Plos ONE: V MicroRNA-217 Deluje kot potencialnega zaviralnih želodčnega raka z usmerjanjem GPC5

Povzetek

želodčnega raka (GC) je ena izmed najpogostejših malignih bolezni po vsem svetu. Emerging dokazi kažejo, da zmotne izražanje microRNAs (miRNAs) igra pomembno vlogo pri napredovanju raka. Vendar pa je malo znanega o potencialni vlogi miR-217 v PK. V tej študiji smo raziskovali vlogo miR-217 na GC celično proliferacijo in invazijo. Izraz miR-217 je navzdol urejena v GC celicah in človeških GC tkiv. Prisilna izraz miR-217 zaviral GC celic orožja in invazijo. Poleg tega glipikan-5 (GPC5), nova ocncogene, je bila opredeljena kot potencialni cilj miR-217. Poleg tega čezmernim miR-217 oslabljena-GPC5 povzroča spodbujanje širjenja in invazije v GC celicah. Skratka, te ugotovitve so pokazale, da miR-217 deloval kot zaviralnih in zaviral širjenju in vdor GC celic z usmerjanjem GPC5, ki bi lahko posledično služi kot terapevtsko tarčo za bolnike GC

Navedba. Wang H Dong X, Gu X, Qin R, Jia H, Gao J (2015) se MicroRNA-217 Deluje kot potencialnega zaviralnih želodčnega raka z usmerjanjem GPC5. PLoS ONE 10 (6): e0125474. doi: 10,1371 /journal.pone.0125474

Urednik: junij Li, Sun Yat-sen University Medical School, KITAJSKA

Prejeto: 10. oktober 2014; Sprejeto: 24. marec 2015; Objavljeno: 22. junij 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v papir in njene dodatne informacije datotek

financiranje:.. avtorji nimajo podpore ali sredstva za sporočanje

nasprotujočimi si interesi. avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je četrti najpogostejši človekovih malignosti in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka po vsem svetu, z ocenjenimi enega milijona novih primerov na leto [1-4]. Kljub nedavnim napredkom v diagnostične metode, kirurške tehnike in nove kemoterapijami, dolgoročno preživetje za GC je še vedno precej nizka [5, 6]. Pri mnogih bolnikih se GC diagnosticirali v zaključni fazi z obsežno invazijo in limfni metastaz. Uspešni terapevtske strategije so omejeni in umrljivost je visoka [7]. Zato je nujno, da razišče temeljne molekularne mehanizme, ki podpirajo odpornost na zdravila, histološki heterogenost in razvoj metastaz za prepoznavanje novih markerjev za diagnozo in zdravljenje za GC.

MicroRNAs (miRNAs) so majhne, ​​približno 22 -nucleotide, nekodiran RNA, ki delujejo kot negativni regulatorji kodirajo proteine ​​genov na posttranscriptional ravni [8, 9]. Ga vežejo na komplementarne sekvence v 3'-neprevedenih regije (3'-UTR) njihovih ciljnih mRNA, lahko miRNAs inducira neposredno degradacijo mRNA ali premočrtno zaviranje [10-13]. Vse več dokazov je pokazala, da so miRNAs sodeluje v številnih pomembnih bioloških procesih, vključno s celično proliferacijo, diferenciacijo, apoptoza, angiogenezo in imunskega odziva. Deregulacija miRNAs lahko privede do odklonskega izražanje genov v različnih boleznih, vključno z rakom želodca [14-16]. Vendar pa je razumevanje vloge in funkcije miRNAs v GC je še vedno v zgodnji fazi. Prav tako se vloge mnogih drugih odklonsko izraženih miRNAs v razvoju GC še niso znani.

downregulation miR-217 je pogost dogodek različnimi vrstami raka, kar kaže na njegovo pomembno vlogo pri tumorigeneze [17-19]. Vendar pa je malo znanega o potencialni vlogi miR-217 v PK. V tej študiji je bila ekspresija miR-217 zmanjšalo na celičnih linijah GC in tkivih. Poleg tega nižji izraz MIR-217was povezana s stopnjo pTNM. Čezmernim miR-217 zatreti GC celično invazijo in širjenje. Poleg tega luciferazo novinar test in western blot so potrdili, da miR-217might funkcijo kot supresorski tumorja v PK ga targetingGlypican-5 (GPC5).

