PLoS ONE: De MicroRNA-217 Functies als een potentiële tumor suppressor bij maagkanker door zich te richten GPC5

Abstract

Maagkanker (GC) is één van de meest voorkomende maligniteiten wereldwijd. Opkomende bewijs is dat de afwijkende expressie van microRNAs getoond (miRNAs) speelt een belangrijke rol in de progressie van kanker. Er is echter weinig bekend over de mogelijke rol van miR-217 in GC. In deze studie hebben we de rol van miR-217 op de proliferatie en invasie GC cel. De expressie van miR-217 werd down-gereguleerd in GC cellen en menselijke GC weefsels. Gedwongen expressie van miR-217 remde GC cellen proliferatie en invasie. Bovendien glypican-5 (GPC5), een nieuwe ocncogene, werd geïdentificeerd als potentieel doel van miR-217. Bovendien overexpressie van miR-217 verminderde GPC5-geïnduceerde stimulering van proliferatie en de invasie in GC cellen. Samenvattend, deze bevindingen bleek dat miR-217 dienst als tumor suppressor en remde de proliferatie en invasie van cellen door GC gericht GPC5, die vervolgens kan dienen als een therapeutisch doelwit voor GC patiënten

Citation:. Wang H , Dong X, Gu X, Qin R, Jia H, Gao J (2015) De MicroRNA-217 Functies als een potentiële tumor suppressor bij maagkanker door zich te richten GPC5. PLoS ONE 10 (6): e0125474. doi: 10.1371 /journal.pone.0125474

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, CHINA

Ontvangen: 10 oktober 2014; Aanvaard: 24 maart 2015; Gepubliceerd: 22 juni 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de ondersteunende informatie bestanden

financiering:.. de auteurs hebben geen steun of financiering aan te melden

Competing belangen. de auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is de vierde meest voorkomende menselijke maligniteiten en de tweede belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd, met naar schatting een miljoen nieuwe gevallen per jaar [1-4]. Ondanks de recente vooruitgang in de diagnostische methode, chirurgische techniek en de nieuwe chemotherapie, de lange-termijn overleving tarief voor GC is nog steeds vrij laag [5, 6]. Bij veel patiënten wordt GC gediagnosticeerd in een vergevorderd stadium met uitgebreide invasie en lymfatische metastase. Succesvolle therapeutische strategieën zijn beperkt en het sterftecijfer is hoog [7]. Daarom is het dringend noodzakelijk om de fundamentele moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de resistentie tegen geneesmiddelen, histologische heterogeniteit, en de ontwikkeling van metastase om nieuwe markers voor de diagnose en de behandeling van GC identificeren onderzoeken.

MicroRNAs (miRNAs) zijn klein, ongeveer 22 -nucleotide, niet-coderende RNA's die als negatieve regulatoren van eiwit-coderende genen op het post-transcriptionele niveau functioneren [8, 9]. Door binding aan de complementaire sequenties in de 3'-ongetranslateerde gebieden (3'-UTR) van het doelwit mRNA, kan miRNAs direct mRNA afbraak of translationele remming [10-13] induceren. Toenemend bewijs heeft aangegeven dat miRNAs zijn betrokken bij veel belangrijke biologische processen, waaronder proliferatie, differentiatie, apoptose, angiogenese en immuunrespons. Deregulering van miRNAs kan leiden tot afwijkende genexpressie in verschillende ziekten, waaronder maagkanker [14-16]. Echter, het begrip van de rol en functie van miRNAs in de GC is nog in een vroeg stadium. Ook de rol van veel andere afwijkende expressie miRNAs in GC ontwikkeling nog onbekend.

negatieve regulatie van miR-217 is een frequente gebeurtenis bij verschillende kankersoorten, suggereert een belangrijke rol bij het ontstaan ​​van tumoren [17-19]. Er is echter weinig bekend over de mogelijke rol van miR-217 in GC. In dit onderzoek werd de expressie van miR-217 werd afgenomen GC cellijnen en weefsels. Bovendien is de lagere expressie van miR-217was geassocieerd met pTNM podium. Overexpressie van miR-217 onderdrukt GC cel invasie en proliferatie. Bovendien luciferase reporter assay en Western blot bevestigde dat miR-217might functioneren als een tumor suppressor in GC door targetingGlypican-5 (GPC5).

