хеликобактерной Введение Helicobacter Pylori (H Испытуемых Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли из образцов периферической крови со стандартной процедурой Ficoll-Hypaque и замораживают немедленно при -150 ° с до использования, или в опытах сразу же, если отмечено. Регулярное культуральная среда RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 5 мл 100U пенициллин /0,1 мг /мл стрептомицина, и 5 мл 2 мМ L-глутамина. Клетки культивировали в 5% CO <югу> 2 при 37 ° С в течение указанного периода времени. Проточная цитометрия H <их.> H Все вместе, эти данные Показано, что регуляторная цитокина IL-10 в основном производится с помощью CD24 + CD38 + в-клеток и увеличивается в H
заражение происходит в более чем половине населения земного шара и является основной причиной развития рака желудка. Серия образа жизни и факторов питания, таких, как курение табака и ожирение, было обнаружено, что поднять риск развития рака. В данном исследовании мы стремились определить иммунологические аспекты во время H
. пилори
инфекции и развитие рака желудка. Мы обнаружили, что В-клетки из H
. пилори
-infected пациентов представлен измененный состав и функции по сравнению с неинфицированных пациентов. IL-10-экспрессирующие CD24 + CD38 + B-клетки активируются в H
. пилори
-infected пациентов, содержали сильную регулирующую активность в подавлении секреции Т-клеточного провоспалительных цитокинов, и ответил прямо на H
. пилори
антигенной стимуляции. Интересно, что в H
. pylori-
зараженные предметы для курения и пациентов, страдающих ожирением, количество IL-10 + B-клетки и CD24 + CD38 + В-клетки были снижены по сравнению с H <бр>. пилори
-infected бессимптомных пациентов. Регулирующие функции, опосредованные CD24 + CD38 + В-клетки также нарушена. Кроме того, рак желудка положительных пациентов уменьшил IL-10-продуцирующие частоты В-клеток после H
. пилори
-стимулирование. В целом, эти данные свидетельствуют о том, что в H
. пилори
-infection, CD24 + CD38 + В-клеток активируется и играет роль в подавлении про-воспалительных реакций, возможно, через IL-10 производства, особенность, которая не наблюдалась в курении и у пациентов с ожирением
<р> Цитирование:. Ли G, H Wulan, Песня Z, Пайк PA, Tsao ML, Гудман GM и др. (2015) Нормативная B Cell Функция подавлена курение и ожирение в H
. пилори
-Infected Субъекты и коррелируется с повышенным риском рака желудка. PLoS ONE 10 (7): e0134591. DOI: 10.1371 /journal.pone.0134591
<р> Редактор: Масару Като, Национальный центр рака, JAPAN
<р> Поступило: 3 февраля 2015 года; Принято: 13 Июля, 2015 года; Опубликовано: 30 июля 2015
<р> Copyright: © 2015 Li и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в работе
<р> финансирование:.. авторы не имеют никакой поддержки или финансирования сообщать
<р> конкурирующие интересы:. авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
. пилори)
является своего рода грамотрицательных патогенных бактерий в более чем половине населения земного шара, и предпочтительно ингибирует верхних отделов желудочно-кишечного тракта, в том числе эпителии желудка и двенадцатиперстной кишки-кишечного тракта [1,2]. Несмотря на то, что подавляющее большинство (> 80%) инфекций являются бессимптомными, 10-20% инфицированных субъектов будет развиваться язвенной болезни в то время как 1-2% приобретет рак [3] желудка. Точный механизм развития рака в результате H
. пилори
инфекция не определена, но хроническое воспаление необработанной в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, как полагают, способствовать дальнейшему повреждению эпителия желудка [4,5]. В частности, ассоциированных с воспалением молекул, таких как фактор некроза опухоли альфа (TNF-а) передачи сигналов, как было установлено, способствуют желудочного туморогенез и позитивно регулируется в H
. пилори
инфекции [6]. Другие провоспалительные цитокины, секретируемые Т-клетками, в том числе IL-2, IL-17, и гамма-интерферона (IFN-г), которые также повышалась в H
. пилори
инфекции и связаны с повышенным риском желудка онкогенеза [7-10]. Ряд других факторов, таких как непрерывного воздействия курения табака и ожирения, положительно коррелирует с повышенным риском развития рака желудка, хотя основной механизм остается неясным [3,11].
