Abstract
TWIST1 overexpressie wordt vaak waargenomen in verschillende soorten kanker, waaronder maagkanker (GC). Hoewel DNA-methylatie van de TWIST1 Visum: Sakamoto A, Akiyama Y, Shimada S, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka S (2015) DNA-methylatie in de Exon 1 Gewest en Complex verordening van TWIST1 Expressie in Gastric kankercellen. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10.1371 /journal.pone.0145630 Editor: Tae-Young Roh, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), de Republiek Korea Ontvangen: 21 september 2015; Aanvaard: 6 december 2015; Gepubliceerd: 22 december 2015 Copyright: © 2015 Sakamoto et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek (C) (24590444) en (A) (25253081), en de A3 foresight Program (AA005) van de Japan Society voor de Bevordering van de Wetenschap (JSPS) en het Praktijkonderzoek voor innovatieve Cancer control (15Ack0106017h0002) uit Japan Agentschap voor medisch Onderzoek en Ontwikkeling, AMED; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html. tegenstrijdige belangen: De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan Afkortingen:. BS, bisulfiet sequencing; CGI, CpG eiland; CHIP, chromatine immunoprecipitatie; DCKO, dubbele conditionele knockout muis; DGC, diffuse-type maagkanker; GAPDH, glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase; GC, maagkanker; H3K4me3, histon H3 lysine 4 tri-methylatie; H3K9me3, histon H3 lysine 9 tri-methylatie; H3K27me3, histon H3 lysine 27 tri-methylatie; MSP methylatie-specifieke polymerase kettingreactie; RT-PCR, reverse transcriptie-polymerase kettingreactie; qRT-PCR, kwantitatieve RT-PCR; GTS, tumor suppressor genen; TSS, transcript start site; 5-aza-dc, 5-aza-2'-deoxycitidine Introductie TWIST1, als een basis helix-loop-helix transcriptiefactor, direct bindt aan E-box elementen (NCANNTGN ) specifieke doelwitgenen [1]. TWIST1 is bekend essentieel mesoderm formatie tijdens vroege embryonale ontwikkeling van Drosophila en muis [2, 3]. Bij menselijke kankers is TWIST1 ectopische expressie in verband gebracht met maligne progressie, invasie, epitheliale naar mechencymal overgang, metastase en stemness, duidend op mogelijke oncogene functies van TWIST1 [4-6]. Derhalve is het zeer belangrijk om de transcriptionele regulerende mechanismen TWIST1 verduidelijken kankercellen. epigenetische veranderingen, zoals DNA methylering en histon modificatie, zijn nauw verbonden met genuitschakeling [7-9]. Hoewel epigenetische veranderingen in de CGI (CpG island) promotorgebied van tumorsuppressorgenen (GTS) zijn bekend te worden geassocieerd met hun geninactivatie [10], worden de mechanismen van epigenetische regulatie van oncogenen slecht begrepen. Verschillende groepen hebben aangetoond dat TWIST1 Transcriptionele regulatie van genen gecorreleerd met lysine (K) methylatie patronen in de histone staart die bestaan uit drie verschillende lysine methylering toestanden (mono-, di- en tri-). Tri-methylatie van H3K4 (H3K4me3) heeft betrekking op genactivatie en die van H3K9me3 en H3K27me3 te genrepressie [7-9]. Hoewel deze drie histon H3-methyaltion patronen worden verbonden CGI methylering ook de transcriptionele regulerende mechanismen TWIST1 GC is de tweede meest voorkomende doodsoorzaak door kanker ter wereld [16]. GC wordt ingedeeld in twee histologische types; diffuse en darmen, die twee verschillende routes kankerverwekkend zijn [17]. Diffuse type maagkanker (DGC) is bekend dat frequent invasie en metastase vertonen, wat resulteert in een slechte prognose [18]. Verlies van E-cadherine en p53 gerapporteerd in diffuse type maagkanker [19-21]. Uit verschillende rapporten blijkt frequent overexpressie van TWIST1 in menselijke DGCs [22, 23]. We hebben eerder gemanipuleerde een dubbele voorwaardelijke knockout (DCKO) muis lijn als naar E-cadherine en p53, die specifiek in de maag worden geïnactiveerd [ ,,,0],19]. Alle DCKO muizen ontwikkelden fataal DGCs binnen een jaar, de fenotypes hoog het invasief en frequente uitzaaiingen naar de lymfeklieren. Het is opmerkelijk dat de genexpressie patronen van DGCs in de DCKO muizen waargenomen