Izjava Etika materiale in metode

Vsi bolniki so se dogovorili za sodelovanje v raziskavi, in dal pisno privolitev. Ta študija in soglasje je odobrila etična sveta zavoda odvisnih Yanan bolnišnici Kunming medicinske univerze in v skladu s Helsinško deklaracijo.

Vzorce tkiva

Vzorci človekovih GC tkiv in seznanjen -adjacent non-tumor želodca tkiva, ki so bili dlje kot 5 cm od tumorjev, smo pridobili od 50 bolnikov, ki so bili operirani resekcijo pri odvisnih Yanan bolnišnici Kunming Medical University. Sveži vzorci so bili snap zamrznjene inliquid dušik takoj po resekcijo in shranimo pri -80 ° C. Vsi vzorci so bili pridobljeni z privolitev bolnikov in so histološki potrdili z barvanjem z Hematoxylin-eozinom. Histološka razred raka je bila ocenjena v skladu z merili, ki jih določa Svetovna zdravstvena organizacija. Nihče od bolnikov pred operacijo prejela radioterapijo ali kemoterapijo. Značilnosti bolnikov so opisane v S1 tabeli.

Celične linije in celična kultura

Človekove želodca rakave celične linije SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 in en normalen želodca epitelnih celic linija GES-1 (kot je nadzor) so bile kupljene z inštituta za biokemijo in biologijo celice na kitajske akademije znanosti (Shanghai, Kitajska). SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 so se razmnožujejo v RPMI 1640 medija (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) in GES-1 je razširjati v mediju Dulbecco modificirana Eagle je (Invitrogen). Vsi mediji so bili dopolnjeni with10% fetalnega govejega seruma. Celične linije kultiviramo pri 37 ° C v vlažnem inkubatorju s 5% CO2.

ekstrakcijo RNA in QRT-PCR

Celotna RNA je bila ekstrahirana iz zamrznjenih vzorcev (ali celicami) z uporabo TRIzola ( Invitrogen), po vodniku proizvajalca. 1 ml RNA je bila uporabljena za merjenje izražanja miR-217 s kvantitativno RT-PCR (QRT-PCR) z TaqMan miRNA reverzna transkripcija kit andtheTaqMan miRNA testnimi specifične RT primerji za pokoj-217 v skladu z navodili proizvajalca (uporabno Biosystems, Foster City, CA). Izraz U6 uporabimo kot notranjo kontrolo. PCR v realnem času smo izvedli z 1 ml vsake cDNA na korak En Plus Real-Time PCR sistema (Applied Biosystems, Foster City, CA) v dvojnikov. Izraz miR-217 je bila določena na podlagi cikla praga (CT) in relativne stopnje izraženosti so bili izračunani as22 ^{- [(Ct miR-217) - (Ct od U6)] po normalizaciji s sklicevanjem na izraz U6 majhna jedrska RNA [20, 21] (S2 tabela).}

Western blot

Skupaj protein je bila vzeta iz zamrznjenih vzorcev (ali celice) z uporabo skupnih beljakovin ekstrakcijo Kit (keygen, Nanjing , Kitajska), v skladu z navodili proizvajalca. Merjenje koncentracije proteinov je bilo izvedeno z BCA Protein Analiza Kit (keygen) a. Western blot analizo smo izvedli kot je opisano predhodno [22]. Primarni protitelesa, ki se uporabljajo za Western Blot so zajec poliklonski anti-GPC5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija, ZDA), miška monoklonsko anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, ZDA).

Cell transfekciji

mIR-217 posnemajo, posnemajo nadzor (scramble), inhibitor miR-217, nadzor inhibitor, Pez-GPC5 in nadzor nad prenašalci so bili kupljeni od RiboBio (Guangzhou, Kitajska). Celice HGC-27 smo zasejali v šestih vdolbinami pri 30% konfluence en dan pred transfekcijo. Lipofectamine2000 (Invitrogen) je bil uporabljen za transfekcijo plazmida sam ali skupaj z RNA oligonukleotidi.

luciferazne teste

celice 8 x 10 ^{3 zasadimo v 96-vdolbinami. Po 24-hincubation, mešanica 100-ng pLUC-3'-UTR, 5-pmol negativna kontrola, miR-217mimic je kotransfektiramo s 20 ng Renilla v celice, ki uporabljajo Lipofectamine 2000. Štiriindvajset hoursafter transfekciji so Firefly in luciferazne aktivnosti Renilla merjeno z Dual-luciferaza sistema Reporter (Promega, Madison, WI, ZDA). Učinkovitost transfekciji je normaliziralo do kotransfekcijo z Renilla novinar vektor.}