<Р> В последнее время роль tolerance- индукции в-клеток было охарактеризовано в ряде инфекционных заболеваний и аутоиммунных заболеваний [12]. У мышей, CD1d hiCD5 + B-клетки были найдены, чтобы помочь установить толерогенную среду в тканях и играют определенную роль в предотвращении аутоиммунный индукции [13]. У людей, CD19 + CD24 hiCD38 привет В-клетки имеют сходные толерантность, индуцирующего роль в здоровой, а также HBV-инфицированных лиц [14]; начало аутоиммунного заболевания коррелирует с потерей функции регулирования в этой В субпопуляции [15]. IL-10 является плейотропных иммунорегуляторного цитокин, который способен ингибировать ряд провоспалительных цитокинов, в том числе IL-2, IL-17, IFN-G и TNF-а, и показано, что сильнодействующий подавляет антиген-представляющих потенциал антиген-представляющих клеток [16]. Центральное место во всех толерантных индуцирующих подмножеств В клетки ИЛ-10 производства имеет решающее значение для В-клеток-опосредованной регуляции в подавлении T клеточного воспаления [12,17]. Роль клеточного регуляции B в H
. инфекция пилори
и последующая индукция рака желудка, однако, не был ранее изучен.
<Р> В этом исследовании мы проанализировали состав В-клеток и экспрессии цитокина в профиль H
, пилори
-infected предметы. Повышенные проценты CD24 + CD38 + В-клеток и снижение процентного содержания наивных В-клеток и покоящихся В-клеток памяти были найдены в H
. pylor
я-инфицированные предметы. CD24 + CD38 + В-клетки в H
. пилори-инфицированных испытуемые
увеличение доли IL-10 производства, и подавил провоспалительного экспрессию цитокинов при совместном культивировании с аутологичных Т-клеток. H
. пилори-s
timulated CD24 + CD38 + В-клетки H
. pylori-
зараженные предметы сильнодействующий секретируют IL-10. Интересно, что H
. пилори-инфицированных курение
субъектов и ожирением subects снизили уровни CD24 + CD38 + В-клеток. Были найдены Кроме того, CD24 + CD38 + регуляторные В-клетки в курении и ожирением проявлять потерю супрессивной функции при совместном культивировании с аутологичных Т-клеток и вынужденное сниженные уровни IL-10 после того, как прямой H
. пилори
стимуляции. Кроме того, в курении и у пациентов с ожирением, которые впоследствии развился рак желудка, частоты ИЛ-10-секретирующих В-клеток были дополнительно уменьшены, по сравнению с субъектами, которые не развивается рак желудка. В целом, эти данные показали, что CD24 + CD38 + B-клетки активируются в H
. пилори
-infected и были функционально подавлена Т-клеток производства воспалительных цитокинов. CD24 + CD38 + В-клетки в курении субъектов и пациентов, страдающих ожирением, однако, были резистентны к H
. пилори
-стимулирование, получают меньше IL-10, и не хватало подавляющий потенциала.
Материалы и методы
<р> были получены первичные образцы периферической крови от 55 H
. пилори
-infected язвенные свободных пациентов, из которых 15 являются основными потребителями табачного дыма и 15 относятся к классу I ожирением (30кг /м 2 &л; ИМТ &л; 35 кг /м 2 ) субъектов, а также 15 здоровых H
. пилори
-uninfected язвенные свободных лиц. Лица с хроническим воздействием пассивного курения были исключены из исследования. Не было обнаружено существенных различий в отношении возраста, пола, а также в анамнезе инфекции между исследовательскими группами. Все пациенты наблюдались в течение 5 лет для состояния развития рака. Все предметы были связаны люди из провинции Хэнань и его окрестностей. Пациенты были набраны между Jan 2008 и Dec 2013 из 155-й центральной больницы ПЛА в Китае. Органы управления были рак свободных индивидов случайным образом выбранных из программы скрининга рака сообщества для раннего выявления рака проводят в тех же регионах за тот же период были приняты на работу пациенты. Скорость отклика для обоих случаев контроля и составила 95%. Критерии отбора здоровых включали рак свободных индивидов и согласование частот для случаев с разбивкой по полу и возрасту (± 5 лет). При наборе, письменное информированное согласие было получено от каждого субъекта и персональных данных, таких как пол, возраст, вес, рост и курение табака были собраны с помощью вопросника. Не образцы всех испытуемых были использованы во всех экспериментах из-за неполного соответствия пациента и недостаточности клеток у некоторых пациентов. Данное исследование было одобрено Советом по рассмотрению Institutional 155-й центральной больницы ПЛА.