Materialen en methoden

Ethics Verklaring

Alle patiënten ingestemd met deelname aan het onderzoek en gaven schriftelijk informed consent. Deze studie en toestemming werd goedgekeurd door de ethische raad van bestuur van het instituut van de aangesloten Yanan ziekenhuis van Kunming Medical University en nageleefd Verklaring van Helsinki.

weefselmonsters

Monsters van menselijke weefsels en GC gepaarde -adjacent non-tumor maag weefsels die verder dan 5 cm van de tumoren waren werden verkregen van 50 patiënten die een operatie resectie ondergingen bij het The Affiliated Yanan ziekenhuis van Kunming Medical University. Verse monsters werden snel bevroren inliquid stikstof direct na resectie en bewaard bij -80 ° C. Alle monsters werden verkregen met informed consent van patiënten en werden histologisch bevestigd door kleuring met hematoxyline-eosine. De histologische graad van kanker werd vastgesteld op basis van criteria die door de World Health Organization. Geen van de patiënten ontvangen radiotherapie of chemotherapie voor de operatie. De kenmerken van patiënten worden beschreven in Tabel S1.

Cellijnen en celkweek

Human maagkanker cellijnen SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 en een normaal maag epitheel cellijn GES-1 (controle) werden gekocht van het Instituut voor Biochemie en Celbiologie aan de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China). SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 werden gekweekt in RPMI 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en GES-1 werd gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (Invitrogen). Alle media werden aangevuld bij 10% foetaal runderserum. Cellijnen werden gekweekt bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.

RNA-extractie en qRT-PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit bevroren monsters (of cellen) met behulp van Trizol ( Invitrogen) volgens handleiding van de fabrikant. 1 ml van RNA werd gebruikt voor de expressie van miR-217 gemeten door kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR) met de TaqMan miRNA reverse transcriptie kit andtheTaqMan miRNA assay-specifieke RT-primers voor miR-217 volgens de instructies van de fabrikant (Applied Biosystems, Foster City, CA). De expressie van U6 werd gebruikt als interne controle. Real-time PCR werd uitgevoerd met 1 ml van elk cDNA op Step One Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) in duplo. De expressie van miR-217 werd bepaald op basis van de drempel cyclus (Ct), en de relatieve expressie niveaus werden berekend as22 ^{- [(Ct van miR-217) - (Ct van U6)] na normalisatie met betrekking tot expressie van U6 kleine nucleaire RNA [20, 21] (S2 Table).}

Western blot

Totaal eiwit werd geëxtraheerd uit bevroren exemplaren (of cellen) met behulp van een Total Protein Extraction Kit (KeyGen, Nanjing , China) volgens de instructies van de fabrikant. Meting van eiwitconcentratie werd uitgevoerd met een BCA Protein Assay Kit (KeyGen). Western blot analyse werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [22]. De primaire antilichamen gebruikt voor western blot waren konijn polyklonaal anti-GPC5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), muizen monoklonaal anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

Cell transfectie

De miR-217 na te bootsen, na te bootsen controle (door elkaar), miR-217-remmer, remmer controle, PEZ-GPC5 en controle vector werden gekocht bij RiboBio (Guangzhou, China). De HGC-27 cellen werden gezaaid in zes-well platen bij 30% confluentie één dag voor transfectie. Lipofectamine2000 (Invitrogen) werd gebruikt voor transfectie van plasmide alleen of tezamen met RNA oligonucleotiden.