op microarray analyse waren vergelijkbaar met de menselijke darm anders dan degenen primaire DGCs. Aldus onze DCKO muismodel is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van de rol van genfunctie in DGC carcinogenese en ontwikkeling van een therapeutische strategie. In deze studie hebben we vastgesteld TWIST1 expressie-positieve en -negatieve DGC cellijnen die zijn afgeleid van de DCKO muizen. Als gevolg van de analyse van epigenetische veranderingen, de gemeenschappelijke reguleringsmechanisme van TWIST1 Ethics Verklaring Alle in vivo We eerder vastgestelde een E-cadherine /p53 DCKO ( Atp4b-Cre Achttien primaire GC weefsels en overeenkomstige. goedaardige gastrische mucosae werden verkregen van 15 DCKO muizen. Voor menselijke maag weefsels, gebruikten we drie goedaardige gastrische mucosa van patiënten GC. We hebben ook verkregen vijf normale maag slijmvliezen van Atp4b-Cre Totaal RNA werd geïsoleerd met de RNeasy Mini kit (Qiagen,˥34) en cDNA werd bereid uit RNA met een SuperScript III kit (Invitrogen;´80044) volgens de protocollen van de fabrikant. Eindpunt RT-PCR uitgevoerd met meerdere cyclus nummers, 28-35 cycli. Als een interne controle, glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase ( GAPDH We gewonnen genoom DNA van muizen en humane GC cellijnen door het fenol-chloroform-methode, en vervolgens uitgevoerd bisulfiet modificatie en de MSP procedure. Bisulfiet behandeling van DNA werd uitgevoerd met EZ DNA methylatie-Gold (Zymo RESEARCH; # D5006), en vervolgens methylatie-specifieke PCR (MSP) werd uitgevoerd. Kort samengevat, werd de PCR-reactie uitgevoerd gedurende 35 cycli bij 25 pi mengsel dat bisulfiet-gemodificeerd DNA, 2.5μl 10x PCR-buffer, 1,25 pl 25 mM dNTP, 25 pmol /l van elke primer en 1 U van JumpStart RedTaq polymerase (Sigma; # D0563). De omstandigheden voor PCR waren als volgt: 95 ° C gedurende 5 minuten; 35 cycli van 95 ° C gedurende stapjes van 1 minuut, 53 ° C voor 2 minuten en 72 ° C gedurende 1.5minutes; en een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten. Voor muis GC weefsels, werd DNA geëxtraheerd uit in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) weefsel. Bisulfiet DNA werd geamplificeerd met flankerende PCR primers en geneste MSP werd uitgevoerd [25, 26]. De primer sequenties en PCR-product maten zijn weergegeven in tabel S2 Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assay De chip test werd uitgevoerd met behulp van een chip-IT Express kit (Active Motif;Ȓ08). volgens het protocol van de fabrikant. Immunogeprecipiteerd DNA verrijking werd genormaliseerd met betrekking tot de invoer. De antilichamen gebruikt in deze studie waren anti-histon H3K4me3 (Active Motif,Ə15), anti-H3K9me3 (Active Motif,ƍ65), anti-H3K27me3 (Active Motif,Ƈ55), anti-H3K36me2 (Abcam; # ab9049) , anti-Sp1 (Abcam; # ab13370), en anti-histon H3 (Active Motif;Ƈ63) antilichamen. Normaal konijn IgG (Cell Signaling Technology;Đ9s) werd gebruikt als een negatieve controle voor de chip. De primer sequenties en PCR-product maten zijn weergegeven in tabel S2. -siRNA gebaseerde knockdown van Suv39h1 Kopen en Suv39h2 GC cellen werden gelyseerd met Pierce RIPA buffer (Thermo wetenschappelijke;00). Eiwitten werden gescheiden op SDS-polyacrylamidegels en vervolgens overgebracht naar polyvinylideenfluoride (PVDF) membranen, gevolgd door incubatie met antilichamen opgelost in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) dat 2% afgeroomde melk en 10% Tween 20. De primaire antilichamen gebruikt in deze studie werden muizen monoklonaal anti-TWIST1 (1: 100, Santa Cruz Bio-technologie; # sc-81417), konijn polyklonaal anti-Sp1 (1: 200, Active Motif;Ɔ58), en de muis monoklonaal anti-α-tubuline ( 1: 200, Santa Cruz, # sc-8035) antilichamen. De secundaire antilichamen waren aan alkalische fosfatase geconjugeerd anti-konijn IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories,.706.518) en anti-muis IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories,.706.520). Blots werden ontwikkeld met ImmunoStar AP substraat (Bio-Rad Laboratories,.705.018) Immunohistochemie FFPE secties (4 uM) werden van paraffine