PLOS ONE: Interleucina 17A Promove câncer gástrico Invasividade via NF-kB mediada metaloproteinases 2 e 9 Expression

Abstract

A interleucina 17A (IL-17A), como uma citocina pró-inflamatória, está envolvido na patologia da doenças inflamatórias e microambiente do tumor. O objetivo deste estudo é investigar o efeito de IL-17A sobre a invasão de câncer gástrico (GC). No estudo, verificou-se que a IL-17A poderia promover a migração e invasão de células de GC. Além disso, depois de tratamento com a IL-17A, as expressões e actividades de metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) e MMP-9 foram regulados positivamente, enquanto que as expressões de TIMP-1 e TIMP-2 foram regulados negativamente. Além disso, as fracções nucleares /total de p65 e p50 foram significativamente elevados pela IL-17A. O pré-tratamento com helenalina, um inibidor de factor nuclear-kB (NF-kB), foi provado para abolir o efeito promotor de IL-17A sobre a capacidade de invasão de células de GC e a regulação positiva de MMP-2 e MMP-9. Em conclusão, os nossos resultados ilustraram que IL-17A pode promover a invasão de células GC por activar o NF-kB via, e subsequentemente hiperregular a expressão de MMP-2 e MMP-9. Estes resultados podem levar à identificação de novos marcadores de diagnóstico e alvos terapêuticos de GC

citação:. Y Wang, Wu H, Wu X, Bian Z, Q Gao (2014) Interleucina 17A Promove cancro gástrico Invasividade via NF -κB mediada metaloproteinases 2 e 9 expressão. PLoS ONE 9 (6): e96678. doi: 10.1371 /journal.pone.0096678

editor: Nikos K. Karamanos, University of Patras, Grécia |

Recebido: 26 de novembro de 2013; Aceito: 11 de abril de 2014; Publicação: 06 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O projeto foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 81.070.536) e Juventude Fundos científico do Hospital Central de Taian (2011ZRQNO35). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Como uma das principais causas de morte relacionada ao câncer em todo o mundo, GC é responsável por mais de 700.000 mortes por ano [1]. É o segundo câncer mais comum ea terceira principal causa de morte entre pacientes com câncer na China [2]. A invasão e metástase potente capacidade de GC é um dos factores importantes que conduzem ao mau prognóstico [3]. Portanto, é importante para descobrir os mecanismos subjacentes, para identificar novos alvos terapêuticos moleculares que regulam habilidades invasão de células GC, e, assim, desenvolver o avanço tratamentos para GC.

IL-17A é o membro fundador da IL -17 família que varia de IL-17A a IL-17F [4] - [8]. IL-17 membros da família desempenham um papel activo em várias doenças, tais como doenças auto-imunes, doenças inflamatórias e doenças malignas. A inflamação persistente tem sido considerada para ser correlacionado com o aumento do risco de GC [9]. passos iniciais na carcinogênese gástrica envolvem Helicobacter pylori
(H. pylori) infecção levando a gastrite crónica atrófica e com a produção de mediadores pró-inflamatórios [10] - [13], como a IL-1b, TNF, IFN-y, IL-6 e IL-8. No entanto, o papel da IL-17A no cancro era inconsistente de acordo com relatórios anteriores. Algumas evidências revelou que a IL-17A pode promover o crescimento do tumor, estimulando a angiogénese e da capacidade invasiva de células tumorais [14]. Em contraste, outros estudos sugerem que a IL-17A mostraram um efeito protector contra o desenvolvimento de leucemia linfocítica crónica, através da promoção de rejeição de tumor mediada por sistema imune [15]. Além disso, a IL-17A aumentou os efeitos citotóxicos de células NK contra células tumorais, aumentando a expressão de moléculas citotóxicas [16]. Até agora, há menos relatório sobre o papel da IL-17A na invasão do GC.

No presente estudo, verificou-se que a IL-17A poderia aumentar a motilidade celular GC por upregulating MMP-2 e MMP -9 via ativação de fatores de transcrição NF-kB.

Materiais e Métodos

Cultura de células

linha de células GC Humano AGS foi adquirida da ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) e mantidas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Hyclone, Logan, UT), 100 U de penicilina G /e 100 mg /L de estreptomicina. linhas celulares de GC humanos BGC-823 e SGC-7901 foram obtidos a partir da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China), e cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 10% de soro de bovino, penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /mL). Todas as células foram cultivadas a 37 ° C, 5% de CO _{2 com atmosfera de ar.}

Cura Ensaio

GC células da ferida foram cultivadas como monocamadas confluentes em uma placa de 6 poços e foram feridos através da remoção de uma tira de um milímetro entre o poço com uma ponta de pipeta, quando aderidos à superfície da chapa. As monocamadas foram feridos, em seguida, lavada duas vezes com PBS para remover as células não aderentes antes de 1 ml de meio com ou sem IL-17A (50 ng /mL) (R & & D System, Minneapolis, MN) foram adicionados. Após 12 horas de incubação, diferentes grupos de concentração foram fotografadas por micrografias invertidos.

