PLoS ONE: DNA Methylering i Exon en region og Kompleks forordning af Twist1 Expression i Gastric Cancer Cells

Abstrakt

Twist1 overekspression ofte observeres i forskellige kræftformer, herunder gastrisk cancer (GC). Selvom DNA methylering af Twist1
gen er blevet rapporteret i kræftceller, mekanismerne bag transkriptionel aktivering fortsat usikre. I denne undersøgelse, vi først undersøgt epigenetiske ændringer af Twist1
bruge Twist1
transskription-positive og ekskluderet cellelinjer, der er afledt af vores etablerede diffus type GC musemodel. Behandling med en DNA-demethylering agent 5-aza-dC re-aktiveret Twist1 udtryk i Twist1 udtryk-negative GC celler. Ifølge methyleringsspecifik PCR og bisulfit sekventeringsanalyse, methylering ved CpG-rige region i Twist1
kodende exon 1, snarere end dens promotorregion, blev tæt forbundet med transkriptionel inaktivering af Twist1
ekspression i muse GC-celler. Kromatin immunopræcipitationsanalyser afslørede, at aktiv histon-mærket H3K4me3 blev beriget i Twist1 ekspression-positive celler, og inaktive histon-mærket H3K9me3 blev beriget i Twist1 ekspression-negative celler. Ekspressionsniveauerne af Suv39h1
og Suv39h2
, histon metyltransferaser for H3K9me3, blev omvendt korreleret med Twist1
udtryk, og knockdown af Suv39h1
eller Suv39h2
induceret Twist1
udtryk. Desuden Sp1 transkriptionsfaktor bundet til exon 1 CpG-rig region i Twist1 ekspressions-positive cellelinier, og Twist1
ekspression blev formindsket med mithramycin, som der forstyrrer Sp1-binding til CpG-rige regulatoriske sekvenser. Vores undersøgelser tydede på, at Twist1
transskription i GC celler kan reguleres gennem potentielt samarbejde af DNA methylering, histon modifikation i kompleks med SP1 binding til CpG-rige regioner i exon 1 region.

Henvisning: Sakamoto A, Akiyama Y, Shimada S, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka S (2015) DNA-methylering i Exon en region og Kompleks forordning af Twist1 Expression i Gastric Cancer Cells. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10,1371 /journal.pone.0145630

Redaktør: Tae-Young Roh, Pohang Universitet for Videnskab og Teknologi (POSTECH), Republikken Korea

Modtaget: 21 september, 2015; Accepteret: December 6, 2015; Udgivet: 22 December, 2015

Copyright: © 2015 Sakamoto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud-in-Støtte til videnskabelig forskning (C) (24.590.444) og (A) (25.253.081), og A3 Foresight Program (AA005) fra Japan Society for fremme af Science (JSP'er), og den praktiske Forskning for Innovative Cancer Kontrol (15Ack0106017h0002) fra Japan Agentur for medicinsk forskning og udvikling, AMED; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser:. BS, bisulfit sekventering; CGI, CpG ø; Chip, kromatin immunpræcipitation; DCKO, dobbelt betinget knockout mus; DGC, diffus type mavekræft; GAPDH, glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase; GC, gastrisk cancer; H3K4me3, histon H3 lysin 4 tri-methylering; H3K9me3, histon H3 lysin 9 tri-methylering; H3K27me3, histon H3 lysin 27 tri-methylering; MSP, methyleringsspecifik polymerasekædereaktion; RT-PCR, revers transkription-polymerasekædereaktion; QRT-PCR, kvantitativ RT-PCR; GTS, tumorsuppressorgener; TSS, afskrift startstedet; 5-aza-dC, 5-aza-2'-deoxycitidine

Introduktion

Twist1, som en grundlæggende helix-loop-helix transskription faktor, binder direkte til E-box elementer (NCANNTGN ) på specifikke målgener [1]. Twist1 er almindeligt kendt for at være essentiel for mesoderm dannelse i den tidlige fosterudvikling af drosophila og mus [2, 3]. I humane cancere, er ektopisk Twist1 ekspression rapporteret at være associeret med malign progression, invasion, epithelial-til-mechencymal overgang, metastase og stemness, hvilket indikerer potentielle onkogene funktioner Twist1 [4-6]. Således er det meget vigtigt at klarlægge de transkriptionelle regulatoriske mekanismer for Twist1 i kræftceller.