Luciferasebepalingen

cellen van 8 x 10 ^{3 werden uitgeplaat in 96-well platen. Na 24-hincubation, een mengsel van 100-ng pLUC-3'-UTR, 5-pmol negatieve controle, miR-217mimic gecotransfecteerd met 20 ng Renilla in cellen met behulp van Lipofectamine 2000 Vierentwintig hoursafter transfectie vuurvlieg en Renilla luciferase activiteiten gemeten met een Dual-Luciferase Reporter System (Promega, Madison, WI, USA). De transfectie-efficiëntie werd genormaliseerd door co-transfectie met Renilla reporter vector.}

celproliferatie

Cells (3000 /putje) werden verzameld en gezaaid in 96-wellplates en geïncubeerd bij 37 ° C na transfectie. Na incubatie gedurende 1-5 dagen, aan het medium van elk putje werd toegevoegd 10% Cell Counting Kit-8 (CCK-8, DOJINDO, Kumamoto, Japan), en de platen werden verder geïncubeerd gedurende nog 3 uur bij 37 ° C. Vervolgens werd het medium vervangen door 150 ml dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich), en de absorptie werd gemeten bij 450 nm met een microplaat reader (Sunrise). De test werd 3 keer herhaald met zesvoud.

Northern blot

Totaal RNA werd geïsoleerd uit elk weefsel met behulp van TRIzol reagens (Invitrogen Life Technologies) en Northern blotting werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [23] . Na Perfect Hyb Plus hybridisatie bij 68 ° C werden membranen ontwikkeld en geanalyseerd. Northern blots gehybridiseerd met een 18S ribosomaal RNA (rRNA) cDNA werden als controles.

celinvasie

Invasion werden uitgevoerd in triplo middels invasie Transwell kamers bekleed met Matrigel (BD, USA) als beschreven in het protocol van de fabrikant. Cellen werden getransfecteerd withmiR-217 bootst, remmer of negatieve controle oligonucleotide, gekweekt gedurende 48 uur, en overgebracht op de top van Matrigel-beklede invasie kamers in serumvrij DMEM (1 x 10 ^{5 cellen per Transwell). DMEM met 10% foetaal kalfserum werd toegevoegd aan de onderste kamers toegevoegd. Na incubatie gedurende 24 uur, cellen die overbleven op de bovenkant van het filter werden gewassen en uit cellen die gemigreerd naar het onderoppervlak vastgesteld in90% alcohol gevolgd door kristalviolet kleuring.}

Histologie

Histologische diagnose volgens de drievoudige ter gastrische biopsie methode. Weefsels werden overnacht gefixeerd in gebufferde formaline, ingebed in paraffine, gesneden tot 3 urn dik, en gekleurd met hematoxyline-eosine (H &E). Kleuring

Statistische analyse

Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van de SPSS 17.0 statistische software pakket. Experimenten werden onafhankelijk tenminste drie maal herhaald en de gegevens weergegeven als gemiddelde ± SD. De associatie tussen miR-217 en GPC5 werd geanalyseerd met behulp van Spearman correlatie te testen. Vergelijkingen tussen de groepen voor statistische significantie werden uitgevoerd met de Student's gepaarde tweezijdige t-test of One-way ANOVA. P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

Resultaat

De expressie van miR-217 wordt neerwaarts gereguleerd in GC cellijnen

We allereerst gekwantificeerd de expressie van miR-217 in vier GC humane cellijnen (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) en GES-1 middels Northern blotting (figuur 1A). Het expressieniveau van miR-217 wasdecreased GC cellijnen tegenover GES-1. QuantitativeRT-PCR toonde ook aan dat de expressie van miR-217 werd afgenomen GC cellijnen (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) in vergelijking met GES-1, een normale gastrische epitheel cellijn (Fig 1B ).

miR-217 wordt neerwaarts gereguleerd in GC weefsels

Kwantitatieve RT-PCR werd gebruikt voor miR-217 expressie in 50 GC weefsels en hun gepaarde aangrenzende goedaardige weefsels onderzocht. De representatieve histologische kenmerken van GC en de gepaarde aangrenzende goedaardige weefsels worden getoond in figuur 2A. Onder 50 tumorweefsels, 44 gevallen vertoonden verlaagde miR-217 expressie in vergelijking met de aangrenzende normale weefsels (88%, 44 of 50, figuur 2B). De expressie van miR-217 was lager in GC weefsels dan in aangrenzende goedaardige weefsels (figuur 2C). Bovendien, lagere niveaus van miR-217 expressie in verband met de pTNM fase van GC patiënten (figuur 2D).