пробоподготовки
Выделение клеток
<р> Т и В клетки выделяли с использованием человеческих Т-клетка или В-клетки Отрицательная Выбор комплекта (StemCell, Ванкувер, Канада), следующие протоколы, предоставленные производителем. В чистота выделениями Т- и В-клеток было больше, чем 94% с помощью проточной цитометрии. Для истощения CD24 + CD38 + В-клеток в некоторых экспериментах, очищенные В-клетки окрашивали PE античеловеческой CD24 и APC античеловеческой CD38 в течение 30 мин. Клетки затем отправили жить сортировки клеток и CD24 + CD38 + клетки были истощены. В установке всего В-клеток, всего В-клетки были отправлены в живой клетке без сортировки антител
<р> были использованы следующие моноклональные антитела анти-человека:. ИЛ-10, ФНО- а (eBioscience, Сан-Диего, штат Калифорния, США); CD3, CD4, CD19, CD20, CD21, CD24, CD27, CD38 (BioLegend, Сан-Диего, штат Калифорния, США); ИФН-г (BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния, США); CD8 (Invitrogen, Grand Island, Нью-Йорк, США). Очищенный человеческий IgG (BioLegend, Сан-Диего, штат Калифорния, США) использовали, чтобы блокировать Fc рецепторы при окрашивании популяции, содержащие В-клетки. Для некоторых экспериментов, форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА, Sigma), Ionomycin (Sigma, Мюнхен, Германия), или убитых нагреванием H
. пилори
(Sigma, Мюнхен, Германия) были использованы для стимуляции клеток. GolgiStop и GolgiPlug были добавлены 6h до начала клеток урожая для внутриклеточного окрашивания IL-2, IL-17, ИФН-г, ФНО-а и ИЛ-10. FlowJo использовали для анализа методом проточной цитометрии.
Luminex анализ
<р> ИЛ-2, ИЛ-17, ИФН-г, ФНО-а и ИЛ-10 от Т-клеток и В-клеток, были количественно измерены с помощью мультиплексной Luminex анализа следующие протоколы, предоставляемые производителем с изменениями (EMD Millipore, Etobicoke, Канада). В общей сложности 2х10 5 Т-клеток и /или В-клеток высевали в каждую лунку 96-луночного планшета (Corning, Тексбери, Массачусетс, США). Для стимуляции клеток B, убитых нагреванием H
. пилори
были добавлены в В-клетки, которые высевают в нижней части 96-луночного Transwell пластины (Корнинг, Tewksbury, Массачусетс). Для стимуляции Т-клеток, нижняя часть Transwell пластины предварительно инкубировали с анти-CD3 человека (клон ОКТ3) в течение ночи и промывают, после чего очищают Т-клетки были перенесены в тарелку. бусинки человеческих антител захвата цитокин были добавлены в верхнюю камеру 96-луночного Transwell пластины. Через двенадцать часов, гранулы собирали, промывали и читать в соответствии с протоколом производителя.
Статистический анализ
<р> Д'Агостино и Пирсона омнибус нормальность использовали для проверки, нормально ли были распределены данные. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) использовали для сравнения между несколькими группами с последующим тестом Данна. T-критерий Стьюдента использовали для сравнения между двумя группами. Если наборы данных значительно отклонился от нормального распределения, использовались непараметрические тесты. Все статистические анализы проводились с использованием Prism (GraphPad Software). P &л; 0,05 считается значительным. Результаты приведены в виде среднего значения ± S.E.M.
Результаты
. пилори
-infected предметы изменили состав циркулирующих В-клеток
<р> Для анализа возможных изменений в роли ответов B клеток в H
. пилори
инфекции и как это может повлиять курение и ожирение, 15 здоровых H
. пилори
-uninfected ( H
. пилори
-uninfected) добровольцев, 20 H
. пилори
-infected бессимптомных для некурящих, не страдающих ожирением (бессимптомных) предметы, 15 H
. пилори
-infected курить без ожирения (курение) предметы, и 15 H
. пилори
-infected для некурящих с ожирением (ожирением) субъектов были приняты на работу для этого исследования. Демографические и клинические данные были обобщены в таблице 1.