Epigenetisk ændringer, såsom DNA-methylering og histon modifikation, er tæt knyttet til gen-silencing [7-9]. Selvom epigenetiske ændringer på CGI (CpG island) promotorregionen af ​​tumorsuppressorgener (GTS) er velkendte for at være forbundet med deres geninaktivering [10], er mekanismerne for epigenetisk regulering af onkogener dårligt forstået. Flere grupper har vist, at Twist1
blev re-aktiveret ved behandling med en de-methylering lægemiddel, 5-aza-2'-deoxycitidine (5-aza-dC), i cancerceller [11, 12]. Afvigende DNA methylering på CGI promotor i menneskelig Twist1
er ofte fundet i primære kræftformer, herunder af mavekræft (GC) [11-14]. Alligevel er der masser af fund at DNA methylering på Twist1
promoter region er ikke korreleret med ekspression af genet i forskellige kræftformer [12, 14]. Mens kan Twist1
methylering være et nyttigt biomarkør til at forudsige de kliniske resultater, at tilbagefald og overlevelse hos patienter med kræft [12, 13, 15], er det fortsat kontroversielt, om Twist1
methylering ved promotorområdet fører til inaktivering af genet.

Transkriptionel regulering af gener er korreleret med lysin (K) mønstre for methylering i histon hale, der består af tre forskellige lysin methylering (mono-, di- og tri-). Tri-methylering af H3K4 (H3K4me3) er relateret til genaktivering, og af H3K9me3 og H3K27me3 til gen undertrykkelse [7-9]. Selv om disse tre histon H3-methyaltion mønstre er knyttet til CGI methylering så godt, de transkriptionelle regulatoriske mekanismer for Twist1
underliggende histon modifikation er dårligt forstået i kræftceller.

GC er den næsthyppigste dødsårsag af kræft i verden [16]. GC er klassificeret i to store histologiske typer; diffus og tarm, der er to forskellige kræftfremkaldende pathways [17]. Diffuse-typen gastrisk cancer (DGC) er kendt for at vise hyppige invasion og metastase, hvilket resulterer i en dårlig prognose [18]. Tab af E-cadherin og p53 er blevet rapporteret i diffust-typen gastrisk carcinogenese [19-21]. Adskillige rapporter demonstrerede hyppig overekspression af Twist1 i menneskelige DGCs [22, 23].

Vi har tidligere udviklet en dobbelt betinget knockout (DCKO) mus linje som til E-cadherin og p53, som specifikt inaktiveret i maven [ ,,,0],19]. Alle DCKO mus udviklede fatale DGCs inden for et år, de fænotyper være af høj invasionsevne og hyppig metastaser til lymfeknuder. Det er bemærkelsesværdigt, at genekspressionsmønstre af DGCs i DCKO mus fundet på microarray analyse var meget lig dem af humane andre end intestinale dem primære DGCs. Vores DCKO muse-modellen er således et stærkt værktøj til at undersøge betydningen af ​​genfunktion i DGC carcinogenese og til udvikling af en terapeutisk strategi. I denne undersøgelse, vi etablerede Twist1 udtryk-positive og -negative DGC cellelinjer, der er afledt fra DCKO mus. Som en konsekvens af analyse af de epigenetiske ændringer, blev den fælles mekanisme for Twist1
belyst, og evalueret i både murine og humane DGCs i denne undersøgelse.

Materialer og Metoder

Etik Statement

Alle in vivo
procedurer blev godkendt af Animal Care udvalg for Tokyo Medicinsk og Dental University (Tilladelse nr 0160073A). Som for normale humane gastriske slimhinder prøver blev skriftligt informeret samtykke indhentet fra alle fag, og undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Tokyo Medicinsk og Dental University (No.1115).