In vitro
Invasion Ensaio

O in vitro
ensaio de invasão foi realizada utilizando Bio-Revestimento Matrigel sistema de ensaio de invasão (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), como descrito anteriormente [17]. Depois tratou-se com ou sem IL-17A (50 ng /ml), células de GC foram semeadas em meio isento de soro de 200 ul e colocados nas câmaras superiores a 2 × 10 ^{5 células e meio de crescimento normal foram colocados em câmaras debaixo . Vinte e quatro horas mais tarde, as células na superfície superior da membrana foram removidos com cotonetes de algodão, enquanto que as células no lado inferior do filtro foram fixadas, coradas e medido. A percentagem da frequência invasivo foi expressa como uma percentagem do controlo.}

Western Blotting Análise

lisados ​​de células inteiras a partir de células de GC foram recolhidas com tamp de lise celular. Os lisados ​​nucleares de células em cultura foram colhidas com o kit de extração de proteínas NucBusterTM (Novagen, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. As análises de transferência de Western foram realizadas com o protocolo padrão, utilizando anticorpos contra a MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, p52 e β-actina (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), o NF-kB-p50, p65 /RelA, Rel-C, RelB, e Histona H1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

zimografia

As células foram tratadas com diferentes concentrações de IL-17A a 37 ° C durante 24 h, e as amostras de meio condicionado foram colhidos. Volumes apropriados de amostras (ajustado pelo número de células vitais) foram separados por 0,1% de gelatina e 8% de electroforese SDS-PAGE. Após a electroforese, os geles foram lavados duas vezes em 2,5% de Triton X-100 à temperatura ambiente durante 30 min e, em seguida, incubadas em tampão de reacção (CaCl 10 mM _{2, Tris-HCl a 40 e 0,01% de NaN 3, pH 8,0) a 37 ° C durante 12 h. gel de mancha azul brilhante de Coomassie R-250 foi então usado para corar o gel. As intensidades das bandas em géis foram calculados utilizando um sistema de análise de imagem (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).}

Análise Estatística

Todos os dados foram expressos como médias ± SD. A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EUA) para avaliar diferenças estatísticas. Estudante de t
-test foi utilizado para comparações entre dois grupos e one-way ou a análise de duas vias de variância foi utilizada para analisar as diferenças estatísticas entre os grupos em diferentes condições. Um P
valor inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os testes estatísticos foram dois lados.

Resultados

IL-17A Aumenta motilidade celular em células de GC

Um ensaio de ferida-zero foi realizado para determinar o efeito de IL-17A sobre a migração em AGS, BGC-823, e as células SGC-7901. A extensão da migração celular foi quantificada calculando a percentagem de recolonização da superfície da ferida depois de 24 h. No grupo controle, o movimento não era óbvia. Na presença de IL-17A, este movimento foi significativamente promovida após 12 h de incubação (Figura 1A). Quantificação análise indicou que a diferença era significativa (Figura 1B). Além disso, o ensaio de invasão mostraram que a capacidade invasiva de IL-17A foi tratada células significativamente mais forte do que o controlo células parentais em todas as três linhas celulares testadas (Figura 1C e 1D). Estes dados mostraram que a IL-17A pode melhorar a migração celular e invasão de GC. Além disso, observamos também que a IL-17A não tem efeito significativo sobre a proliferação de BGC-823, SGC-7901 e as células AGS (Figura S1), sugerindo que o efeito promotor de IL-17A sobre a migração e invasão não são interferidos por celular proliferação.

