivité des cellules transfectées avec miR-217 imite a diminué par rapport aux cellules de groupe de groupe ou de contrôle de brouillage et miR-217 inhibiteur accru l'invasion des cellules par rapport aux cellules de groupe de groupe ou de contrôle de brouillage (figure 3E).

miR -217 posttranscriptional réduit l'expression de GPC5 en ciblant directement ses 3'UTR

analyse en utilisant des algorithmes disponibles indiquent que GPC5 était un gène cible théorique de miR-217 (figure 4A) [24]. Pour prouver que miR-217 vise directement le GPC53'UTR, nous avons effectué des tests de gène rapporteur luciférase. Ectopique de miR-217 activité luciférase réduite dans le gène rapporteur de type sauvage GPC5 mais pas le mutant GPC5 3'UTR, indiquant que miR-217 vise directement la GPC5 3'UTR (figure 4B). Le niveau de GPC5 d'ARNm a été diminuée après transfection avec miR-217 imite et a augmenté après transfection avec miR-217 inhibiteur utilisant qRT-PCR (figure 4C). En accord avec ce résultat, la capacité de miR-217 pour réguler l'expression de la protéine GPC5 a été vérifiée par Western Blot (figure 4D).

Restauration de miR-217 inhibe la prolifération des cellules GC GPC5 médiation et l'invasion

surexpression de GPC5 a favorisé la prolifération des cellules GC et l'invasion. Lorsque miR-217 mimique et Pez-GPC5 ont été cotransfectés dans HGC-27 cellules, miR-217 expression réduit la prolifération et l'invasion (figure 5A et 5C) cellule GC induite GPC5. L'inhibition de GPC5 a réduit la prolifération des cellules GC et l'invasion. Lors de miR-217 inhibiteur et shGPC5 ont été cotransfectés dans des HGC-27 cellules, miR-217 inhibiteur a favorisé la prolifération cellulaire shGPC5 inhibée et l'invasion (figure 5B et 5D).

GPC5 est régulée positivement dans les lignes et les échantillons de cellules GC

L'expression de GPC5 était plus élevée dans les lignées cellulaires du GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) par rapport à GES-1, une ligne normale gastrique des cellules épithéliales (Fig 6A). Les niveaux de GPC5 de protéines étaient également plus élevés dans les tissus du GC que dans les tissus non cancéreux adjacents à l'aide de western blot (figure 6B).

Discussion

GC est responsable de près d'un million de décès dans le monde par an [25] . Récemment, accumulation de preuves a suggéré que les miARN jouent un rôle crucial dans la pathogenèse de GC par régulation de la prolifération cellulaire, l'apoptose, la migration, l'invasion annonces [26-28]. Dans cette étude, miR-217 a été fréquemment downregulated dans les lignes et les tissus cellulaires de GC humaines et le niveau inférieur de miR-217 a été associé à l'étape de pTNM du GC. D'autres expériences ont montré que la surexpression de miR-217 peut supprimer la migration des cellules GC et de l'invasion. GPC5 a été identifié comme une cible directe et fonctionnelle de miR-217. Nous concluons que miR-217 semble être un gène suppresseur de tumeur nouveau en GC et régulés à la baisse miR-217 peut contribuer au développement et à la progression de la tumeur chez les patients atteints de GC. La régulation négative de miR-217 est un événement fréquent dans divers cancers, suggérant son rôle important dans la tumorigenèse [17-19]. Li et ses collègues ont montré que miR-217 a été régulée à la baisse dans les cellules claires cellules rénales carcinome (ccRCC) par rapport aux tissus normaux appariés [29]. Niveau inférieur d'expression de miR-217 a été associé à grade tumoral supérieur et le stade. Dans cette étude, miR-217 a été fréquemment downregulated GC. Curieusement, les patients ayant une plus faible expression de miR-217 ont tendance à avoir le stade TNM plus avancé, ce qui suggère que la faible expression ofmiR-217was associés à la progression de la GC. D'autres études ont démontré que la surexpression de miR-217 supprimé l'invasion des cellules GC et la prolifération. Ensemble avec les résultats antérieurs, ces données suggèrent que miR-217might jouent un rôle crucial dans l'homéostasie tissulaire de GC et deregulatedmiR-217 pourrait contribuer au développement d'une néoplasie de l'estomac.

