Twist1 overexpression ass zu verschiddenen Cancers dorënner gastric Kriibs (GC) dacks observéiert. Obwuel DNA methylation vun der Twist1 VerfÜgung Gentherapie huet zu Kriibs Zellen gemellt gouf, bleift d'Mechanismen transcriptional Aktivéierung Basisdaten onsécher. An dëser Etude, mir epigenetic hire Restaurant vun der Twist1 VerfÜgung benotzt Twist1 VerfÜgung Transkriptiouns-positiven an -negative Zell Linnen dass aus eisen etabléierten diffusen-Typ GC Maus Modell éischt iwwerpréift ofgeleet ginn. Behandlung mat engem DNA demethylation Agent 5-AZA-DC du-ageschalt Twist1 Ausdrock vun Twist1 Ausdrock-negativ GC Zellen. Laut methylation-spezifesch Hinnen alleguer an bisulfite sequencing Analyse, methylation um CpG-räiche Regioun Twist1 VerfÜgung coding Exon 1, amplaz seng Promoteur Regioun, rigoréis zu transcriptional silencing vun der verbonne war Twist1 Fro: Sakamoto a, Akiyama Y, Shimada S, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka S (2015) DNA Methylation an der Exon 1 Regioun an Komplex Reglement vun Twist1 Expression zu Gastric Cancer BTS. PLoS NËMMEN 10 (12): e0145630. Doi: 10.1371 /journal.pone.0145630 VerfÜgung Redakter: Tae-Young Roh, Pohang Universitéit vu Wëssenschaft an Technologie (POSTECH), Republik Korea VerfÜgung Arnaque: 21. September 2015; Akzeptéiert: 6 Dezember 2015; Publizéiert: 22. Dezember 2015 zu Copyright: © 2015 Sakamoto et al. Dëst ass eng oppen Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz CC BY verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt si vum original Auteur an d'Quell Kaiser VerfÜgung Data Disponibilitéit: All Daten sinn bannent de Pabeier a seng Ennerstëtzung Informatiounen Fichieren VerfÜgung Funding:. vun Stipendie-zu-Hëllef fir wëssenschaftlech Fuerschung (C) (24590444) an (a) (25253081), an der A3 Foresight plangen Dës Aarbecht ënnerstëtzt gouf (AA005) aus der Japan Society fir d'Promotioun vun Science (JSPS), an der Fiche Fuerschung fir innovativ Cancer Control (15Ack0106017h0002) vu Japan Agence fir medezinesch Fuerschung an Entwécklung, AMED; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html. VerfÜgung konkurréiert Interessen: D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung Croix:. BS, bisulfite sequencing; CGI, CpG Insel; Chip, chromatin immunoprecipitation; DCKO, duebel geplangten Maus Knockout; DGC, diffusen-Typ gastric Kriibs; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GC, gastric Kriibs; H3K4me3, histone H3 lysine 4 Dräilännereck-methylation; H3K9me3, histone H3 lysine 9 Dräilännereck-methylation; H3K27me3, histone H3 lysine 27 Dräilännereck-methylation; MSP, methylation-spezifesch polymerase Kette Reaktioun; RT-Hinnen alleguer, Réckproduktioun Transkriptiouns-polymerase Kette Reaktioun; qRT-Hinnen alleguer, grouss RT-Hinnen alleguer; TSGs, entholl suppressor Genen; TSS, beim Start Site; 5-AZA-DC, 5-AZA-2'-deoxycitidine VerfÜgung Twist1, als Basis Wendel-Glück-Wendel Transkriptiouns Faktor Schauspill, direkt Photo'en ze E-Këscht Elementer (NCANNTGN ) op spezifesch Zil- Genen [1]. Twist1 ass verbreet am Ufank embryonal Entwécklung vun Villäicht sollte a Maus [2, 3] gin essentiel fir mesoderm Opstellung bekannt. Am Mënsch Cancers, ass ectopic Twist1 Ausdrock Rapport mat malignant Werdegang, Invasioun, epithelial-ze-mechencymal Transitioun, Metastasen an stemness, déi besot Potential oncogenic Funktiounen vun Twist1 [4-6] verbonne ginn. Sou, dat ass ganz wichteg de transcriptional reglementaresche Mechanismen fir Twist1 zu Kriibs Zellen ze klären. VerfÜgung Epigenetic Ännerungen, wéi DNA methylation an histone Modifikatioun, sinn rigoréis zu Gentherapie silencing Hausnummeren [7-9]. Obwuel epigenetic hire Restaurant