Cell kulturer og vævsprøver

Vi har tidligere etableret en E-cadherin /p53 DCKO ( Atp4b-Cre
^{+
; CDH1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
) musemodel [19]. Fra sin de ondartede væv, vi etableret fem mus DGC cellelinjer og navngivet dem MDGCs (Shimada S, upubliceret observation). MDGC-1 og MDGC-3-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende høj glucose suppleret med 10% føtalt bovint serum, og MDGC-7, MDGC-8 og MDGC-9 blev dyrket i Hams F12 suppleret med 5% hesteserum. DNA-analyse blev udført for at påvise afkortet CDH1
Trp53
alleler (S1 Fig). Otte humane GC cellelinier (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 og HSC60) blev også anvendt i denne undersøgelse. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY og KATO-III blev købt fra Riken celle bank (Tsukuba, Japan). NUGC4 og AGS celler blev opnået fra Human Science Research Resources Bank (Osaka, Japan) og ATCC (American Type Cell Collection). HSC60 celler blev opnået fra Dr. Kazuyoshi Yanagihara (National Cancer Research Center, Tokyo, Japan) [24]. KATO-III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS og HSC60 celler blev dyrket i RPMI 1640, og GCIY blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium, som begge blev suppleret med 10% føtalt bovint serum. For de-methylering undersøgelser, murine og humane GC-celler blev behandlet dagligt med 500 nM 5-aza-deoxycytidin (5-aza-dC, Sigma; # A3656) i 72 timer. Vi behandlede disse GC celler med 100 nM Trichostatin A (TSA, Wako;Ètil 11.993) i 24 timer eller 100 nM mithramycin A (Wako;„til 17.101) i 24 timer}

Atten primære GC væv og tilsvarende. ikke-kræft gastriske slimhinder blev opnået fra 15 DCKO mus. Som for humane mave væv, brugte vi tre ikke-kræft gastrisk slimhinder fra GC patienter. Vi opnåede også fem normal gastrisk slimhinder fra Atp4b-Cre
^{-
; CDH1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
mus, der blev brugt som negative kontroller i vores tidligere undersøgelse [19]. I denne undersøgelse, vi kaldte "normal gastrisk slimhinder", hvis prøver blev opnået fra kontrol mus, og "ikke-kræft gastrisk slimhinder", hvis prøver blev indhentet fra DCKO mus og humane GC patienter i denne undersøgelse.}

Reverse transskription (RT) -PCR og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)

Totalt RNA blev isoleret med en RNeasy Mini kit (Qiagen;J.134) og cDNA blev fremstillet fra RNA under anvendelse af en SuperScript III kit (Invitrogen;´80044) ifølge fabrikantens protokoller. Endepunkt RT-PCR udført med flere cyklus numre, 28-35 cyklusser. Som en intern kontrol, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase ( GAPDH
) blev forstærket med 21 cyklusser for at sikre cDNA kvalitet og mængde for hver RT-PCR. De forstærkede produkter blev lastet til 2% agarosegeler eller kvantificeres ved kvantitativ RT-PCR med LightCycler DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics;/07516001). Amplifikationsprodukterne programmer for PCR blev gentaget i 40 cykler for GAPDH og 45cycles for andre gener med undtagelse af GAPDH. PCR-produkter blev klonet ind i pMD20 T-vektor ved anvendelse af en Mighty TA-kloning (Takara BIO INC;ɚ8), og derefter sekventeret direkte. Primersekvenserne og PCR-produktet størrelser er vist i S1 tabel.

methyleringsanalyse

Vi ekstraheret genomisk DNA fra murine og humane GC cellelinier ved phenol-chloroform-metoden, og derefter udført bisulfit modifikation og MSP procedure. Bisulfit behandling af DNA blev udført med EZ DNA-methylering-Gold (Zymo forskning; # D5006), og derefter methylering-specifik PCR (MSP) blev udført. Kort beskrevet blev PCR reaktionen udført i 35 cykler i en 25 pi blanding omfattende bisulfit-modificeret DNA, 2.5μl på 10x PCR buffer, 1,25 pi 25 mM dNTP'er, 25 pmol /l af hver primer og 1 U Jumpstart RedTaq polymerase (Sigma; # D0563). Betingelserne for PCR var som følger: 95 ° C i 5 minutter; 35 cykler ved 95 ° C i 1 minut, 53 ° C i 2 minutter og 72 ° C for 1,5 minutter; og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 5 minutter. Som for muse GC væv blev DNA ekstraheret fra formalin-fikserede paraffin-indlejrede (FFPE) væv. Bisulfit-DNA blev amplificeret med flankerende PCR-primere og derefter indlejret MSP blev udført [25, 26]. De primer sekvenser og PCR produkt størrelser er vist i S2 Tabel