ontdaan in xyleen, gerehydrateerd in gegradeerde ethanoloplossingen en antigen herstel. werd uitgevoerd in 10 mM citroenzuur buffer van de magnetron. Immunohistochemie werd uitgevoerd met behulp van anti-TWIST1 antilichamen (Santa Cruz, 01:20) zoals eerder beschreven [19]. Expressie van TWIST1 werd gedefinieerd als positieve nucleaire kleuring in meer dan 10% van de cellen en de intensiteit werd gescoord as- (negatief), + (zwak) en ++ (matige tot sterke) drie onderzoekers onafhankelijk. Resultaten TWIST1 expressie in muizen en humane GC cellijnen van DGC weefsels van DCKO muizen, TWIST1 CGI methylering en expressie van TWIST1 TWIST1 We hebben gekeken naar de methylatie status van de TWIST1 TWIST1 eiwit expressie werd gedetecteerd in 7 van de 18 (38,9%) GC in vergelijking met overeenkomstige niet-kwaadaardige maag slijmvliezen door immunohistochemie. Representatieve beelden worden getoond in Fig 3B. We verder geanalyseerd de relatie tussen de TWIST1 Vervolgens onderzochten we of het lysine methylatie niveau van histon H3 draagt bij aan TWIST1 Suv39h1 Kopen en Suv39h2 Er zijn veel histon methyltransferases geassocieerd met H3K4, H3K9 en H3K27 [28]. Daarom, om te bepalen welke histon-eiwitten enzymen die verantwoordelijk zijn voor de H3K4me3 of H3K9me3 verrijking aan de TWIST1 Vereniging van Sp1 met de transcriptionele regulatie van TWIST1 de consensus 5 '-. (G /T) GGGCGG (G /A) ( G /a) (C /T) -3 'sequentie bekend als de bindende motief van Sp1 transcriptiefactor en een relatie tussen CGI methylatie en Sp1 binding aan de promotor is beschreven [29, 30]. Meerdere Sp1 bindingsplaatsen werden voorspeld in de CpG-rijk gebied binnen TWIST1 Om te bepalen of SP1 niet bindt aan de regio's van de TWIST1 de mechanismen die ten grondslag liggen aan epigenetische regulatie van oncogen zijn slecht begrepen. De relatie tussen de methylatie status van de TWIST1 Het is op grote schaal bekend dat DNA methylatie op de CGI promotorgebied is essentieel voor gen-silencing en CGI afwijkende methylering leidt tot verlies van expressie van verschillende GTS'en [10]. TWIST1 werd gereactiveerd in zowel muis en mens GC cellen met 5-aza-dC behandeling in dit onderzoek geeft aan dat transcriptionele activering van TWIST1 ook gemoduleerd door DNA methylering. CGI methylering van de TWIST1 Volgens de computationele analyse van muis en mens CGI van de promotor gehele coderende gebied in de TWIST1 In het primair GC van DCKO muizen, 50% van GC's tentoongesteld TWIST1
gen is gerapporteerd in kankercellen, de mechanismen die ten grondslag liggen aan transcriptionele activatie blijven onzeker. In deze studie hebben we eerst onderzocht epigenetische veranderingen van de TWIST1
met TWIST1
transcriptie-positieve en -negatieve cellijnen die zijn afgeleid van onze gevestigde diffuse-type GC muismodel. Behandeling met een DNA-demethylering middel 5-aza-dc-re geactiveerd TWIST1 expressie in TWIST1 expressie-negatieve GC cellen. Volgens methylatie-specifieke PCR en bisulfiet sequencing analyse, methylatie op de CpG-rijk gebied binnen TWIST1
codering exon 1, in plaats van de promotorregio, werd nauw verbonden met transcriptionele silencing van de TWIST1
expressie in muizen GC cellen. Chromatine immunoprecipitatie assays bleek dat actieve histon merk H3K4me3 werd verrijkt in TWIST1 expressie-positieve cellen, en inactieve histon mark H3K9me3 werd verrijkt in TWIST1 expressie-negatieve cellen. De expressie niveaus van Suv39h1 Kopen en Suv39h2
, histone methyltransferases voor H3K9me3 werden omgekeerd gecorreleerd met de TWIST1
expressie en knock-down van de Suv39h1 golfreizen of Suv39h2
geïnduceerde TWIST1
expressie. Bovendien Sp1 transcriptiefactor gebonden aan het exon 1 CpG-rijk gebied in TWIST1 expressie-positieve cellijnen en TWIST1
expressie werd verminderd door mithramycin, waarbij die interfereert met Sp1 binding aan CpG-rijke regulerende sequenties. Onze studies gesuggereerd dat de TWIST1
transcriptie in GC cellen zou kunnen worden geregeld door middel van een mogelijke samenwerking van DNA-methylatie, histon-eiwitten in complex met SP1 binding aan CpG-rijke regio's in de exon 1 regio.