op der CGI (CpG Insel) Promoteur Regioun vun entholl suppressor Genen (TSGs) bekannt sinn mat hirem Gentherapie inactivation gin verbonne [10], sinn d'Mechanisme vun epigenetic Regulatioun vun oncogenes ganz wéineg verstan. Verschidden Gruppen hu gewisen, datt Twist1 VerfÜgung du-ageschalt mat engem de-methylation Drogenofhängeger vun Behandlung war, 5-AZA-2'-deoxycitidine (5-AZA-DC), an Kriibs Zellen [11, 12]. Aberrant DNA methylation um CGI Promoteur am mënschleche Twist1 VerfÜgung am primäre Cancers dacks festgestallt gouf vun gastric Kriibs (GC) dorënner [11-14]. Trotzdem, et si vill vun de Conclusiounen, déi DNA methylation um Twist1 VerfÜgung Promoteur Regioun ass net mat Ausdrock vun der Gentherapie zu verschiddenen Cancers soll [12, 14]. Iwwerdeems Twist1 VerfÜgung methylation eng nëtzlech uweist kann de Medeziner Resultater wéi zu Terrain an Iwwerliewe vun Patienten mat Cancers [12, 13, 15], et bleift ëmstridden, ob oder net de Twist1 VerfÜgung ze soe methylation um Promoteur Regioun féiert zu silencing vun der Gentherapie. VerfÜgung Transcriptional Regulatioun vun Genen ass mat lysine (K) methylation Musteren an der histone Schwäif soll déi vun dräi verschiddene lysine methylation Staaten begräifen (mono-, Dis- an tri-). Dräilännereck-methylation vun H3K4 (H3K4me3) ass zu Gentherapie Aktivéierung dinn, an dat vun H3K9me3 an H3K27me3 zu Gentherapie Repressioun [7-9]. Obwuel dës dräi histone H3-methyaltion Musteren wéi gutt ze CGI methylation Hausnummeren, déi transcriptional reglementaresche Mechanismen fir Twist1 VerfÜgung Basisdaten Modifikatioun histone kaum zu Kriibs Zellen verstane ginn. VerfÜgung GC der zweeter ass heefegsten Doudesursaach vum Kriibs an der Welt [16]. GC ass an zwee Haaptgrënn histological Zorte séiert; diffusen an intestinal, déi zwou verschidde carcinogenic Weeër ginn [17]. Diffusen-Typ gastric Kriibs (DGC) ass bekannt heefeg Invasioun an Metastasen ze weisen, an eng schlecht hätt doraus [18]. Verloscht vun E-cadherin an p53 gouf an diffusen-Typ gastric carcinogenesis [19-21] gemellt. Puer Reportagen bewisen heefeg overexpression vun Twist1 zu Mënsch DGCs [22, 23]. VerfÜgung Mir esou virdrun eng duebel geplangten Knockout (DCKO) Maus Linn als ze E-cadherin an p53, déi am Mo. speziell inactivated sinn [ ,,,0],19]. All d'DCKO Mais entwéckelt fatale DGCs bannent engem Joer, de phenotypes héich invasiveness a reegelméissegen Metastasen ze lymph Wirbelen ginn. Et ass wichteg, datt d'Gentherapie Ausdrock Musteren vun DGCs an der DCKO Mais op microarray Analyse fonnt fir déi ganz ähnlech Primärschoul DGCs aner wéi intestinal mannste vu Mënsch huet. Sou, ass eis DCKO Maus Modell eng staark Stäip vun der Roll vun der Gentherapie Funktioun vun DGC carcinogenesis fir enquêtéiert a fir eng therapeutesch Strategie entwéckelen. An dëser Etude, gegrënnt mir Twist1 Ausdrock-positiven an -negative DGC Zell Linnen, datt aus der DCKO Mais ofgeleet ginn. Als Konsequenz vun der Analyse vun de epigenetic hire Restaurant, war d'gemeinsam reglementaresche Mechanismus vun Twist1 VerfÜgung opgekläert, a vun deenen zwou murine a mënschlech DGCs an dëser Etude bewäert. VerfÜgung IFLA- breakpoint VerfÜgung All zu VIVO VerfÜgung Prozedure vun den Déieren Care Comité vun Tokyo Medical an Dental University (Erlaabnes Nr 0160073A) abruecht huet. Wéi fir normal mënschlech gastric mucosae Echantillonen, war schrëftlech informéiert Zoustëmmung vun all Theme kritt, an der Etude vun der Ethik Comité vun Tokyo Medical an Dental University (No.1115) abruecht huet. VerfÜgung Zell Kulturen an Otemschwieregkeeten Echantillon Mir etabléierten virdrun eng e-cadherin /p53 DCKO ( Atp4b-Cre VerfÜgung uechtzéng Primärschoul GC