chromatin immunoprecipitation (chip) assay

Chippen udførtes ved hjælp af en chip-IT Express kit (Aktiv Motiv;5.008). ifølge fabrikantens protokol. Immunpræcipiteret DNA berigelse blev normaliseret med hensyn til input. Antistofferne anvendt i denne undersøgelse var anti-histon H3K4me3 (Active Motif;'.915), anti-H3K9me3 (Active Motif;'.765), anti-H3K27me3 (Active Motif;Ƈ55), anti-H3K36me2 (Abcam; # ab9049) , anti-Sp1 (Abcam; # ab13370), og anti-histon H3 (Active Motif;'.163) antistoffer. Normalt kanin IgG (Cell Signaling Technology,Đ9s) blev anvendt som en negativ kontrol for chippen. De primer sekvenser og PCR produkt størrelser er vist i S2 tabel.

Knockdown analyse ved hjælp af små interfererende RNA

siRNA-baserede knockdown af Suv39h1
og Suv39h2
blev udført under anvendelse af en elektroporation (Neon transfektionssystem, Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. MDGC celler blev transficeret med 50 nM siRNA af Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226), eller negativ kontrol siRNA (Mission siRNA Universal Negative Control, Sigma). Efter 48 timer dyrkning blev celler høstet til RT-PCR, Western blot-analyser, migration, invasion og proliferation assay.

Western blot-analyse

GC-celler blev lyseret med Pierce RIPA puffer (Thermo Videnskabelig;΃00). Proteiner blev separeret på SDS-polyacrylamidgeler og derefter overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner, efterfulgt af inkubation med antistoffer opløst i Tris-bufret saltvand (TBS) indeholdende 2% skummetmælk og 10% Tween 20. De primære antistoffer anvendt i denne undersøgelsen var monoklonalt muse-anti-Twist1 (1: 100, Santa Cruz Bio-teknologi; # sc-81.417), kanin polyklonalt anti-Sp1 (1: 200, aktive motiv;Ɔ58), og muse monoklonale anti-α-tubulin ( 1: 200, Santa Cruz; # sc-8035) antistoffer. De sekundære antistoffer var alkalisk phosphatase-konjugeret anti-kanin IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories;
.706.518) og anti-muse-IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories,
.706.520). Blots blev udviklet med ImmunoStar AP Substrat (Bio-Rad Laboratories;
.705.018)

Immunhistokemi

FFPE sektioner (4 uM) blev afparaffiniseret i xylen, rehydreret i graduerede ethanol-løsninger og derefter Antigen hentning. blev udført i 10 mM citronsyre-buffer ved mikrobølgeopvarmning. Immunhistokemi blev udført ved anvendelse af anti-Twist1 antistoffer (Santa Cruz, 1:20) som tidligere beskrevet [19]. Ekspression af Twist1 blev defineret som positiv nuklear farvning i mere end 10% af cellerne, og intensiteten blev scoret som- (negativ), + (svag) og ++ (moderat til stærk) med tre undersøgere uafhængigt.

Resultater

Twist1 udtryk i murine og humane GC cellelinjer

fra DGC væv af DCKO mus, Twist1
transskription-positive cellelinier (MDGC-7, MDGC- 8 og MDGC-9) og negative cellelinier (MDGC-1 og MDGC-3) blev etableret (fig 1A og S2A fig), og ekspressionen af ​​Twist1 protein blev bekræftet i hver cellelinje (figur 1B). Twist1 ekspression blev forstærket ved mRNA og protein niveauer i Twist1 ekspressions-negative MDGC celler efter behandling med DNA-demethylering agent 5-aza-dC (Fig 1C og 1D), mens dets ekspression ikke blev ændret efter behandling med histondeacetylaseinhibitoren TSA (S2B fig). I de otte humane GC cellelinjer undersøgt, Twist1
udtryk blev nedreguleret på fire cellelinjer (Fig 1E, venstre), tre (KATO-III, GCIY og AGS), hvoraf viste re-aktivering af Twist1
ekspression efter behandling med 5-aza-dC ved RT-PCR (fx fig 1E, højre). Som for Twist1
udtryk-positive GC cellelinjer, efter 5-aza-dC behandling, 2.1- og 3.2 gange opregulering af Twist1
blev påvist i MKN45 og MKN7 henholdsvis ved QRT-PCR, mens Twist1 udtryk ikke blev ændret i MDGC-9 celler (fig 1F).