werd opnieuw geactiveerd door behandeling met een de-methylatie geneesmiddel, 5-aza-2'-deoxycitidine (5-aza-dC) in kankercellen [11, 12]. Afwijkende DNA-methylatie in de CGI-promotor in de menselijke TWIST1
is vaak aangetroffen in de primaire kanker waaronder maagkanker (GC) [11-14]. Toch zijn er veel bevindingen die DNA methylatie op de TWIST1
promotorgebied niet gecorreleerd met expressie van het gen in verschillende soorten kanker [12, 14]. Terwijl TWIST1
methylatie kan een nuttig biomarker voor de klinische resultaten met betrekking tot recidief en overleving bij patiënten voorspellen kanker [12, 13, 15], het blijft controversieel of de TWIST1
methylering bij het promotorgebied leidt tot onderdrukking van het gen.
onderliggende histon-eiwitten worden slecht begrepen in kankercellen.
opgehelderd, en geëvalueerd in zowel muis en mens DGCs in deze studie.
Materialen en Werkwijzen
procedures werden door de Animal Care Committee van Tokyo Medical en Dental University (Permission No. 0160073A) goedgekeurd. Zoals voor normale menselijke maag slijmvliezen monsters werd geschreven geïnformeerde toestemming verkregen van alle vakken, en de studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Tokyo Medical en Dental University (No.1115).
celculturen en weefselmonsters
+
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
) muismodel [19]. Van zijn het kankerweefsel, hebben we vijf muis DGC cellijnen en noemde hen MDGCs (Shimada S, niet-gepubliceerde waarneming). MDGC-1 en MDGC-3-cellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met hoge glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum en MDGC-7, MDGC-8 en MDGC-9 werden gekweekt in Ham's F12 aangevuld met 5% paardenserum. DNA-analyse werd uitgevoerd om de afgekapt Cdh1
en op te sporen Trp53
allelen (S1 afb). GC acht humane cellijnen (KATO III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 en HSC60) werden ook gebruikt in dit onderzoek. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY en KATO-III werden aangekocht van RIKEN celbank (Tsukuba, Japan). NUGC4 en AGS-cellen werden verkregen van de Human Science Research Resources Bank (Osaka, Japan) en ATCC (American Type Cell Collection). HSC60 cellen werden verkregen van Dr. Kazuyoshi Yanagihara (National Cancer Research Center, Tokyo, Japan) [24]. KATO III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS en HSC60 cellen werden gekweekt in RPMI 1640, en GCIY werd gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, beide werden gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum. Voor de-methylatie studies, murine en humane GC cellen werden dagelijks behandeld met 500 nM 5-aza-deoxycytidine (5-aza-dC, Sigma, # A3656) gedurende 72 uur. We behandelden deze AV cellen met 100 nM trichostatine A (TSA, Wako;È-11.993) gedurende 24 uur of 100 nM mithramycine A (Wako;„-17.101) gedurende 24 uur
-
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
muizen die werden gebruikt als negatieve controles in onze vorige studie [19]. In deze studie, genaamd wij "normale gastrische mucosa" als monsters werden verkregen van controlemuizen en "niet-carcinomateuze maag mucosae" als monsters werden verkregen van muizen en menselijke DCKO GC patiënten in deze studie.
Reverse transcriptie (RT) -PCR en kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR)
) werd geamplificeerd met 21 cycli cDNA kwaliteit en hoeveelheid van elk RT-PCR te verzekeren. De geamplificeerde producten werden geladen in 2% agarose gels of gekwantificeerd door kwantitatieve RT-PCR met behulp LightCycler DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics;/07516001). Het amplificatie programma voor PCR werd herhaald voor 40 cycli voor GAPDH en 45cycles andere genen behalve voor GAPDH. PCR-producten werden in de pMD20 T-vector gekloneerd via een Mighty TA kloneersamenstel (TaKaRa BIO INC;ɚ8) en direct gesequenced. De primer sequenties en PCR-product maten zijn weergegeven in tabel S1.