Stoffer an entspriechend. Net-kriibserreegend gastric mucosae sech aus 15 DCKO Mais kritt. Wéi fir Mënscherechter Mo. Stoffer, déi mir gastric mucosae aus GC Patienten dräi Nët-kriibserreegend. Mir kritt och fënnef normal gastric mucosae vun Atp4b-Cre VerfÜgung Réckproduktioun Transkriptiouns (RT) -PCR a grouss RT-Hinnen alleguer (qRT-Hinnen alleguer) VerfÜgung Total RNS mat enger RNeasy Mini Kit isoléiert war (QIAGEN;˥34) an cDNA war vun RNS virbereet engem SuperScript III Kit (Invitrogen benotzt;´80044) laut der Ëmwelt- d'Hiersteller. End-Punkt RT-Hinnen alleguer duerchgefouert mat Multiple Zyklus Zuelen, 28-35 zouféieren. Als eng intern Kontroll, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ( GAPDH VerfÜgung) war mat 21 Zykle Kick ze cDNA Qualitéit an Quantitéit fir all RT-Hinnen alleguer suergen. Implikatioune Produiten waren zu 2% agarose gels iwwerlaascht oder déi grouss RT-Hinnen alleguer laachen benotzt LightCycler DNA Master SYBR Green ech (Roche kinnt;/07516001). D'amplification Programmer fir Hinnen alleguer ware fir 40 Zykle fir Gapdh widderholl a 45cycles fir aner Genen ausser Gapdh. Hinnen alleguer Produite sech an der pMD20 T-Vecteure klonen engem Mighty TA-Klone Kit benotzt (TaKaRa BIO INC;ɚ8), an dann direkt Nepgen. D'primer Message an Hinnen alleguer Produit Diameter vun S1 Table gewisen. VerfÜgung Methylation Analys VerfÜgung Mir Frankräich DNA aus murine a mënschlech GC Zell Linnen vum phenol-chloroform Method ofgebaut, an dann bisulfite duerchgefouert Ännerungen an der Prozedur MSP. Bisulfite Behandlung vun DNA huet mat EZ DNA Methylation-Gold (ZYMO FUERSCHUNG; # D5006) gesuergt, an dann methylation-spezifesch Hinnen alleguer (MSP) huet gehaal. Kuerz, war d'Hinnen alleguer Reaktioun fir 35 Zykle vun engem 25 μl Mëschung aus bisulfite-geännert DNA, 2.5μl vun 10x Hinnen alleguer Prellbock, 1,25 μl vun 25mM dNTPs, standing 25 pmol /l vun all primer an 1 U vun JumpStart RedTaq polymerase (Fläch; # D0563). D'Konditiounen fir Hinnen alleguer sech wéi follegt zesummen: 95 ° C fir 5 Minutten; 35 Zykle vun 95 ° C fir 1minutes, 53 ° C fir 2minutes, an 72 ° C fir 1.5minutes; an eng final Extensioun bei 72 ° C fir 5 Minutten. Wéi fir Maus GC Stoffer, war DNA aus formalin-fix paraffin-Ënnerbewosstsinn (FFPE) Stoffer ofgebaut. Bisulfite DNA huet mat Reliefsailen Hinnen alleguer primers Kick an dann gemaach MSP gehaal huet [25, 26]. D'primer Message an Hinnen alleguer Produit Diameter vun S2 Table dës VerfÜgung Chromatin immunoprecipitation (Chip) assay VerfÜgung Chip assay war en Chip-IT Express Kit standing benotzt (Aktiv Motif;Ȓ08). no de Protokoll d'Hiersteller. Immunoprecipitated DNA Beräicherung war wéi op der Infor- normalized. D'antibodies an dëser Etude benotzt goufen anti-histone H3K4me3 (Aktiv Motif;Ə15), anti-H3K9me3 (Aktiv Motif;ƍ65), anti-H3K27me3 (Aktiv Motif;Ƈ55), anti-H3K36me2 (abcam; # ab9049) , Anti-Sp1 (abcam; # ab13370), an anti-Histone H3 (aktiv Motif;Ƈ63) antibodies. Normal Kanéngchen IgG (Zell sécher Technology;Đ9s) war als negativ Kontroll fir Chip benotzt. D'primer Message an Hinnen alleguer Produit Diameter vun S2 Table gewisen. VerfÜgung Knockdown Analyse mat klenge interfering RNAs VerfÜgung siRNA-baséiert knockdown vun Suv39h1 VerfÜgung a Suv39h2 Western Blot Analys VerfÜgung GC Zellen mat Pierce Ripa gefiermt lysed waren (Thermo wëssenschaftlech;00). Proteinen sech op SDS-polyacrylamide gels getrennt an duerno zu polyvinylidene fluoride transferéiert (PVDF) Schläimhait, gefollegt vun incubation mat opgeléist antibodies zu Tris-gefiermt Salins (TBS) mat 2% z'iesse Mëllech an 10% Tween 20. D'Primärschoul antibodies an dëser benotzt Etude goufen Maus monoclonal anti-Twist1 (1: 