CGI methylering og udtryk for Twist1
i GC cellelinjer

Twist1
har en tæt CGI region fra promotoren til hele exon 1, idet denne region højt konserveret blandt hvirveldyr, herunder mus og menneske (S3 fig). For at tydeliggøre CGI i mus og menneske Twist1
, vi udførte beregningsmæssige analyse ved hjælp UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/index.html) og MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /), som er meget anvendt som identifikation af CGI og MSP primere [27]. Vi analyserede ca. 1,4 kb region, herunder promotoren og hele exon 1. UCSC Genome Browser på muse og human analyse udviste en CGI i regionen undersøgte (data ikke vist). formodede to CGI steder blev imidlertid påvist, i regionen i både mus og menneske, når vi anvendte kriterierne i CGI med GC-indhold på 50% og observeres /forventet CpG-forhold på 0,8 ved MethPrimer (Fig 2A og 2C). Disse to formodede CGI-områder blev placeret i promotoren og exon 1. Eftersom methylering ved promotorområdet er blevet rapporteret i forskellige humane cancere [12, 14], vi oprindeligt undersøgt status for methylering ved området i murine og humane GC cellelinier af MSP. Men status methylering ved promotor-regionen i Twist1
ikke svarede til sit udtryk i enhver GC cellelinjer undersøgt (område P1, Fig 2A). For at bestemme de kritisk methylerede regioner forbundet med Twist1 udtryk i MDGC celler, vi yderligere udført MSP på CGI-regionen i exon 1 (E1-1, E1-2 og E1-3), og den forudsagte CpG shore websted ligger cirka 1,6 kb fra TSS (afskrift startstedet, S1) (fig 2A). Som et resultat, CGI methylering ved området (E1-1 og E1-2) omkring TSS Twist1
exon 1 viste sig at svare til ekspression af genet i MDGC celler, men der var ingen sammenhæng mellem dem på den forudsagte shore region (S1) og enden af ​​exon 1 region (E1-3) (fig 2B, venstre) i MDGC celler. Ingen methylering blev påvist ved eventuelle CpG regioner i tre normal gastrisk slimhinder uden Twist1 udtryk fra Atp4b-Cre
^{-
; CDH1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
mus (Fig 2B). I human gastrisk slimhinder, ingen Twist1
methylering blev også fundet i tre ikke-kræft gastrisk slimhinder fra GC patienter (Fig 2D), hvoraf den ene viste meget svag Twist1
udtryk (data ikke vist ). Vi undersøgte også yderligere fire ikke-kræft gastrisk slimhinder fra GC patienter, mens ingen methylering blev påvist ved E1-2 region i sager (data ikke vist). Bisulfit sekventering (BS) viste, at CGI region i exon 1 viste tætte methylering i Twist1 ekspressions-negative MDGC-3-celler, men ikke i Twist1-positive MDGC-9 celler (BS-c, fig 2A og 2B, højre), mens der var ingen forskel i methylering mønstre mellem dem på CpG kysten og promotorområder (BS-a og BS-b, S4A fig). Blandt de menneskelige GC cellelinjer, KATO-III og GCIY uden Twist1
udtryk viste tætte CGI methylering på området af exon 1 (E1-2), som er i overensstemmelse med dem af mus Twist1
(fig 2C og 2D, venstre). Både methylering og unmethylation i E1-2-regionen blev detekteret i MKN7 og MKN45 celler ved MSP og bisulfit sekventering (fig 2D), som er basalt udtrykt Twist1 men deres ekspressionsniveauer blev forøget efter 5-aza-dC behandling (Fig 1F). Således er vores data viser, at methylering i exon 1 region Twist1
påvist i denne undersøgelse er korreleret til sit udtryk.}