Methylering Analyse
Knockdown analyse met behulp van kleine interfererende RNA
werd uitgevoerd met een elektroporatie (Neon transfectiesysteem, Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. MDGC cellen werden getransfecteerd met 50 nM siRNA Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226) of negatieve controle siRNA (siRNA Mission Universal Negatieve controle, Sigma). Na 48 uur kweken werden de cellen geoogst voor RT-PCR, Western blot analyses, migratie, invasie, en proliferatie assay.
Western Blot-analyse
transcriptie-positieve cellijnen (MDGC-7, MDGC- 8 en MDGC-9) en negatieve cellijnen (MDGC-1 en MDGC-3) werden vastgesteld (figuur 1A en figuur S2A) en de expressie van TWIST1 eiwit werd bevestigd in elke cellijn (figuur 1B). TWIST1 expressie werd versterkt op het mRNA en eiwit niveaus in TWIST1 expressie-negatieve MDGC cellen na behandeling met DNA demethylering middel 5-aza-dc (Fig 1C en 1D), terwijl de expressie niet werd veranderd na de behandeling met histondeacetylaseremmer TSA (S2B fig). In de acht menselijke GC cellijnen onderzocht, TWIST1
expressie werd gedownreguleerd in vier cellijnen (figuur 1E, links), drie (KATO-III, GCIY en AGS) waarvan aangetoond dat de re-activatie van TWIST1
expressie na behandeling met 5-aza-dC door RT-PCR (bijvoorbeeld figuur 1E, rechts). Zoals voor TWIST1
expressie-positieve GC cellijnen, na 5-aza-dc behandeling, 2.1- en 3.2-voudig up-regulatie van TWIST1
werd gedetecteerd in MKN45 en MKN7, respectievelijk, door qRT-PCR, terwijl TWIST1 expressie niet werd veranderd in MDGC-9 cellen (Fig 1F).
in GC cellijnen
heeft een dichte CGI gebied van de promotor om de volledige exon 1, wordt deze regio sterk geconserveerd onder gewervelde dieren met inbegrip van muis en mens (S3 figuur). Om de CGI in muizen en mensen TWIST1
verduidelijken, voerden we computationele analyse met behulp van UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/index.html) en MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /) die op grote schaal wordt gebruikt als identificatie van CGI en MSP primers [27]. We analyseerden ongeveer 1,4 kb met inbegrip van de promoter en de gehele exon 1. UCSC Genome Browser op muis en menselijke analyse vertoonde een CGI in het onderzochte gebied (gegevens niet getoond). Er werden echter twee putatieve CGI plaatsen in zowel muis als mens regio gedetecteerd wanneer we de criteria van CGI met GC-gehalte van 50% en waargenomen /verwachte CpG verhouding van 0,8 door MethPrimer (figuur 2A en 2C). Deze twee vermoedelijke CGI's zich bevinden op de promotor en exon 1. Aangezien de methylering van het promotorgebied gerapporteerd in verschillende menselijke kankers [12, 14], we aanvankelijk onderzocht de methyleringsstatus in het gebied van muis en humane cellijnen GC door MSP. De methylatie status op het promotorgebied van TWIST1
niet overeen met de expressie in alle onderzochte cellijnen GC (regio P1, Figuur 2A). Om de kritisch gemethyleerde regio's geassocieerd met TWIST1 expressie in MDGC cellen te bepalen, we verder uitgevoerd MRO op de CGI gebied in exon 1 (E1-1, E1-2 en E1-3), en de voorspelde CpG shore site bevindt zich op ongeveer 1,6 kb uit TSS (transcript start site, S1) (fig 2A). Hierdoor CGI methylering bij het gebied (E1-1 en E1-2) rond de TSS TWIST1
exon 1 overeenkwam om expressie van het gen in MDGC cellen, maar er was geen correlatie tussen ze op de voorspelde shore gebied (S1) en het uiteinde van het exon 1 gebied (E1-3) (figuur 2B, links) in MDGC cellen. Geen methylering werd gedetecteerd op elk CpG gebieden in drie normale maag slijmvliezen zonder TWIST1 expressie van Atp4b-Cre
-
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
muizen (figuur 2B). In humane gastrische mucosa, geen TWIST1