miR-217 remt proliferatie en GC cel invasie

De expressie van miR-217was toegenomen in getransfecteerde HGC-27 cellen met behulp miR-217 bootst (figuur 3A) en verminderde gebruik miR-217 remmer (figuur 3B). De proliferatie werd gereduceerd in de HGC-27 cellen getransfecteerd withmiR-217 bootst vergeleken met cellen getransfecteerd met scramble of onbehandelde (figuur 3C). Ondertussen, werd de proliferatie verhoogd HGC-27 cellen getransfecteerd withmiR-217inhibitor vergeleken met cellen getransfecteerd met controle of onbehandeld (figuur 3D). Het invasieve karakter van cellen die met miR-217 bootst was gedaald in vergelijking met de scramble groep of controlegroep cellen en miR-217-remmer verhoogde cel invasie in vergelijking met het scramble groep of controlegroep cellen (figuur 3E).

miR -217 posttranscriptionele vermindert GPC5 expressie door direct gericht zijn 3'UTR

Analyse middels beschikbare algoritmen aangegeven dat GPC5 een theoretische doelgen van miR-217 (figuur 4A) [24]. Om te bewijzen dat miR-217 direct gericht de GPC53'UTR, voerden wij luciferasereportergen assays. Ectopische van miR-217 verminderde luciferase activiteit in de GPC5 wild-type reporter gen, maar niet de mutant GPC5 3'UTR, wat aangeeft dat miR-217 rechtstreeks gericht de GPC5 3'UTR (figuur 4B). Het mRNA niveau van GPC5 werd afgenomen na transfectie met miR-217 bootst en toegenomen na transfectie met miR-217 remmer met behulp qRT-PCR (Figuur 4C). Consistent met dit resultaat, het vermogen van miR-217 om de expressie van het eiwit reguleren GPC5 werd geverifieerd door western blotting (Figuur 4D).

Herstel van miR-217 remt GPC5 GC gemedieerde celproliferatie en invasie

Overexpressie van GPC5 bevorderde de proliferatie en invasie GC cel. Wanneer miR-217 na te bootsen en PEZ-GPC5 werden gecotransfecteerd in HGC-27 cellen, miR-217 expressie verminderde de-GPC5 geïnduceerde GC cel proliferatie en invasie (Fig 5A en 5C). Remming van GPC5 verminderde de proliferatie en invasie GC cel. Wanneer miR-217-remmer en shGPC5 werden gecotransfecteerd in HGC-27 cellen, miR-217 remmer bevorderde de shGPC5-remde proliferatie en invasie cel (figuur 5B en 5D).

GPC5 wordt opgereguleerd in GC cellijnen en specimens

De expressie van GPC5 hoger GC cellijnen (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) in vergelijking met GES-1, een normale gastrische epitheel cellijn (figuur 6A). Het eiwit niveaus van GPC5 waren ook hoger in GC weefsels dan die in aangrenzende goedaardige weefsels met behulp van western blot (figuur 6B).

Discussie

GC veroorzaakt bijna een miljoen doden wereldwijd per jaar [25] . Recentelijk is een groeiend aantal aanwijzingen gesuggereerd dat miRNAs een cruciale rol in de pathogenese van GC spelen via reguleren celproliferatie, apoptose, migratie, invasie laten zien [26-28]. In deze studie werd miR-217 vaak neerwaarts gereguleerd in menselijke GC cellijnen en weefsels en het lagere niveau van miR-217 werd geassocieerd met pTNM fase van GC. Verdere experimenten toonden aan dat overexpressie van miR-217 GC celmigratie en invasie kunnen onderdrukken. GPC5 werd geïdentificeerd als een directe en functionele doel van miR-217. Wij concluderen dat miR-217 lijkt een nieuwe tumor suppressor in GC en gedownreguleerd miR-217 kan bijdragen aan tumorontwikkeling en progressie GC patiënten. Downregulatie van miR-217 is een veel voorkomende gebeurtenis in verschillende soorten kanker, alles wijst erop dat belangrijke rol bij het ontstaan ​​van tumoren [17-19]. Li en zijn collega's toonden aan dat miR-217 werd down-gereguleerd in clear cell niercelcarcinoom (CCRCC) in vergelijking met gepaarde normaal weefsel [29]. Lagere miR-217 expressie werd geassocieerd met een hogere tumor rang en podium. In deze studie werd miR-217 veelvuldig downregulated in GC. Intrigerend patiënten met een lagere expressie van miR-217 de neiging om meer geavanceerde TNM stadium hebben, wat erop wijst dat lage expressie ofmiR-217was geassocieerd met GC progressie. Verdere studies toonden aan dat overexpressie van miR-217 GC onderdrukt invasie en proliferatie. Overzicht van eerdere resultaten, suggereren deze gegevens dat miR-217might een cruciale rol in GC weefsel homeostase en deregulatedmiR-217 kan bijdragen aan de ontwikkeling van een maag neoplasie spelen.