Twist1
methylering og udtryk i DCKO mus GC vævsprøver

Vi undersøgte status methylering af Twist1
hjælp 18 primære GC væv fra 15 DCKO mus. Fordi GC regioner var meget små og deres DNA fra FFPE prøver viste lave koncentrationer, udførte vi nested MSP [25, 26]. Twist1
var signifikant methylerede (9/18, 50%) i primære GCS sammenlignet med tilsvarende ikke-kræft væv (1/10, 10%), at være statistisk signifikant forskel (P < 0,05, tabel 1). Repræsentative data fra MSP er vist i fig 3A. Blandt dem, 4 af 10 (40%) tilfælde var intramucosal og fem af 8 (62,5%) var invasive GC'er (tabel 1). I denne undersøgelse Twist1
methylering positive tilfælde demonstrerede methylerede MSP bands samt, som følge af tilstedeværelsen af ​​normale stromale /fibroblast og inflammatoriske celler i kræft vævssnit, selvom vi ikke kunne benægte muligheden for delvis methylering ligesom MKN45 og MKN7 og tumor heterogenitet.

Twist1 proteinekspression blev påvist i 7 af 18 (38,9%) GCS sammenlignet med tilsvarende ikke-kræft gastrisk slimhinder ved immunhistokemi. Repræsentative billeder er vist i fig 3B. Vi analyseret yderligere forholdet mellem Twist1
udtryk og methylering niveauer i disse tilfælde. Blandt de 18 primære GC undersøgt, viste ni tilfælde korrelation mellem Twist1
methylering og udtryk (figur 3C). Tre af fire tilfælde med Twist1 svag udtryk udstillet sin methylering, muligvis at lave udtryk for Twist1 kan være forårsaget af dets methylering. Men resterende fem sager udviste ingen methylering og udtryk (tabel 1).

histon methylering er relateret til reguleringen af ​​ Twist1
udtryk

Vi næste undersøgt, hvorvidt lysin methylering niveau af histon H3 bidrager til Twist1
ekspression. Chromatin immunopræcipitationsanalyser (chip) assays blev udført på den forudsagte CpG shore (CP1.3k), promotoren (CP1), og exonerne 1 (CE1-1 og CE1-2) og 2 (CE2) områder (fig 2A). På CP1 og CE1-2 regioner, blev aktiv histon-mærket H3K4me3 beriget i Twist1 ekspression-positive celler (MDGC-7 og MDGC-9), men inaktive histon mark H3K9me3 blev beriget i Twist1 ekspression-negative celler (MDGC-1 og MDGC -3) (fig 4A og 4B). Chip assays udstillet både H3K4me3 og H3K9me3 signaler i MDGC-1 og MDGC-3 celler med 5-aza-dC behandling, med angivelse af de forhøjede H3K4me3 niveauer i disse celler (Fig 4C). Tværtimod blev H3K27me3 og H3K36me2 niveauer ikke korreleret med Twist1 udtryk i nogen MDGC celler undersøgt i denne undersøgelse. Som for humane GC cellelinjer, en lignende region, som ligger fra promotor til exon 1 viste H3K4me3 berigelse i Twist1
udtryk-positive MKN45 celler, og H3K9me3 i Twist1
udtryk-negative KATO-III celler (fig 2C og 4D).

Suv39h1
og Suv39h2
, en histon methyltransferase, regulerer H3K9me3

Der er en masse af histon methyltransferaser forbundet med H3K4, H3K9 og H3K27 [28]. Derfor, for at afgøre, hvilken histon modifikation enzymer er ansvarlige for H3K4me3 eller H3K9me3 berigelse på Twist1
exon 1-region i GC celler, undersøgte vi ti H3K4me3 ( Mll1
, Mll2
, Mll3
, Mll4
, Setd1a
, Setd1b
, Ash1
, Ash1l
, Smyd3
Meisetz
), syv H3K9me3 ( Suv39h1
, Suv39h2
, G9A
, Setdb1
, Clld8
, GlP
RIZ1
), og én H3K27me3 ( EZH2
) relateret gener. Repræsentative data er vist i fig 5A. Blandt dem, ekspressionsniveauerne af Suv39h1
og Suv39h2
blev omvendt korreleret med Twist1
udtryk. Imidlertid blev ekspressionsniveauerne af resterende 16 histon methylatasferase gener undersøgte ikke forbundet med Twist1
udtryk i MDGC celler. Vi udførte siRNA-baserede knockdown af Suv39h1
eller Suv39h2
i de respektive udtryk-positive MDGC-1 og MDGC-3 celler ved elektroporation (figur 5B). Knockdown af Suv39h1
eller Suv39h2
i disse cellelinjer ført til en stigning på Twist1
udtryk observerbare på RT-PCR (Fig 5B) og QRT-PCR (MDGC- 1, fig 5C)