methylering werd ook gevonden drie goedaardige gastrische mucosa van patiënten GC (figuur 2D), waarvan toonde zeer zwakke TWIST1
expressie (gegevens niet getoond ). We onderzochten ook extra vier goedaardige gastrische mucosa van GC patiënten, terwijl geen methylering op regio E1-2 enkele gevallen werd gedetecteerd (gegevens niet getoond). Bisulfiet sequencing (BS) aangetoond dat de CGI regio in exon 1 toonde dichte methylatie in TWIST1 expressie-negatieve MDGC-3-cellen, maar niet in TWIST1-positieve MDGC-9 cellen (BS-c, Fig 2A en 2B, rechts), terwijl er was geen verschil in de methylatie patronen tussen hen op de CpG kust en promotergebieden (BS-a en BS-b, Fig S4A). Onder de menselijke GC cellijnen, KATO-III en GCIY zonder TWIST1
expressie toonde dichte CGI methylatie op het gebied van exon 1 (E1-2), die in overeenstemming is met die van de muis TWIST1
(Fig 2C en 2D, links). Zowel methylatie en unmethylation regio E1-2 werden gedetecteerd in MKN7 en MKN45 cellen door MSP en bisulfiet sequencing (figuur 2D) die basaal expressie TWIST1 maar hun expressieniveaus werden verhoogd na 5-aza-dC behandeling (Figuur 1F). Zo, onze gegevens blijkt dat methylering in de exon 1 regio TWIST1
ontdekt in deze studie is gecorreleerd aan de expressie.
TWIST1
methylatie en expressie in DCKO muis GC weefselmonsters
met behulp van 18 primaire GC weefsels van 15 DCKO muizen. Omdat GC's waren erg klein en hun DNA uit FFPE monsters toonden lage concentraties, voerden we geneste MSP [25, 26]. TWIST1
significant gemethyleerd (9/18, 50%) in primaire GCs vergelijking met overeenkomstige niet-kankerachtige weefsels (1/10, 10%), statistisch significant verschil (P < 0,05, tabel 1). Representatieve gegevens van MSP zijn weergegeven in figuur 3A. Onder hen, 4 of 10 (40%) gevallen waren darmslijmvlies en 5 van 8 (62,5%) waren invasieve GC (tabel 1). In deze studie, TWIST1
methylering-positieve gevallen aangetoond ongemethyleerde MSP bands ook, die door de aanwezigheid van normale stromale /fibroblast en ontstekingscellen in kankerweefsel secties, hoewel we de mogelijkheid van een gedeeltelijke methylatie niet kan ontkennen zoals MKN45 en MKN7 en tumor heterogeniteit.
expressie en methylatie niveaus in deze gevallen. Onder de 18 primaire GC onderzocht, negen gevallen bleek correlatie tussen de TWIST1
methylering en expressie (figuur 3C). Drie van de vier gevallen TWIST1 zwakke expressie vertoonden de methylatie, mogelijk dat lage expressie van TWIST1 kan worden veroorzaakt door de methylatie. Echter, de resterende vijf gevallen vertoonden geen methylering en expressie (tabel 1).
histon methylatie is gerelateerd aan de regulering van de TWIST1
uitdrukking
expressie. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) werden onderzocht aan de voorspelde CpG shore (CP1.3k), promotor (CP1) en exons 1 (CE1-1 en CE1-2) en 2 (CE2) gebieden (figuur 2A). Aan de CP1 en CE1-2 regio's, werd actieve histon mark H3K4me3 verrijkt in TWIST1 expressie-positieve cellen (MDGC-7 en MDGC-9), maar inactief histon mark H3K9me3 werd verrijkt in TWIST1 expressie-negatieve cellen (MDGC-1 en MDGC -3) (figuur 4A en 4B). ChIP assays vertoonden zowel H3K4me3 en H3K9me3 signalen in MDGC-1 en MDGC-3-cellen met 5-aza-dc behandeling, met vermelding van de verhoogde H3K4me3 niveaus in deze cellen (Figuur 4C). Daarentegen werden de H3K27me3 en H3K36me2 niveaus niet gecorreleerd met TWIST1 expressie in elke MDGC cellen onderzocht in deze studie. Zoals voor menselijke GC cellijnen, een soortgelijk gebied gelegen van de promotor met exon 1 toonde H3K4me3 verrijking in TWIST1
expressie-positieve MKN45 cellen en H3K9me3 in TWIST1
expressie-negatieve KATO-III cellen (figuren 2C en 4D).