Cell širjenje

Cells (3000 /dobro), so bili zbrani in zasejanih v 96-wellplates in inkubiranih pri 37 ° C po transfekciji. Po inkubaciji 1 do 5 dni, da dodamo mediji vsako vdolbino 10% celic Štetje Komplet 8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japonska), in plošče nadalje inkubiramo še 3 ure pri 37 ° C. Nato smo medij zamenjali z 150 ml dimetilsulfoksida (DMSO; Sigma-Aldrich) in absorbanco smo izmerili pri 450 nm ob uporabi mikroploščnem čitalniku (Sunrise). Preizkus smo ponovili 3-krat s šestimi ponovitvami.

Northern blot

Celotno RNA smo izolirali iz vsakega tkiva s pomočjo TRIzola reagenta (Invitrogen Life Technologies) in Northern blot smo izvedli kot prejšnja [23] opisano . Po popoln Hyb Plus hibridizacije pri 68 ° C, so bili razviti in analizirati membrane. Northern blots hibridizirali s 18S ribosomske RNA z (rRNA) cDNA smo uporabili kot kontrolno skupino.

Cell invazije

Invazija teste smo izvedli v treh izvodih z uporabo Transwell invazijo komore prevlečene z Matrigel (BD, ZDA) opisane v protokolu proizvajalca. Celice smo transficirali withmiR-217 posnema, inhibitor ali negativno kontrolo oligonukleotid, kultivirani 48 ur, in prenese na vrhu Študiie prevlečenih invazijo komor v DMEM brez seruma (1 x 10 ^{5 celic na Transwell). DMEM, ki vsebuje 10% fetalni telečji serum dodamo k nižjim komorah. Po inkubaciji 24 ur, celice, ki so ostale na vrhu filtra smo očistili off in celice, ki prešli na spodnji površini so bile določene in90% alkohola, čemur sledi kristal vijoličnim madež.}

Histologija

histološki diagnoza je bila glede na triple-site metodi želodca biopsijo. Tkiva so bili čez noč določene v zastalega formalinom, vgrajeni v parafin, narezana na debelino 3-um, in obarvali s hematoksilin-eozinom (H & E). Barvanja

Statistična analiza

Statistične analize so bile izvedene uporabo SPSS 17,0 statistični programski paket. Poskuse smo ponovili samostojno vsaj trikrat, in podatki, predstavljeni kot ± SD. Povezava med miR-217 in GPC5 smo analizirali s testom primerjalno Spearman je. Primerjave med skupinami za statistične značilnosti so bile izvedene s Študentske seznanjeno dva repa t-testu ali One-way ANOVA. P < 0.05 se je štelo kot statistično značilne.

Rezultat

Izraz miR-217 je navzdol reguliranih v celičnih linijah GC

smo najprej količinsko nivoja izražanja miR-217 v štirih humane celične linije GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) in GES-1 uporabljajo northern blot (slika 1A). Nivo izražanja miR-217 wasdecreased v celičnih linijah GC primerjavi z GES-1. QuantitativeRT-PCR je tudi pokazala, da je bil izraz miR-217 se je v celičnih linijah GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) v primerjavi z ges-1, normalno v želodcu celične linije epitelijskih (slika 1B ).

MIR-217 je navzdol reguliranih v GC tkivih

Kvantitativne RT-PCR je bila uporabljena preučiti miR-217 izraz v 50 GC tkivih in njihovih seznanjenih sosednjih noncancerous tkiv. Reprezentativne histološke značilnosti GC in njegovih parnih sosednjih noncancerous tkiv so bili prikazani na sliki 2A. Med 50 tumorskih tkivih, 44 primerov razstavljena zmanjšala miR-217 izraza v primerjavi s sosednjimi normalnih tkivih (88%, 44 od 50, slika 2b). Izraz miR-217 je bil v GC tkivih nižja kot v sosednjih noncancerous tkiva (slika 2C). Poleg tega, nižje ravni miR-217 izražanja povezana s stopnjo pTNM bolnikov GC (slika 2D).