Pour étudier le mécanisme moléculaire du rôle de suppresseur de tumeur de miR-217 en GC, nous avons utilisé dosage rapporteur de la luciférase et western blot pour confirmer que GPC5 était une cible de miR-217 dans les cellules du GC. Pour confirmer la régulation directe de GPC5 par miR-217, nous avons utilisé GPC 3 'vecteur rapporteur UTR portant le miR-217 site de liaison potentiel dans le rapporteur fluorescent. En outre, qRT-PCR et analyse de western blot ont montré que la surexpression de miR-217 a inhibé l'expression GPC. Glypicans sont une famille de protéoglycanes qui sont liés à la surface exocytoplasmic de la membrane plasmique par l'intermédiaire d'une ancre glycosyl-phosphatidylinositol [30, 31]. Six glypicans ont été identifiés chez les mammifères (GPC1 à GPC6) [32, 33]. GPC5 est principalement exprimé dans le développement du système nerveux central, les membres, les reins, poumons et le foie [34, 35]. Des études récentes ont indiqué que certaines GPCs, surtout GPC3 andGPC5, pourrait jouer un rôle important dans la régulation de la progression du cancer [35, 36]. Par exemple, Zhang
et al. a montré que GPC5 a été fortement exprimé dans SACC-M (lignée cellulaire du poumon métastatique de haut) et dans des échantillons cliniques de carcinome adénoïde kystique salivaire (SACC) des cas avec métastases pulmonaires [36]. Le niveau d'expression global de GPC5 dans les cas cliniques de SACC avec métastases pulmonaires était plus élevé. Williamson et al. ont montré que les GPC5was de codage de gène amplifié dans 20% des patients atteints de rhabdomyosarcome alvéolaire (RMS) et que cette glypicane était surexprimé chez les patients RMS. En outre, la régulation de l'expression de GPC5 par siRNA inhibe le taux de cellules RMS de prolifération. Une autre étude a révélé que les niveaux élevés d'expression de GPC5 prédit pauvres des temps de survie postopératoires pour les patients atteints de CPNPC curative respectés, ce qui suggère la valeur de GPC5 comme un indicateur pronostique moléculaire [35, 37]. Dans notre étude, l'expression de GPC5 était plus élevée dans les lignées cellulaires du GC et les niveaux de GPC5 de protéines étaient également plus élevés dans les tissus du GC que dans les tissus non cancéreux adjacents. L'inhibition de GPC5 a réduit la prolifération des cellules GC et l'invasion. Restauration de miR-217 a inhibé la prolifération et l'invasion cellulaire de GC GPC5 médiée. Ces résultats ont démontré cet acte miR-217might comme un suppresseur de tumeur dans le cancer gastrique en ciblant GPC5.

En conclusion, la présente étude a démontré que miR-217was downregulated dans les tissus du GC et des lignées cellulaires. Les faibles niveaux d'expression de miR-217 ont été associés à l'étape pTNM des patients. L'expression ectopique de miR-217 a entraîné une inhibition de la prolifération cellulaire et l'invasion par GC. Une enquête plus poussée a révélé que GPC5 était une cible potentielle de miR-217. miR-217 peut servir comme un facteur prédictif du pronostic et une cible thérapeutique pour les patients du GC.

Informations complémentaires
Tableau S1. Résumé des paramètres clinicopathologiques des patients atteints de cancer gastrique
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125474.s001
(DOCX)
S2 Table. Primer séquence
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125474.s002
(DOCX)

• PLOS ONE: microARN-137 Contribue à antivibratoires tumorigenèse dans le cancer gastrique humain par ciblage AKT2
• PLOS ONE: Analyse de survie des patients atteints de dépistage du cancer Intervalle Subissant cancer gastrique par endoscopie