Foreningen af ​​Sp1 med den transkriptionelle regulering af Twist1

konsensus 5 '-. (G /T) GGGCGG (G /A) ( G /a) (C /T) -3 'sekvens er kendt som den bindende motiv af Sp1 transkriptionsfaktor, og et forhold mellem CGI methylering og Sp1-binding i promotoren er blevet beskrevet [29, 30]. Flere Sp1 bindingssteder blev forudsagt i CpG-rige region i Twist1
exon 1 med TFBIND (http://tfbind.hgc.jp) og Jaspar (http://jaspar.binf.ku.dk) . Rolle Sp1 i transskription af Twist1
blev derefter undersøgt med henvisning til epigenetisk modifikation af genet. Vi har detekteret udtryk for Sp1 mRNA og protein i alle undersøgte murine og humane GC celler, selv i Twist1 udtryk-negative MDGC-1, MDGC-3, KATOIII og GCIY celler (Fig 6A).

For at afgøre, hvorvidt ikke Sp1 bindes til regionerne i Twist1
promotor og exon 1 i GC celler, vi udførte chip assay af Sp1 hjælp MDGC celler (fig 2A). Sp1 bundet til regionerne i Twist1
promotor (CP1) og exon 1 (CE1-2) i Twist1 udtryk-positive cellelinier (MDGC-7 og MDGC-9) (Fig 6B). I modsætning hertil Twist1 ekspressions-negative cellelinier (MDGC-1 og MDGC-3) viste ikke-detekterbare niveauer af Sp1 bindende signaler ved CP1 og CE1-2 regioner. Sp1 ikke binde sig til nogen områder af den forudsagte CpG kysten (CP1.3k) og exon 2 (CE2) regioner i disse Twist1 udtryk-positive og -negative MDGC celler. Demethylering med 5-aza-dC øgede Sp1 binding på Twist1
promotor og exon 1-regioner i Twist1 udtryk-negative MDGC-1 og MDGC-3-celler (Fig 6B). Mithramycin A vides at interferere med SP1-binding til CpG-rige regulatoriske sekvenser [31, 32]. Det blev bemærket, at Twist1
udtryk blev nedreguleret efter behandling med mithramycin A i sit udtryk-positive GC-celler (MDGC-7, MDGC-9, MKN7 og MKN45 celler) (Fig 6C og S6 Fig). Mithramycin A viste ikke nogen effekt på Sp1 ekspression i disse celler (data ikke vist). Opregulering af Twist1
med 5-aza-dC blev reduceret med mithramycin En behandling i MDGC-3 celler (P = 0,04, figur 6D).

Diskussion

de mekanismer, der ligger til grund epigenetisk regulering af onkogen er dårligt forstået. Forholdet mellem methylering status på Twist1
promotorområder og udtryk for Twist1
er kontroversiel, og der er næsten ingen af ​​rapporter om ændret histon modifikation i Twist1
udtryk. Således er det fortsat usikkert, om epigenetiske ændringer er relateret til Twist1
aktivering i kræftceller. Som nye fund i denne undersøgelse, vi belyst den Twist1
reguleringsmekanisme underliggende fundamentale epigenetisk maskiner at DNA methylering, histon modifikation og Sp1 handle i koncert med Twist1 udtryk i GC celler.