<р> Циркулирующие В-клеток в периферической крови здоровых людей состоят в основном из IgD + CD27 - наивные В-клетки и CD21 + CD27 + покоя в-клетки памяти, в то время как при хронических инфекций, часто есть уменьшение наивных в-клеток и покоящихся в клеток памяти, а также увеличение CD21 Lo активированный в-клеток и CD24 + CD38 + В-клетки [15,18]. Сначала мы исследовали состав циркулирующих В-клеток в H
. пилори
-infected предметы. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), окрашивали для экспрессии поверхностного маркера непосредственно ех естественных условиях
(Фиг.1А). Мы обнаружили, что по сравнению с H
. пилори
-uninfected здоровых людей, все H
. пилори
-infected группы содержали более низкий процент от IgD + CD27 - наивные В-клетки (P &л; 0,001 для всех, рис 1В и 1С). Процентное содержание CD21 + CD27 + покоящиеся В-клетки памяти были уменьшены в H
. пилори
-infected предметы для курения и ожирением по сравнению со здоровыми субъектами (P < 0,001 для обоих), а также процент CD21 + CD27 + В-клетки у тучных субъектов была снижена по сравнению с H
. пилори
-infected бессимптомных пациентов (Р &л; 0,01). Интересно, что процент CD24 + CD38 + B-клетки варьировали между различными группами H
. пилори
-infected предметы. H
. пилори
-infected бессимптомных пациентов содержали гораздо более высокий процент CD24 + CD38 + В-клеток, чем у здоровых контрольной группы (P < 0,001). Процент CD24 + CD38 + В клетках уменьшалась у пациентов курительных по сравнению с, что в бессимптомных пациентов (Р &ЛТ; 0,05), но все еще выше, чем у здоровых субъектов (P &ЛТ; 0,001). У тучных субъектов, процент CD24 + CD38 + В-клетки существенно не отличалась от таковой у здоровых людей, но была снижена с, что в бессимптомных пациентов (P &лт; 0,001)
. пилори
-infected предметы изменили В-клеточный цитокин профиль экспрессии
<р> Ранее были найдены В-клетки, чтобы усилить или подавить иммунные реакции за счет производства ряда цитокинов с различными функциями, в том числе про- воспалительные цитокины, такие как IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, ИФН-г и ФНО-а, а также ИЛ-10 и фактора бета трансформации роста (TGF-б) в качестве регуляторных цитокинов [19] , Здесь мы исследовали экспрессию цитокина В-клеток в исследуемых предметов. Мы обнаружили, что ех естественных условиях
экспрессия IL-2, IFN-г и TNF-а В-клетками были увеличены в H
. пилори
-infected предметы для курения и пациентов, страдающих ожирением, чем у здоровых испытуемых (рис 2А). Никаких существенных различий не было обнаружено в экспрессии TGF-б.
<Р> CD24 + CD38 + B клетки имеют регулирующие функции в других исследованиях и имели интересные уровни экспрессии в различных H
. пилори
-infected группы (рис 1C). Мы исследовали экспрессию внутриклеточных цитокинов CD24 + CD38 + В-клеток. Как показано на рис 2В, выражение цитокинового CD24 + CD38 + В-клетки отличаются от не-CD24 + CD38 + В-клеток (всего В-клетки минус CD24 + CD38 + в-клеток) в том, что они не продуцируют высокие уровни IFN-G и TNF-а при стимуляции РМА /иономицин, но выражены очень высокие уровни IL-10, как при не стимулированных и стимулированных условиях. Мы сравнили продукцию IL-10 из различных подмножеств В-клеток и обнаружили, что CD24 + CD38 + В-клеток во всех исследуемых группах секретируется гораздо выше, IL-10, чем не CD24 + CD38 + в-клеток, как при стимулированных условиях, а также ФМК /иономицин стимулированных условиях (рис 2С). Таким образом, мы рассматриваем CD24 + CD38 + фракции в качестве основного IL-10 продуцирующих В-клеток подмножества. В H
. пилори
-infected группа, бессимптомных пациентов имели более высокий процент IL-10-экспрессирующих клеток в CD24 + CD38 + В-клеток, чем у здоровых испытуемых в то время как H
. пилори
-infected пациентов с ожирением имели более низкий IL-10-экспрессирующие клетки в CD24 + CD38 + B-клетки, чем у бессимптомных пациентов (рис 2С). Затем мы умножили частоту IL-10 + клеток в CD24 + CD38 + В-клетки с процентом CD24 + CD38 + клеток в общей клетке B, чтобы получить "число" ИЛ-10-экспрессирующих клеток в в-клетках, и обнаружили, что и H
. пилори
-infected бессимптомных предметы и предметы курения имели более высокий уровень IL-10 + В-клеток, чем у здоровых испытуемых (P &ЛТ; 0,001 и P &л; 0,01, соответственно). В H
. пилори
-infected группа, курение и ожирение значительно пониженные частоты IL-10 + В-клеток (P < 0,001 для обоих). от бессимптомных пациентов
. пилори
-infected бессимптомных пациентов. Курение и ожирение пониженную экспрессию IL-10 в CD24 + CD38 + B клеток.