100, Santa Cruz Bio-Technologie; # sc-81417), Kanéngchen polyclonal anti-Sp1 (1: 200, aktivt Motif;Ɔ58), a Maus monoclonal anti-α-tubulin ( 1: 200, Santa Cruz; # sc-8035) antibodies. D'Première antibodies sech alkaline phosphatase-conjugated anti-Kanéngchen IgG (1: 3000, Bio-Rad schaffen;ª6518) an Anti-Maus IgG (1: 3000, Bio-Rad schaffen;ª6520). Blots sech mat ImmunoStar AP Realitéiten entwéckelt (Bio-Rad schaffen;ª5018) VerfÜgung Immunohistochemistry VerfÜgung FFPE Rubriken (4 μM) waren an xylene deparaffinized, an graded Ethanol Léisungen rehydrated an dann Antigen retrieval. war vun microwaving vun 10 mm Zitrounesaier gefiermt gehaal. Immunohistochemistry war anti-Twist1 antibodies standing benotzt (Santa Cruz, 1:20) wéi virdru beschriwwen [19]. Ausdrock vun Twist1 war als positive nuklear staining zu méi wéi 10% vun den Zellen definéiert, an der Intensitéit war domatter Aschätzung (negativ), + (schwaach) an ++ (moderéiert ze staark) vun dräi Enquêteuren onofhängeg. VerfÜgung Twist1 Ausdrock vun murine a mënschlech GC Zell Linnen VerfÜgung vun DGC Stoffer vun DCKO Mais, Twist1 VerfÜgung Transkriptiouns-positiv Zell Linnen (MDGC-7, MDGC- 8 an MDGC-9) an negativ Zell Linnen (MDGC-1 an MDGC-3) sech etabléiert (Lalumi 1A an S2A Lalumi), an den Ausdrock vun Twist1 FAQ war zu vunenee Linn (Lalumi 1B) confirméiert. war Twist1 Ausdrock um mRNA an FAQ Niveauen am Twist1 Ausdrock-negativ MDGC Zellen der Behandlung mat DNA demethylation Agent 5-AZA-DC (Lalumi 1c an 1D) coopération, iwwerdeems seng Ausdrock net an der Behandlung mat histone deacetylase inhibitor TSA (S2B geännert huet Figebam). An der aachter Mënsch GC Zell Linnen iwwerpréift, Twist1 VerfÜgung Ausdrock zu véier Zell Linnen (Lalumi 1E, lénks), dräi (Kato-III, GCIY an AGS) vun deem hien de bass-Aktivatioun vun Twist1 VerfÜgung Ausdrock der Behandlung mat 5-AZA-DC vun RT-Hinnen alleguer (Beispill, Lalumi 1E, riets). Wéi fir Twist1 VerfÜgung Ausdrock-positiv GC Zell Linnen, no 5-AZA-DC Behandlung, 2.1- an 3,2-fantastesch up-Regulatioun vun Twist1 VerfÜgung war zu MKN45 an MKN7 fonnt, respektiv, vun qRT-Hinnen alleguer hierkommen Twist1 Ausdrock war zu MDGC-9 Zellen (Lalumi 1F) net geännert. VerfÜgung CGI methylation an Ausdrock vun Twist1 VerfÜgung am GC Zell Linnen VerfÜgung Twist1 VerfÜgung huet e dichten CGI Regioun vun de Promoteur fir de ganze Exon 1, gëtt dëser Regioun héich ënnert vertebrates dorënner Maus a mënschlech (S3 Lalumi) conserved. Fir d'CGI zu Maus a mënschlech Twist1 VerfÜgung klären, mir standing computational Analyse mat Browser UCSC Genom (http://genome.ucsc.edu/index.html) an MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /) dass iwwerall als Identifikatioun vun CGI an MSP primers benotzt gëtt [27]. Mir analyséieren ongeféier 1,4 KB Regioun dorënner de Promoteur an de ganze Exon 1. UCSC Genom Browser op Maus a mënschlech Analyse Schatzkummer ee CGI an der Regioun iwwerpréift (Donnéeën net gewisen). Allerdéngs, souwuel putative zwee CGI Siten an der Regioun fonnt goufen an mouse a mënschlech wann mir d'Critèrë vun CGI mam GC Inhalt vun 50% ausgenotzt an observéiert /erwaart CpG Verhältnis vun 0,8 vun MethPrimer (Lalumi 2A an 2C). Dës zwee putative CGI Regiounen sech matzen am Promoteur an Exon 1. Well den methylation um Promoteur Regioun huet an verschiddenen Mënsch Cancers [12, 14] gemellt ginn, mir iwwerpréift naufragés de methylation Status op der Regioun an murine a mënschlech GC Zell Linnen vun MSP. der methylation Status op de Promoteur Regioun vun Twist1 Allerdéngs VerfÜgung net zu sengem Ausdrock vun all GC Zell Linnen sëlwecht hutt iwwerpréift (Regioun P1, Lalumi 2A). déi kritesch methylated Regioune mat Twist1 Ausdrock vun MDGC