miR-217 inhibira proliferacijo GC celic ter invazija

Izraz MIR-217was povečala v transficirane HGC-27 celice s pomočjo miR-217 posnema (slika 3a) in zmanjšala uporabo miR-217 inhibitor (slika 3B). Širjenje se je zmanjšala v celicah HGC-27 transfekciji withmiR-217 posnema v primerjavi s celicami transfekciji s žoga ali neobdelano (slika 3C). Medtem se je širjenje v HGC-27 celic transfekciji withmiR-217inhibitor povečala v primerjavi s celicami transfekciji z regulacijo ali neobdelano (slika 3D). Invazivnosti celic transfekciji z miR-217 posnema so se v primerjavi s skupino celic scramble skupine ali nadzora in miR-217 inhibitor invazije povečana celic v primerjavi s celicami v skupini scramble skupine ali nadzora (slika 3e).

miR -217 posttranscriptional zmanjšuje GPC5 izraz, ki je usmerjena neposredno njegovi 3'UTR

Analiza uporabljajo voljo algoritmi, je pokazala, da je bil GPC5 teoretično ciljni gen miR-217 (slika 4A) [24]. Dokazati, da miR-217 neposredno usmerjeni v GPC53'UTR, smo izvedli luciferazo reporterski gen testov. Zunajmaternična miR-217 znižani luciferazne aktivnosti v genu GPC5 reporter divjega tipa, vendar ne mutant GPC5 3'UTR, kar kaže, da miR-217 neposredno usmerjeni v GPC5 3'UTR (slika 4B). Raven mRNA GPC5 je po transfekciji z miR-217 posnema zmanjšal in povečal po transfekciji z miR-217 zaviralec uporabo QRT-PCR (slika 4C). V skladu s tem rezultatom, je bila sposobnost miR-217 za regulacijo ekspresije GPC5 beljakovin preveri z metodo Western blot (slika 4D).

Obnova miR-217 inhibira GPC5 posredovano GC celično proliferacijo in invazijo

Čezmerno GPC5 spodbuja proliferacijo z GC celic in invazijo. Ko so miR-217 posnemajo in pez-GPC5 kotransfektiramo v HGC-27 celic, miR-217 izraz zmanjšala GC celično proliferacijo in invazijo (slika 5A in 5C)-GPC5 povzroča. Zaviranje GPC5 zmanjša proliferacijo z GC celic in invazijo. Ko so miR-217 inhibitor in shGPC5 kotransfektiramo v 27 HGC celic, MIR-217 zaviralec spodbuja proliferacijo v shGPC5 zaviral celic in napad (slika 5B in 5D).

GPC5 je povečana pri celičnih linijah GC in primerkov

izraz GPC5 je bila višja v celičnih linijah GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) v primerjavi z GES-1, normalna želodca celična linija epitelijskih (slika 6A). Ravni proteinske GPC5 so bile višje tudi v GC tkivih kot v sosednjih noncancerous tkivih, ki uporabljajo Western Blot (slika 6B).

Pogovor

GC povzroča skoraj milijon smrti po vsem svetu na leto [25] . V zadnjem času se zbirajo dokazi kažejo, da miRNAs igrajo ključno vlogo pri patogenezi GC z regulacijo proliferacije celic, apoptozo, migracije, oglasi invazijo [26-28]. V tej študiji je bila miR-217 pogosto navzdol reguliranih človeških GC celičnih linijah in tkivih in nižje ravni miR-217 je bila povezana s stopnjo pTNM GC. Nadaljnji poskusi so pokazali, da lahko prekomerno miR-217 zavirajo migracijo GC celic in invazijo. GPC5 je bila opredeljena kot neposreden in funkcionalno cilj miR-217. Sklepamo, da se zdi, da je roman zaviralnih v GC in navzdol reguliranih miR-217 lahko prispevajo k razvoju in napredovanje tumorjev pri bolnikih GC miR-217. Downregulation miR-217 je pogost dogodek različnimi vrstami raka, kar kaže na njegovo pomembno vlogo pri tumorigeneze [17-19]. Li in njegovi kolegi so pokazali, da je bila miR-217 navzdol urejeno v jasno celic ledvičnih celic karcinoma (ccRCC) v primerjavi s seznanjeno normalnega tkiva [29]. Nižja stopnja izražanja miR-217 je bila povezana z višjo stopnjo tumorja in fazo. V tej študiji je bila miR-217 pogosto navzdol reguliranih v GC. Zanimivo, pri bolnikih z nižjo izražanja miR-217 nagibanje k bolj visoko stopnjo TNM, kar kaže, da je nizka izraz ofmiR-217was povezana z napredovanjem GC. Nadaljnje raziskave so pokazale, da je čezmerno miR-217 zatreti GC celični invaziji in orožja. Skupaj s prejšnjimi rezultati, ti podatki kažejo, da miR-217might igrajo ključno vlogo pri GC tkiva homeostaze in deregulatedmiR-217 bi lahko prispevala k razvoju a želodčne novotvorb.