H
. пилори
-infected бессимптомных пациентов имели более толерогенную активность, опосредованную CD24 + CD38 + В-клетки, чем курение и ожирением
<р> Регулирующие В-клетки были известны ингибировать Т-клеточные реакции при хронических инфекциях, таких как инфекции гепатита в и вирусной инфекции иммунодефицита человека [14,20], путем создания толерогенную среды посредством IL-10 до индукции воспаления [15,21]. Мы исследовали были ли IL-10-продуцирующие CD24 + CD38 + B-клетки, аналогичные регуляторные эффекты в H
. пилори
-infection. CD4 + Т-клетки культивировали совместно с аутогенной CD24 + CD38 + - истощенные В-клетки были значительно повышены выработку IL-2, IL-17, ИФН-г и ФНО-а, чем CD4 + Т-клетки культивируют совместно с целыми в-клеток, в H
. пилори
-infected бессимптомных пациентов (рис 3А). У курящих субъектов и пациентов, страдающих ожирением, такой эффект не наблюдался. Аналогично, CD8 + Т-клетки из H
. пилори
-infected бессимптомных пациентов культивировали совместно с аутологичных CD24 + CD38 + - истощенные В-клетки значительно повысить ИФН-г и TNF-секреция, чем те, культивировали совместно с целыми В-клеток ( фиг.3В). Опять же, такой эффект не наблюдался у субъектов курения и ожирением. Подавление экспрессии Т-клеточного цитокинового-видимому, опосредована CD24 + CD38 + В-клетки, так как самое низкое производство цитокина наблюдалось в CD4 + и CD8 + Т-клетки культивировали совместно с CD24 + CD38 + B одни клетки. В целом, эти данные показали, что CD24 + CD38 + В-клетки в H
. пилори
-infected субъекты подавлено CD4 + и CD8 + Т-клеток провоспалительного выработку цитокинов H
. пилори
-infected бессимптомных пациентов. Курение и ожирение тормозится регуляторные действия CD24 + CD38 + B-клетки.
секреция IL-10 клетками CD24 + CD38 + B при H
. пилори
стимуляции по различным предметам
<р> Затем мы стремились изучить механизм IL-10 повышающей регуляции в B клетках H
. пилори
-infected предметы. производство IL-10 имеет решающее значение для регуляторной функции В-клеток [12,13]. Toll-подобный рецептор сигнализации является одним из основных IL-10 повышающей регуляцией механизм в В-клетках, и было показано, модулирует экспрессию цитокинов в H
. пилори
инфекции [22,23]. Мы проверили, действительно ли наличие H
. пилори
может непосредственно апрегулируются секрецию IL-10 в CD24 + CD38 + В-клеток. Очищенные В-клетки из РВМС культивировали в отсутствие или в присутствии убитых нагреванием H
. пилори
бактерии. После 72 ч инкубации, секрецию IL-10 в супернатанте измеряли с помощью Luminex. В-клетки также были собраны для внутриклеточного IL-10 окрашиванием. Как показано на рис 4A, секрецию IL-10 в супернатанте увеличивается в обоих H
. пилори
-uninfected здоровых субъектов и H
. пилори
-infected для некурящих, не страдающих ожирением бессимптомных пациентов после H