Om het moleculaire mechanisme van de tumor suppressor functie onderzoeken van miR-217 in GC, gebruikten we luciferase reporter assay en western blot om te bevestigen dat GPC5 was een doelwit van miR-217 in GC cellen. Om de directe regulering van GPC5 door miR-217 te bevestigen, gebruikten we GPC 3 'UTR reporter vector die het potentieel miR-217 bindingsplaats in de tl-reporter. Bovendien qRT-PCR en western blot analyse toonde aan dat overexpressie van miR-217 remde GPC expressie. Glypicans zijn een familie van proteoglycanen die gekoppeld zijn aan de exocytoplasmic oppervlak van het plasmamembraan via een glycosyl fosfatidylinositol anchor [30, 31]. Zes glypicans zijn geïdentificeerd in zoogdieren (GPC1 tot GPC6) [32, 33]. GPC5 voornamelijk in ontwikkelingslanden centraal zenuwstelsel, ledematen, nier, long en lever [34, 35]. Recente studies hebben aangetoond dat bepaalde GPC, vooral GPC3 andGPC5, kan een belangrijke rol in het reguleren de progressie van kanker [35, 36] spelen. Bijvoorbeeld, Zhang
et al. bleek dat GPC5 was sterk tot expressie gebracht in SACC-M (high long-metastatische cellijn) en in klinische monsters van speeksel adenoid cystische carcinoom (SACC) gevallen longmetastasen [36]. Het totale expressie niveau van GPC5 in klinische gevallen van SACC met longkanker metastase was hoger. Williamson et al. toonde aan dat het gen dat codeert GPC5was geamplificeerd in 20% van de patiënten met alveolaire rhabdomyosarcoom (RMS) en dat glypican werd overexpressie in RMS patiënten. Bovendien, down-regulatie van GPC5 expressie door siRNA remde de proliferatie snelheid van de RMS-cellen. Een andere studie vond dat hoge niveaus van expressie GPC5 voorspelde slechte postoperatieve overleving voor curatief gerespecteerd NSCLC patiënten, wat suggereert dat de waarde van GPC5 als moleculaire prognostische indicator [35, 37]. In onze studie was de expressie van GPC5 hoger in GC cellijnen en de eiwitniveaus van GPC5 waren ook hoger in GC weefsels dan in aangrenzende goedaardige weefsels. Remming van GPC5 verminderde de proliferatie en invasie GC cel. Restauratie van miR-217 remde-GPC5 gemedieerde GC cel proliferatie en invasie. Deze resultaten toonden aan dat miR-217might fungeren als een tumor suppressor bij maagkanker doelwit GPC5.

Kortom, de onderhavige studie toonde aan dat miR-217was downregulated GC weefsels en cellijnen. Lage niveaus van miR-217 expressie werden geassocieerd met pTNM fase van patiënten. Ectopische expressie miR-217 resulteerde in remming van proliferatie en invasie GC cel. Nader onderzoek wees uit dat GPC5 was een potentieel doelwit van miR-217. miR-217 kan dienen als een voorspeller voor de prognose en een therapeutisch doel voor GC patiënten.

Ondersteunende informatie
S1 Table. Samenvatting van de klinisch-pathologische parameters van de patiënten met maagkanker
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125474.s001
(docx)
S2 Table. Primersequentie
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125474.s002
(DOCX)

• PLoS ONE: MicroRNA-137 Draagt ​​bij aan Gedempte tumorvorming bij Human MaagKanker door zich te richten AKT2
• PLoS ONE: Survival analyse van patiënten met screeningsinterval Cancer ondergaan maagkanker door Endoscopie