Zellen verbonne ze bestëmmen, mir standing weider MSP um CGI Regioun an Exon 1 (E1-1, E1-2 an E1-3), an der virausgesot CpG Bord Site ronn 1,6 KB aus TSS (beim Start Site, S1) (Lalumi 2A). Als Resultat, CGI methylation der Regioun (E1-1 an E1-2) ronderëm d'TSS zu Twist1 VerfÜgung Exon 1 gouf fonnt an Ausdrock vun der Gentherapie zu MDGC Zellen ze entspriechen, obwuel et keng Korrelatioun war tëscht hinnen um virausgesot Bord Regioun (S1) an d'Enn vun der Exon 1 Regioun (E1-3) (Lalumi 2B, lénks) an MDGC Zellen. Nee methylation bei all CpG Regiounen an dräi normal gastric mucosae ouni Twist1 Ausdrock fonnt gouf vum Atp4b-Cre VerfÜgung Twist1 VerfÜgung methylation an Ausdrock vun DCKO Maus GC Otemschwieregkeeten Echantillon VerfÜgung Mir iwwerpréift der methylation Status vun Twist1 VerfÜgung 18 Primärschoul GC Stoffer aus 15 DCKO Mais benotzt. Well GC Regiounen sech ganz kleng an hir DNA aus FFPE Echantillon zougedréckt héich Konzentratioune, standing mir gemaach MSP [25, 26]. war Twist1 VerfÜgung vill methylated (9/18, 50%) vun der Primärschoul GCs Verglach zu entspriechend Net-kriibserreegend Stoffer (1/10, 10%), ass statistesch groussen Ënnerscheed (P &Si besteet; 0,05, Table 1). Vertrieder Donnéeën vun MSP sinn zu Lalumi 3A gewisen. Ënnert hinnen, 4 vun 10 (40%) Fäll goufen intramucosal a 5 vun 8 (62.5%) waren invasiv GCs (Table 1). An dëser Etude, Twist1 VerfÜgung methylation-positiv Fäll bewisen unmethylated MSP Bands wéi gutt, dat wéinst der Präsenz vun normal stromal /fibroblast an demagogesch Zellen zu Kriibs Otemschwieregkeeten Rubriken, obwuel mer net d'Méiglechkeet vun enger deelweiser methylation verleegnen kéint wéi MKN45 an MKN7 an entholl heterogeneity. VerfÜgung Twist1 FAQ Ausdrock war zu 7 vun 18 (38.9%) GCs Verglach zu entspriechend net-kriibserreegend gastric mucosae vun immunohistochemistry fonnt. Vertrieder Biller si vun Lalumi 3B gewisen. Mir analyséieren weider d'Relatioun tëschent Twist1 VerfÜgung Ausdrock an methylation Niveauen an dësen Fäll. Vun der 18. Primärschoul GC iwwerpréift, néng Fäll zougedréckt Korrelatioun tëschent Twist1 VerfÜgung methylation an Ausdrock (Lalumi 3C). Dräi vun véier Fäll mat Twist1 schwaach Ausdrock Schatzkummer seng methylation, eventuell datt niddereg Ausdrock vun Twist1 vläicht duerch seng methylation verursaacht ginn. Allerdéngs blouf fënnef Fäll keen methylation an Ausdrock (Table 1) Schatzkummer. VerfÜgung Histone methylation zu der Regelung vun Zesummenhang ass Twist1 VerfÜgung Ausdrock VerfÜgung Mir propagéieren nächst ob oder net der lysine methylation Niveau vun histone H3 dréit zu Twist1 VerfÜgung Ausdrock. Chromatin immunoprecipitation (Chip) assays waren op der virausgesot CpG Bord (CP1.3k) gesuergt, Promoteur (CP1), an exons 1 (CE1-1 an CE1-2) an 2 (CE2) Regiounen (Lalumi 2A). Op der CP1 an CE1-2 Regiounen, war aktiv histone uerg H3K4me3 zu Twist1 Ausdrock-positiv Zellen beräichert (MDGC-7 an MDGC-9), mee d'Aarbechtslosegkeet histone uerg H3K9me3 war zu Twist1 Ausdrock-negativ Zellen (MDGC-1 an MDGC beräichert -3) (Lalumi 4A an 4B). Chip assays Schatzkummer souwuel H3K4me3 an H3K9me3 Signaler vun MDGC-1 an MDGC-3 Zellen mat 5-AZA-DC Behandlung, beweist de Bistum H3K4me3 Niveau vun deenen Zellen (Lalumi 4C). Am Géigendeel, goufen d'H3K27me3 an H3K36me2 Niveauen net mat Twist1 Ausdrock vun all MDGC Zellen an dëser Etude iwwerpréift soll. Wéi fir Mënscherechter GC Zell Linnen, engem ähnleche Regioun aus dem Promoteur wellkomm 1 fir Exon zougedréckt H3K4me3 Beräicherung a Twist1 VerfÜgung Ausdrock-positiv MKN45 Zellen, an H3K9me3 zu Twist1 VerfÜgung Ausdrock-negativ Kato-III Zellen (Dozou 2C an 4D). VerfÜgung Suv39h1 VerfÜgung a Suv39h2 VerfÜgung, engem