Det er almindeligt kendt, at DNA-methylering på CGI promotorregionen er kritisk for gendæmpning, og afvigende CGI methylering resulterer i tab af ekspression af forskellige GTS [10]. Twist1 blev genaktiveres i både murine og humane GC-celler med 5-aza-dC behandling i denne undersøgelse, hvilket indikerer, at transskriptionel aktivering af Twist1 også moduleres ved DNA-methylering. CGI methylering af Twist1
promoter region er blevet fundet i forskellige kræftformer såsom gastrisk, bryst, kolorektal og lunge dem [11, 12, 14], hvoraf de fleste viste ingen sammenhæng mellem Twist1
methylering og udtryk. Vi observerede, CGI-methylering i Twist1
exon 1, bortset i promotorregionen svarede til dets gen-ekspression i muse GC-celler. Som for humane GC cellelinier, Twist1
ekspressions-negative cellelinjer var fuldt methyleret, men dets udtryk-positive cellelinjer udviste både methylering og unmethylation af Twist1
, som alle opreguleret Twist1
udtryk efter 5-aza-dC behandling (fig 1F). Disse data indikerer, at MKN45 og MKN7 celler viste delvis methylering af Twist1
, og halvdelen niveauer af Twist1
udtryk blev basalt påvist i disse celler, som blev udtrykt fra umethyleret DNA allel. De seneste rapporter viste, at CpG shore methylering er relateret til genekspression [7, 33]. Imidlertid blev status methylering på det forudsagte CpG shore websted region ikke korreleret med Twist1
udtryk. Vores data viser, at Twist1
er epigenetisk bragt til tavshed af DNA methylering i murine og humane GC cellelinjer.

Ifølge den beregningsmæssige analyse af mus og human CGI'er fra promotoren til hele den kodende region i Twist1
gen, to formodede CGI-områder blev placeret i promotoren og exon 1 af MethPrimer analyse. Her observerede vi, at CGI methylering i exon 1, snarere end dens promoter region, blev korreleret med Twist1
udtryk i GC celler. Sådanne distinkte mønstre for methylering associeret med gendæmpning er blevet rapporteret i adskillige gener [26, 34, 35]. For eksempel, SOX2
AP2α
udstillet formodede to CGI'er på promotoren og exon 1, og methylering på exon 1 region har vist sig at være signifikant korreleret til sin genekspression i GC'ers og bryst cancere [34, 35]. Det blev rapporteret, at CGI methylering omkring det translationelle startsted i retinsyrereceptor beta (RAR-ß) -gen dramatisk svarede til dets ekspression i murine lungecancere forhold til methylering ved promotorområdet beliggende i samme CGI [26]. Således er vores data antyder, at CGI methylering ved exon 1-region i Twist1
er vigtigt for dets gen silencing i GC-celler. Det er imidlertid ukendt mekanismen ved denne afvigende methylering mellem promotoren og exon 1-regioner. Adskillige transcriptionsfaktor bindingssites, såsom Sp1 elementer og histon modifikation er blevet rapporteret til at beskytte CGI methylering [36, 37]. Det er vigtigt at undersøge disse elementer og epigenetiske maskiner i CGI regioner Twist1
yderligere.

I primær GC'er fra DCKO mus, 50% af GC'ers udstillede Twist1
methylering af indlejret MSP. Vores DCKO mus viser parietale celle-relaterede atypisk foci i maven, og intramucosal DGCs sammensat af dårligt differentierede celler og signetring celler ofte opdages ved 6 måneder. Derfor har vi tidligere foreslået, at vores DGCs i DCKO mus udviklede gennem parietalcellen afstamning [19]. Twist1
blev methyleret i 40% af intramucosal kræftformer, mens hyppigheden af ​​methylering i ikke-kræft gastrisk slimhinder, herunder atypisk foci var sjældne (10%), hvilket indikerer, at Twist1
methylering er en tidlig begivenhed i DGC carcinogenese i vores musemodel. Blandt de 18 primære GCS undersøgte, fem tilfælde var begge Twist1
methylation- og udtryk-negative.

• PLoS ONE: Statiner dæmpe Helicobacter pylori CagA translokation og Reducer Forekomsten af ​​gastrisk kræft: In vitro og populationsbaseret case-control studier
• PLoS ONE: Endoskopisk resektion Sammenlignet med gastrektomi til behandling Early Gastric Cancer: en systematisk gennemgang og meta-analyse