Efeito de IL-17A em a sobre-regulação da MMP-2 e MMP-9 e regulação negativa de TIMP-1 e TIMP-2 em células GC

uma vez que a sobre-expressão de MMP pode promover metástases do cancro [18], [19], que em seguida investigado o efeito de IL-17A na expressão de MMP em linhas celulares de GC. Como mostrado na Figura 2 e Figura S2, as expressões de MMP-2 e MMP-9 foram comparadas utilizando Western blotting entre a IL-17A células tratadas e não tratadas. O resultado mostrou que a MMP-2 e MMP-9 foram regulados positivamente em IL-17A células tratadas (AGS e BGC-823) (Figura 2A e 2B). Ao mesmo tempo, as expressões de TIMP-1 e TIMP-2 foram regulados negativamente (Figura 2A e 2B). zimografia também foi realizada para avaliar a actividade da MMP-2 e MMP-9 em células GC tratados com ou sem IL-17A. Os resultados mostraram que a IL-17A aumentou a actividade da MMP-2 e MMP-9 em células GC (AGS e BGC-823) (Figura 2C e 2D). Resultados semelhantes foram observados em células SGC-7901 (Figura S2). Estes resultados sugerem que o efeito pró-metástase de IL-17A em GC pode ser através de regulação do equilíbrio MMP /TIMP e nos levou a explorar mais seu mecanismo de ação.

IL-17A regula positivamente a MMP-2 e MMP- 9 Expressões via activar o NF-kB caminho

NF-kB foi classificado como um alvo a jusante da via de sinalização de IL-17A em muitas células [17], [20], [21], que é capaz de regular positivamente MMP-2 e MMP-9 expressões [14], [17]. E IL-17A também foi relatado para aumentar a expressão das MMPs através de activar o NF-kB via em muitas células [14], [17]. Portanto, o próximo verificado se a IL-17A upregulated MMP-2 e MMP-9 em células expressões GC através da activação de NF-kB. Como mostrado na Figura 3, a expressão e a translocação das subunidades NF-kB nos núcleos foram analisados ​​por transferência de Western. Observou-se que o nível de p65 e p50 em núcleos foi drasticamente elevada em células AGS após tratamento com IL-17A, enquanto que o nível de p65 e p50 total não tem qualquer alteração (Figura 3A-D). Além disso, o /fracção global destas moléculas nuclear foi aumentado por tratamento com IL-17A (Figura 3E). Resultados semelhantes foram observados em linha celular BGC-823 (Figura S3A-E), indicando que a IL-17A activada de NF-kB em linhas celulares de GC.

Além disso, quando helenalina (5 mM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), um inibidor de NF-kB, foi adicionada a AGS ou BGC-823 células de meio antes do tratamento de IL-17A, os níveis de MMP-2 e MMP-9 de expressão foram diminuiu significativamente (Figura 4C-D, figura S4C-D). O resultado demonstrou que a IL-17A induzida MMP-2 e MMP-9 a expressão em células de GC através da activação de NF-kB. Por conseguinte, a IL-17A invasividade celular induzida GC poderiam também foi bloqueado por helenalina In vitro
(Figura 4A-B, Figura S4A-B). Assim, estas descobertas sugerem que a IL-17A activa NF-kB via, subsequentemente regula a expressão de MMP, e assim afecta a migração e invasão de células de GC.

Discussão

GC é um da a maioria das doenças malignas fatais no mundo por causa de sua alta taxa de recorrência após terapias curativas [3], [22]. GC está intimamente correlacionado com doenças inflamatórias crônicas, em que a abundância de citocinas inflamatórias infiltram. IL-17A é uma das citocinas inflamatórias importantes no desenvolvimento de muitas doenças inflamatórias e também é frequentemente detectada no microambiente tumoral [23] - [26]. estudo anterior sugeriu que os níveis de expressão de IL-17 no tumor poderia ser um indicador independente de prognóstico em pacientes com adenocarcinoma gástrico [27]. Comparação de taxas de sobrevivência entre os pacientes com altos e baixos níveis de IL-17 descobriram que os pacientes com altos níveis de IL-17 tinha uma taxa de sobrevivência de 5 anos de 47% em comparação com 84% em pacientes com níveis baixos [28]. No entanto, os mecanismos moleculares para essa correlação, o que pode nos ajudar a entender melhor o papel da IL-17 no desenvolvimento e progresso da GC, continuam a ser elucidado.

No presente estudo, verificou-se que IL 17A promoveu a invasão de células de GC. A metástase é uma das principais causas de morte por câncer entre os pacientes do GC. A degradação da ECM de vasos sanguíneos ou linfáticos é crítica para a metástase, porque a perda da ECM permite que as células de cancro para invadir o sistema sanguíneo ou linfático e se espalhou para outros tecidos e órgãos [29]. As MMPs, especialmente de MMP-2 e MMP-9, são responsáveis ​​pela degradação da ECM [19], [29]. A IL-17A foi reportado para promover a invasão das células cancerosas através de regulação positiva da expressão de MMP-2 e MMP-9 [17], [26]. É geralmente aceite que as actividades de MMP são inibidas por TIMP para evitar extensiva degradação de ECM [29]. Para clarificar o mecanismo de acção de IL-17A, foi investigado se o efeito promotor de IL-17A na invasão de células é através da regulação das expressões de MMP-2, MMP-9, TIMP-1 e TIMP-2. Os nossos resultados mostraram que a IL-17A elevada as expressões e actividades de MMP-2 e MMP-9, e regulados negativamente as expressões de TIMP-1 e TIMP-2, que explicado mais adiante que a IL-17A promovido a migração celular na cura zero ferida ensaio. Portanto, o efeito pró-metástase de IL-17A em GC pode ser através de regulação do equilíbrio de MMP /TIMP.