histone methyltransferase, reguléieren H3K9me3 VerfÜgung Et si verbonne vill vun histone methyltransferases mat H3K4, H3K9 an H3K27 [28]. Dofir, fir festzestellen, wat histone Modifikatioun Enzymen sidd responsabel fir d'H3K4me3 oder H3K9me3 Beräicherung am Twist1 VerfÜgung Exon 1 Regioun am GC Zellen, iwwerpréift mir zéng H3K4me3 ( Mll1 VerfÜgung, Mll2 Association vun Sp1 mat der transcriptional Regulatioun vun Twist1 de Konsens 5 '-. (G /T) GGGCGG (G /A) ( G /a) (C /T) -3 'Haaptrei ass wéi d'obligatoresch Motiv vun Sp1 Transkriptiouns Faktor bekannt, an eng Relatioun tëscht CGI methylation an Sp1 an de Promoteur bindend ass gemellt ginn [29, 30]. Multiple Sp1 bindend Sitë waren an der CpG-räiche Regioun virausgesot Twist1 VerfÜgung Exon 1 mat TFBIND (http://tfbind.hgc.jp) an JASPAR (http://jaspar.binf.ku.dk) . D'Roll vun Sp1 am Transkriptiouns vun Twist1 VerfÜgung war dann mat Referenz epigenetic Modifikatioun vun der Gentherapie iwwerpréift. Mir fonnt Ausdrock vun Sp1 mRNA an FAQ zu all murine a mënschlech GC Zellen iwwerpréift, souguer am Twist1 Ausdrock-negativ MDGC-1, MDGC-3, KATOIII an GCIY Zellen (Lalumi 6A). VerfÜgung Fir erauszefannen, ob oder net Sp1 fir d'Regioune vun der Twist1 VerfÜgung Promoteur an Exon 1 zu GC Zellen Photo'en, standing mir Chip assay vun Sp1 MDGC Zellen (Lalumi 2A) benotzt. Sp1 gebonnen un d'Regioun vun der Twist1 VerfÜgung Promoteur (CP1) an Exon 1 (CE1-2) zu Twist1 Ausdrock-positiv Zell Linnen (MDGC-7 an MDGC-9) (Lalumi 6B). Am Géigesaz, Twist1 Ausdrock-negativ Zell Linnen (MDGC-1 an MDGC-3) zougedréckt undetectable Niveau vun Sp1 bindend Signaler um CP1 an CE1-2 Regiounen. Sp1 gemaach kruet net zu all Regioune vun der virausgesot CpG Bord (CP1.3k) an Exon 2 (CE2) Regiounen vun dëse Twist1 Ausdrock-positiven an -negative MDGC Zellen. Demethylation mat 5-AZA-DC fräi Sp1 bindend um Twist1 VerfÜgung Promoteur an Exon 1 Regiounen an der Twist1 Ausdrock-negativ MDGC-1 an MDGC-3 Zellen (Lalumi 6B). Mithramycin A ass bekannt mat Sp1 verbindlech bis CpG-räiche reglementaresche Message [31, 32] zu Bréissel. Et gouf gesot, dass Twist1 VerfÜgung Ausdrock war verwandelt-reegelen der Behandlung mat mithramycin Eng vun hiren Ausdrock-positiv GC Zellen (MDGC-7, MDGC-9, MKN7 an MKN45 Zellen) (Lalumi 6C an S6 Lalumi). Mithramycin A keen Effekt op Sp1 Ausdrock vun deenen Zellen show gemaach (Daten dës net). Up-Regulatioun vun Twist1 VerfÜgung vum 5-AZA-DC war Verréngerung vun mithramycin enger Behandlung an MDGC-3 Zellen (P = 0,04, Lalumi 6D). VerfÜgung d'Mechanisme epigenetic Regulatioun vun oncogene Basisdaten si ganz wéineg verstan. Der Relatioun tëscht methylation Status um Twist1 VerfÜgung Promoteur Regiounen an Ausdrock vun Twist1 VerfÜgung kontrovers ass, an do sinn bal keent vun Reportage op verännert histone Modifikatioun vun Twist1 VerfÜgung Ausdrock. Sou, bleift et onsécher, ob oder net epigenetic Ännerungen ze ofhängeg Twist1 VerfÜgung Aktivéierung zu Kriibs Zellen. Als nei Experienz an dëser Etude, opgekläert mir den Twist1 VerfÜgung reglementaresche Mechanismus fundamental epigenetic Maschinnen Basisdaten datt DNA methylation, histone Ännerungen an Sp1 Akt am Concert mat Twist1 Ausdrock am GC Zellen. VerfÜgung Et ass allgemeng bekannt, datt DNA methylation um CGI Promoteur Regioun fir Gentherapie silencing kritesch ass, an aberrant CGI methylation Resultater am Verloscht vun Ausdrock vu verschiddenen TSGs [10]. Twist1 war du-ageschalt an zwee murine a mënschlech GC Zellen mat 5-AZA-DC Behandlung an dëser Etude, déi besot datt transcriptional Aktivatioun vun Twist1 och duerch DNA methylation modulated ass. CGI methylation vun der Twist1 VerfÜgung Promoteur Regioun huet an verschiddenen