Da bi raziskali molekularni mehanizem vlogo zaviralnih miR-217 v PK, smo uporabili luciferazo novinar testa in Western blot za potrditev, da GPC5 bil tarča miR-217 v GC celicah. Za potrditev neposredne ureditev GPC5 z miR-217, smo uporabili GPC 3 'UTR reporterski vektor nosi potencialno miR-217 vezavno mesto v fluorescentno reporterja. Poleg tega QRT-PCR in western blot test je pokazal, da prekomerno miR-217 zaviral GPC izraz. Glypicans so družina proteoglikanov, ki so povezani s exocytoplasmic površini plazemske membrane preko glikozil fosfatidilinozitol zasidrana v [30, 31]. Šest glypicans so bile ugotovljene v sesalcev (GPC1 do GPC6) [32, 33]. GPC5 se izraža predvsem v razvoj centralnega živčnega sistema, okončin, ledvic, pljuč in jeter [34, 35]. Nedavne študije so pokazale, da so nekateri GPCs, predvsem GPC3 andGPC5, lahko igrajo pomembno vlogo pri uravnavanju napredovanje raka [35, 36]. Na primer Zhang
sod. pokazala, da je GPC5 zelo izražene v SACC-M (visoko pljuč zasevkov celična linija) in v kliničnih vzorcih sline Adenoid cistični karcinom (SACC) primerih s pljučnim metastaz [36]. Splošna raven izraz GPC5 v kliničnih primerih SACC s pljučnim metastaz je bila višja. Williamson et al. so pokazali, da gen, ki kodira GPC5was pomnožili v 20% bolnikov z alveolarne rabdomiosarcomom (RMS), in da je ta glipikan so izraženi pri bolnikih RMS. Poleg tega, navzdol ureditev GPC5 izražanja siRNA zaviral stopnjo proliferacije RMS celic. Druga študija je pokazala, da visoka raven GPC5 izražanja napovedali slabe postoperativnih časa preživetja za kurativno spoštovati bolnikov z nedrobnoceličnim rakom pljuč, kar kaže vrednost GPC5 kot prognostični kazalec molekularno [35, 37]. V naši raziskavi, je bil izraz GPC5 višja v celičnih linijah GC in vsebnosti beljakovin v GPC5 so bili tudi v GC tkivih višja kot v sosednjih noncancerous tkivih. Zaviranje GPC5 zmanjša proliferacijo z GC celic in invazijo. Obnova miR-217 zaviral-GPC5 posredovano GC celično proliferacijo in invazijo. Ti rezultati pokazali, da miR-217might deluje kot supresorski tumorjev pri raku želodca z osredotočenjem GPC5.

Skratka, ta študija je pokazala, da je pokoj-217was navzdol reguliranih v GC tkiv in celičnih linij. Nizke stopnje miR-217 izražanja so bile povezane z pTNM fazi bolnikov. Zunajmaternična miR-217 izraz povzročilo inhibicijo GC celično proliferacijo in invazijo. Nadaljnja preiskava je pokazala, da je bil GPC5 potencialna tarča miR-217. miR-217 lahko služi kot napovedovalec za prognozo in terapevtske tarče za bolnike GC.

Podpora Informacije
S1 tabelo. Povzetek clinicopathological parametrov pri bolnikih z rakom želodca
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125474.s001
(DOCX)
S2 tabeli. Primer zaporedja
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125474.s002
(DOCX)

• Plos ONE: MicroRNA-137 Prispeva k zavirala tumorigeneze v humani želodca raka, ki ga ciljanje Akt2
• Plos ONE: Preživetje Analiza bolnikov z Interval Rak z želodčnim Cancer Screening endoskopsko