, een histone methyltransferase, regelt H3K9me3
exon 1 regio in GC cellen onderzochten we tien H3K4me3 ( Mll1
, Mll2
, Mll3
, Mll4
, Setd1a
, Setd1b
, Ash1
, Ash1l
Smyd3 Kopen en Meisetz
), zeven H3K9me3 ( Suv39h1
, Suv39h2
, G9a
, Setdb1
, Clld8
, Glp Kopen en Riz1
), en één H3K27me3 ( Ezh2
) gerelateerde genen. Representatieve gegevens worden getoond in Fig 5A. Onder hen, de expressie van Suv39h1 Kopen en Suv39h2
werden omgekeerd gecorreleerd met de TWIST1
expressie. Echter, de expressieniveaus van de resterende 16 histon methylatasferase onderzochte genen niet geassocieerd met TWIST1
MDGC expressie in cellen. We voerden-siRNA gebaseerde knockdown van Suv39h1 golfreizen of Suv39h2
in de respectievelijke expressie-positieve MDGC-1 en MDGC-3-cellen door elektroporatie (figuur 5B). Knockdown van Suv39h1 golfreizen of Suv39h2
in deze cellijnen geleid tot een toename van de TWIST1
expressie waarneembaar op RT-PCR (figuur 5B) en qRT-PCR (MDGC- 1, figuur 5C)
exon 1 met TFBIND (http://tfbind.hgc.jp) en JASPAR (http://jaspar.binf.ku.dk) . De rol van Sp1 in de transcriptie van TWIST1
werd vervolgens onderzocht aan de hand van epigenetische modificatie van het gen. Detecteerden we Sp1 expressie van mRNA en eiwit in alle muizen en menselijke cellen GC onderzocht, zelfs in TWIST1 expressie-negatieve MDGC-1, 3-MDGC, KATOIII en GCIY cellen (Figuur 6A).
promotor en exon 1 in GC cellen, voerden we ChIP assay van Sp1 gebruik MDGC cellen (figuur 2A). Sp1 gebonden aan de regio's van de TWIST1
promoter (CP1) en exon 1 (CE1-2) in TWIST1 expressie-positieve cellijnen (MDGC-7 en MDGC-9) (Fig 6B). In tegenstelling TWIST1 expressie-negatieve cellijnen (MDGC-1 en MDGC-3) blijkt niet op te sporen niveaus van Sp1 binding signalen aan de CP1 en CE1-2 regio's. Sp1 niet binden aan elke regio van de voorspelde CpG shore (CP1.3k) en exon 2 (CE2) regio's in deze TWIST1 expressie-positieve en -negatieve MDGC cellen. Demethylering met 5-aza-dc verhoogde Sp1 binding bij de TWIST1
promotor en exon 1-regio's in de TWIST1 expressie-negatieve MDGC-1 en MDGC-3-cellen (figuur 6B). Mithramycine A is bekend interfereren met Sp1 binding aan CpG-rijke regulerende sequenties [31, 32]. Er werd opgemerkt dat TWIST1
expressie omlaag gereguleerd na behandeling met mithramycine A in de expressie-positieve cellen GC (MDGC-7, MDGC-9, MKN7 en MKN45 cellen) (Figuur 6C en fig S6). Mithramycine A had geen gevolgen voor Sp1 expressie in deze cellen vertonen (gegevens niet getoond). Up-regulering van de TWIST1
met 5-aza-dC werd afgenomen door mithramycine Een behandeling in MDGC-3-cellen (P = 0,04, figuur 6D).
Discussie
promoter regio's en de expressie van TWIST1
is controversieel, en er zijn bijna geen van de verslagen over veranderde histon-eiwitten in de TWIST1
expressie. Aldus blijft het onzeker of epigenetische veranderingen en de TWIST1
activering in kankercellen. Zoals nieuwe bevindingen in deze studie hebben we opgehelderd de TWIST1
regulerend mechanisme onderliggende fundamentele epigenetische machines die DNA-methylering, histon-eiwitten en Sp1 handelen in overleg met TWIST1 expressie in GC cellen.