Cancers wéi gastric, Broscht, colorectal an haett gelackelt [11, 12, 14], déi meescht vun deenen awer keng Korrelatioun tëschent Twist1 Laut dem computational Analyse vun Maus a mënschlech CGIen aus dem Promoteur ze ganze coding Regioun vun der Twist1 VerfÜgung Gentherapie, zwee putative CGI Regioune waren um Promoteur an Exon wellkomm 1 vun MethPrimer Analyse. Hei gesi mer, dass CGI methylation um Exon 1, amplaz seng Promoteur Regioun, war soll mat Twist1 VerfÜgung Ausdrock am GC Zellen. Esou isoléiert methylation Musteren mat Gentherapie silencing assoziéiert hunn zu e puer Genen [26, 34, 35] gemellt ginn. Zum Beispill, SOX2 VerfÜgung a AP2α VerfÜgung Schatzkummer putative zwee CGIen um Promoteur an Exon 1, an methylation um Exon 1 Regioun huet dës Distanz an hir Gene Ausdrock vun GCs an Broscht vill soll ginn Cancers [34, 35]. Et war an der retinoic Seier receptor Beta (RAR-SS) Gentherapie Spiller gehéiert, déi CGI methylation ronderëm d'respektiv Ufank Site gemellt fir hiren Ausdrock an murine haett Cancers Verglach zu methylation um Promoteur Regioun am selwechten CGI etabléiert [26]. Sou, proposéiere eis Daten dass CGI methylation um Exon 1 Regioun am Twist1 VerfÜgung fir hir Gene silencing am GC Zellen wichteg ass. Mä, ass et onbekannt de Mechanismus vun dëser discrepant methylation tëscht de Promoteur an Exon 1 Regiounen. Puer Transkriptiouns Faktor bindend Siten, wéi Sp1 Elementer, an histone Modifikatioun gewiescht ze schützen CGI methylation gemellt [36, 37]. Et ass wichteg dës Elementer an epigenetic Maschinnen an d'CGI Regioune vun Twist1 VerfÜgung weider. VerfÜgung An der Primärschoul GCs aus DCKO Mais ze iwwerpréifen, 50% vun GCs Schatzkummer Twist1 VerfÜgung methylation déi gemaach MSP. Eis DCKO Mais weisen parietal Zell-Zesummenhang atypical Foci am Mo an intramucosal DGCs komponéiert vun Pro ënnerscheet Zellen an signet Ring Zellen oft bei 6 Méint fonnt. Dofir hu mer virgeschloen virdrun dass eis DGCs zu DCKO Mais duerch d'parietal Zell antike entwéckelt [19]. Twist1 VerfÜgung war zu 40% vun intramucosal Cancers methylated, iwwerdeems d'Frequenz vun methylation an Net-kriibserreegend gastric mucosae dorënner atypical Foci seelen war (10%), wat beweist, dass Twist1 VerfÜgung methylation ass eng fréi Héichwaasser zu DGC carcinogenesis an eiser Maus Modell. Vun der 18. Primärschoul iwwerpréift GCs, fënnef Fäll goufen souwuel Twist1 VerfÜgung methylation- an Ausdrock-negativ.
Ausdrock an Maus GC Zellen. Chromatin immunoprecipitation assays Teamchef aktiv histone uerg H3K4me3 zu Twist1 Ausdrock-positiv Zellen beräichert huet, an d'Aarbechtslosegkeet histone uerg H3K9me3 war zu Twist1 Ausdrock-negativ Zellen beräichert. Den Ausdrock Niveau vun Suv39h1 VerfÜgung a Suv39h2 VerfÜgung, histone methyltransferases fir H3K9me3, goufen inversely soll mat Twist1 VerfÜgung Ausdrock, an knockdown vun Suv39h1 VerfÜgung oder Suv39h2 VerfÜgung entschlof Twist1 VerfÜgung Ausdrock. Desweideren, Faktor Sp1 Transkriptiouns zu der Exon 1 Ausdrock CpG-räiche Regioun an Twist1 Ausdrock-positiv Zell Linnen, an Twist1 VerfÜgung gebonnen war vun mithramycin manner, wat dat mat Sp1 verbindlech bis CpG-räiche reglementaresche Message interferes. Eis Studien virgeschlo, dass d' Twist1 VerfÜgung Transkriptiouns am GC Zellen duerch Potential Zesummenaarbecht vun DNA methylation regulariséiert ginn, histone Ännerungen am Komplex mat Sp1 verbindlech bis CpG-räiche Regiounen am Exon 1 Regioun. VerfÜgung Aféierung VerfÜgung
spontan a Methode VerfÜgung