NF-kB foi classificado como um alvo a jusante de IL-17A via de sinalização em muitas células [17] , [20], [21], que é capaz de regular positivamente a MMP-2 e MMP-9 expressões [14], [17]. E IL-17A também foi relatado para aumentar a expressão das MMPs através de activar o NF-kB via em muitas células [14], [17]. Então, foi investigado se a supra-regulação da MMP-2 e MMP-9 induzida por IL-17A é através da activação do NF-kB via. Os resultados mostraram a IL-17A promovido translocação nuclear das subunidades p65 e p50 de células de GC e, subsequentemente, regulada positivamente a expressão de MMP-2 e MMP-9. Este efeito pode ser bloqueado pelo inibidor de NF-kB, o que sugere que a activação de NF-kB é um mecanismo potencial para regular positivamente a MMP-2 e MMP-9 por IL-17A.

Em conclusão, os nossos resultados sugerem que a IL-17A foi capaz de promover a migração e a invasão de células GC por activar o NF-kB via, que, subsequentemente, regulada positivamente a expressão de MMP-2 e MMP-9 e, consequentemente, afectada migração e invasão de células de GC. A caracterização adicional do efeito de IL-17A em GC invasão e metástase pode levar à identificação de novos marcadores de diagnóstico e alvos terapêuticos.

Informação Apoiando
Figura S1.
O efeito da IL-17A sobre a proliferação de BGC-823, SGC-7901 e as células AGS
doi:. 10.1371 /journal.pone.0096678.s001
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Figura S2.
IL-17A promove a expressão de MMP-2 e MMP-9 e suprime a expressão de TIMP-1 e TIMP-2 em células SGC-7901. (A) As manifestações de MMPs em células SGC-7901 foram comparadas por western blotting entre as células tratadas com e sem IL-17A (50 ng /ml) durante 24 h. (B) Quantificação dos níveis de proteína de MMP-2 e MMP-9. Os valores representam as médias ± DP de três experiências independentes realizadas em triplicado. . * p Art < 0,05, em comparação com o grupo controle
doi: 10.1371 /journal.pone.0096678.s002
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Figura S3.
IL-17A activa NF-kB em células BGC-823. (A) análise de transferência de Western foi utilizada para detectar p50 em geral, p65, p52, c-Rel e RelB expressão em BGC-823 células tratadas com IL-17A (50 ng /ml) nos pontos de tempo indicados. (B) Quantificação dos níveis de proteína de p50 em geral, p65, p52, c-Rel e RelB. (C) análise de transferência de Western foi utilizada para detectar p50 nuclear, p65, p52, c-Rel e RelB expressão em BGC-823 células tratadas com IL-17A (50 ng /ml) nos pontos de tempo indicados. (D) A quantificação dos níveis de proteína de p50 nuclear, p65, p52, c-Rel e RelB. (E) A proporção relativa de nuclear para fração total do p50, p65, p52, c-Rel e RelB. Os valores representam as médias ± DP de três experiências independentes realizadas em triplicado. . * p Art < 0,05, em comparação com o grupo controle
doi: 10.1371 /journal.pone.0096678.s003
(TIF)
Figura S4.
Efeitos de helenalina e IL-17A na invasão celular e as expressões de MMP-2 e MMP-9 em células BGC-823. (A) 1 × 10 6 células BGC-823 foram pré-tratados com helenalina (5 uM) e depois incubadas na presença ou ausência de IL-17A (50 ng /mL) durante 24 h. invasividade celular foi medida utilizando o ensaio Transwell invasão. (B) A taxa de invasão por cento foi expressa como uma percentagem do controlo. (C, D) Os níveis de proteína de MMP-2 e MMP-9 foram detectados por Western blotting, quando as células BGC-823 foram tratadas com helenalina e /ou IL-17A. Os valores representam as médias ± DP de três experiências independentes realizadas em triplicado. * p Art < 0,05, em comparação com o grupo controle
doi:. 10.1371 /journal.pone.0096678.s004
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