promotorregio gevonden in diverse kankers zoals maag-, borst-, colorectale en longkanker die [11, 12, 14], waarvan de meeste bleek geen correlatie tussen TWIST1
methylatie en expressie. We zagen dat CGI-methylatie in de TWIST1
exon 1 anders dan in de promotor regio overeen met de genexpressie in muizen GC cellen. Als menselijke cellijnen GC, TWIST1
expressie-negatieve cellijnen waren volledig gemethyleerde, maar zijn expressie-positieve cellijnen vertoonden zowel methylering en unmethylation van TWIST1
, die opwaarts gereguleerd TWIST1
expressie na 5-aza-dc behandeling (figuur 1F). Deze gegevens aan dat MKN45 en MKN7 cellen methylering getoonde gedeeltelijk TWIST1
en half-concentraties TWIST1
expressie werden basaal gedetecteerd in deze cellen, die werden uitgedrukt van gemethyleerd DNA allel. Recente rapporten aangegeven dat CpG wal methylatie is gerelateerd aan de genexpressie [7, 33]. Echter, werd de methylatie status op het voorspelde CpG shoregebied regio niet gecorreleerd met de TWIST1
expressie. Onze gegevens tonen aan dat TWIST1
wordt epigenetisch het zwijgen opgelegd door DNA-methylatie in muizen en humane GC cellijnen.
gen, twee vermoedelijke CGI regio's bevonden zich bij de promotor en exon 1 door MethPrimer analyse. Hier zagen we dat CGI methylatie op de exon 1, in plaats van de promotorregio, werd gecorreleerd met TWIST1
expressie in GC cellen. Dergelijke afzonderlijke methylatie patronen geassocieerd met gen-silencing werden vermeld voor diverse genen [26, 34, 35]. Bijvoorbeeld, SOX2 Kopen en AP2α
tentoongesteld vermeende twee CGI bij de promotor en exon 1, en methylatie op de exon 1 regio heeft aangetoond dat een aanzienlijke worden gecorreleerd aan de genexpressie in GC en de borst kanker [34, 35]. Er werd gemeld dat CGI methylatie rond de translationele startplaats in het retinoïnezuur receptor beta (RAR-ß) gen sterk overeen met de expressie in muizen longkanker opzichte methylering bij het promotorgebied in dezelfde CGI [26]. Zo suggereren onze data dat CGI methylatie op de exon 1 regio in TWIST1
is het belangrijk om de gene silencing in GC cellen. Echter, het is onbekend mechanisme van deze afwijkende methylering tussen de promotor en exon 1 regio. Verschillende transcriptiefactor bindingsplaatsen, zoals Sp1 elementen en histonmodificatie gemeld CGI methylering [36, 37] te beschermen. Het is belangrijk om deze elementen en epigenetische machines in de CGI-regio's van TWIST1
verder.
methylatie onderzoeken door geneste MSP. Onze DCKO muizen tonen pariëtale-cel-gerelateerde atypische brandpunten in de maag en het darmslijmvlies DGCs bestaat uit slecht gedifferentieerde cellen en zegelring cellen vaak waargenomen na 6 maanden. Daarom hebben we eerder voorgesteld dat onze DGCs in DCKO muizen ontwikkeld door de pariëtale cellijn [19]. TWIST1
werd gemethyleerd in 40% van het darmslijmvlies kankers, terwijl de frequentie van methylering in goedaardige gastrische mucosa inclusief atypische foci zeldzaam was (10%), wat aangeeft dat TWIST1
methylering een vroege evenement in DGC carcinogenese in onze muismodel. Onder de 18 primaire GC onderzocht, vijf gevallen waren allebei TWIST1
methylation- en expressie-negatief.
Rotavirusvaccinatie niet gekoppeld aan risico op diabetes mellitus type 1
Microplastic voor het eerst ontdekt in menselijk afval
Waterstofademhaling komt niet van Bikini-atol
Infliximab kan de effectiviteit van sommige COVID-19-vaccins belemmeren
Studie werpt licht op de oorzaken van slopende darmpijn
Omgaan met het prikkelbare darm syndroom
Schoonmaakproducten kunnen het risico op astma bij kinderen verhogen, blijkt uit onderzoek
Volgens een nieuwe studie van onderzoekers van de Faculteit der Gezondheidswetenschappen (SFU) van de Simon Fraser University, blootstelling aan huishoudelijke schoonmaakmiddelen als baby kan het risi
Waterstofademhaling komt niet van Bikini-atol
In deze dagen met al dat stomme gepraat over een nucleaire oorlog, als je het woord waterstof ziet, denk je misschien meteen aan dat arme kleine eiland in de Stille Oceaan, Bikini-atol, waar ze al die
Rurale en stedelijke microbiota verschillen van jongs af aan,
vindt nieuwe studie Een nieuwe studie heeft aangetoond dat verschillen in het menselijke darmmicrobioom tussen mensen die op het platteland en in de stedelijke gebieden van Nigeria wonen al op zeer j