huet mat enger electroporation (Neon transfection System, Invitrogen) gesuergt. MDGC Zellen sech mat 50nM siRNA vun Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Fläch), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226) transfected, oder negativ Kontroll siRNA (missioun siRNA Universal Negativ Control, Fläch). No 48 Stonnen culturing, goufen Zellen fir RT-Hinnen alleguer recoltéiert, Western blot gebueden, Migratioun, Invasioun, an Prolifératioun assay. VerfÜgung Resultater VerfÜgung
, Mll3 VerfÜgung, Mll4 VerfÜgung, Setd1a VerfÜgung, Setd1b VerfÜgung, Ash1 VerfÜgung, Ash1l VerfÜgung , Smyd3 VerfÜgung a Meisetz VerfÜgung), siwen H3K9me3 ( Suv39h1 VerfÜgung, Suv39h2 VerfÜgung, G9a VerfÜgung, Setdb1
, Clld8 VerfÜgung, Glp VerfÜgung a Riz1 VerfÜgung), an eng H3K27me3 ( Ezh2 VerfÜgung) Zesummenhang Genen. Vertrieder Donnéeë sinn an Lalumi 5A gewisen. Ënnert hinnen, den Ausdrock Niveau vun Suv39h1 VerfÜgung a Suv39h2 VerfÜgung sech inversely soll mat Twist1 VerfÜgung Ausdrock. Allerdéngs, iwwerpréift d'Ausdrock Niveau vun reschtlech 16 histone methylatasferase Genen sech net mat Twist1 VerfÜgung Ausdrock vun MDGC Zellen assoziéiert. Mir standing siRNA-baséiert knockdown vun Suv39h1 VerfÜgung oder Suv39h2 VerfÜgung vun der jeweileger Ausdrock-positiv MDGC-1 an MDGC-3 Zellen vun electroporation (Lalumi 5B). Knockdown vun Suv39h1 VerfÜgung oder Suv39h2 VerfÜgung an dës Zell Linnen Nerve eng Erhéijung vun Twist1 VerfÜgung Ausdrock Observatiounsméiglechkeeten op RT-Hinnen alleguer (Lalumi 5B) an qRT-Hinnen alleguer (MDGC- 1, Lalumi 5C) VerfÜgung
Diskussioun VerfÜgung
methylation an Ausdrock. Mir gesinn, dass CGI methylation zu Twist1 VerfÜgung Exon 1 aner wéi an de Promoteur Regioun gehéiert fir hir Gene Ausdrock an Maus GC Zellen. Wéi fir Mënscherechter GC Zell Linnen, Twist1 VerfÜgung Ausdrock-negativ waren Zell Zeilen voll methylated, mä säin Ausdrock-positiv Schatzkummer Zell Linnen souwuel methylation an unmethylation vun Twist1 VerfÜgung, all vun deem weider-reglementéiert Twist1 VerfÜgung Ausdrock no 5-AZA-DC Behandlung (Lalumi 1F). Dës Donnéeë weisen, datt MKN45 an MKN7 Zellen zougedréckt deelweis methylation vun Twist1 VerfÜgung, a Halschent Niveau vun Twist1 VerfÜgung Ausdrock sech basally vun deenen Zellen fonnt, déi aus unmethylated DNA allele ausgedréckt huet. Rezent Rapporten uginn dass CpG Bord methylation zu Gentherapie Ausdrock Zesummenhang ass [7, 33]. Allerdéngs war d'methylation Status op der virausgesot CpG Bord Site Regioun net mat Twist1 VerfÜgung Ausdrock soll. Eis Daten weg datt Twist1 VerfÜgung epigenetically duerch DNA methylation zu murine a mënschlech GC Zell Linnen entsat ass. VerfÜgung
Fuerscher identifizéieren eng Bakterie mat Anti-SARS-CoV-2 Aktivitéit in vitro:Dolosigranulum pigrum
Probiotika kënnen hëllefen Ënnerernährung an den nächsten zwee Joerzéngten ze bekämpfen,
Heartburn verstoen
Lungemikroben kënne hëllefen d'Resultater bei schwéier kranke virauszesoen
Gesondste Darmbakterien mat Planzbaséierter oder mediterraner Diät
Genetik kann d'Kompositioun vum Mikrobiom méi beaflossen wéi Ëmweltfaktoren
Fäert net d'Kolonoskopie
Rootkanäl a Koloskopien hunn eppes gemeinsam - si gi vun der Ëffentlechkeet gefaart. Awer am Beräich vun den Zännprozeduren a routineméissegen Examen, respektiv, weder ass e grousse Deal. Bei Ogden
Änneren iewescht respiratorescht Mikrobiom bei Kanner am Zesummenhang mat der SARS-CoV-2 Empfindlechkeet
Fuerscher hunn den nasopharyngealen Mikrobiom vu Kanner bis 21 Joer al getest a fonnt datt de Mikrobiom mam Alter ännert. Spezifesch Bakterien, deem seng Iwwerfloss och mam Alter ännert, si verbonne m
Darmmikroben kéinte mat Depressioun verbonne sinn
De mënschlechen Darm enthält Trilliounen Bakterien, déi den Darmmikrobiom oder dMikrobiota bilden. Eng nei Fuerschung huet dKompositioun vun dësem Darmmikrobiom an depressiver Stéierung verbonnen. DEt