PLOS ONE: A metilação do DNA no 1 Região Exon e do Regulamento Complexo de TWIST1 expressão em células de câncer gástrico

Sumário

TWIST1 superexpressão é frequentemente observada em vários tipos de câncer, incluindo câncer gástrico (GC). Embora a metilação do DNA do gene TWIST1
foi avaliado em células de cancro, os mecanismos subjacentes a activação transcricional permanecem incertas. Neste estudo, examinamos primeiro as alterações epigenéticas do TWIST1
usando TWIST1
linhas de transcrição-positivas e celulares -negative que são derivados de nosso estabelecida do tipo difuso rato modelo GC. O tratamento com um agente de desmetilação de ADN activado re-expressão de 5-aza-dC TWIST1 em células de expressão de GC-negativo TWIST1. De acordo com a metilação específicas de PCR e análise de sequenciação de bissulfito, metilação na região rica em CpG dentro de TWIST1
codificação do exão 1, em vez de a sua região promotora, foi firmemente ligado ao silenciamento transcricional do TWIST1
expressão em células de rato GC. ensaios de imunoprecipitação de cromatina revelaram que marca histona ativa H3K4me3 foi enriquecida em células de expressão positiva TWIST1, e marca histona inativa H3K9me3 foi enriquecida em células de expressão negativa TWIST1. Os níveis de expressão Suv39h1
e Suv39h2
, metiltransferases histonas para H3K9me3, foram inversamente correlacionadas com o TWIST1
expressão, e knockdown de Suv39h1
ou Suv39h2
induzida TWIST1
expressão. Além disso, o factor de transcrição Sp1 ligado ao exão uma região rica em CpG em linhas celulares de expressão positiva TWIST1, e TWIST1
expressão foi reduzido por mitramicina, que interfere com a ligação que Sp1 a sequências reguladoras ricos em CpG. Nossos estudos sugerem que o TWIST1
transcrição em células de GC pode ser regulada por meio do potencial de cooperação de metilação do DNA, modificação da histona em complexo com ligação SP1 para regiões CpG-ricos dentro da região do exão 1.

citação: Sakamoto a, Akiyama Y, Shimada S, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka S (2015) DNA metilação no 1 Região Exon e do Regulamento Complexo de TWIST1 expressão em células de câncer gástrico. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10.1371 /journal.pone.0145630

editor: Tae-Young Roh, Universidade Pohang de Ciência e Tecnologia (POSTECH), República da Coreia

Recebido: 21 Setembro, 2015; Aceito: 06 de dezembro de 2015; Publicação: 22 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Sakamoto et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas-in-Aid para a Investigação Científica (C) (24.590.444) e (a) (25253081), e do Programa Foresight A3 (AA005) da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS), ea Research Prático de Controle Innovative Câncer (15Ack0106017h0002) da Agência Japonesa para a Investigação e Desenvolvimento, AMED médica; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.

competindo interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Abreviaturas:. BS, seqüenciamento bissulfito; CGI, ilha CpG; Chip, imunoprecipitação de cromatina; DCKO, o dobro do rato knockout condicional; DGC, difusa do tipo de câncer gástrico; GAPDH, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; GC, câncer gástrico; H3K4me3, histona H3 lisina 4 tri-metilação; H3K9me3, histona H3 lisina 9 tri-metilação; H3K27me3, histona H3 lisina 27 tri-metilação; MSP, reacção em cadeia da polimerase-metilação específica; RT-PCR, Reverse reação em cadeia de polimerase; qRT-PCR, RT-PCR quantitativo; ETG, genes supressores de tumores; TSS, local de início da transcrição; 5-aza-DC, 5-aza-2'-desoxicitidina

Introdução

TWIST1, atuando como um fator básico de transcrição hélice-alça-hélice, liga-se diretamente para elementos E-Box (NCANNTGN ) em genes alvo específicos [1]. TWIST1 é amplamente conhecida por ser essencial para a formação de mesoderme durante o desenvolvimento embrionário precoce de Drosophila e rato [2, 3]. Nos cancros humanos, a expressão ectópica TWIST1 é relatado para ser associado com a progressão maligna, invasão, a transição epitelial-a-mechencymal, metástase e stemness, indicando potenciais funções oncogénicas de TWIST1 [4-6]. Assim, é muito importante para clarificar os mecanismos reguladores da transcrição para TWIST1 em células cancerosas.

Epigenetic alterações, tais como a metilação do DNA e a modificação da histona, estão intimamente ligados ao silenciamento de genes [7-9]. Embora as alterações na epigenética CGI (ilha CpG) a região promotora dos genes supressores de tumor (ETG) são bem conhecidos para ser associado com a sua inactivação de genes [10], os mecanismos de regulação epigenética de oncogenes são mal compreendidos. Vários grupos mostraram que TWIST1
foi re-activado por tratamento com uma droga de-metilação, 5-aza-2'-desoxicitidina (5-aza-dC), em células cancerosas [11, 12]. metilação do DNA aberrante no promotor CGI em humanos TWIST1
tem sido frequentemente detectada em cânceres primários, incluindo a de câncer gástrico (GC) [11-14]. No entanto, há um grande número de descobertas que a metilação de ADN no TWIST1
região promotora não está correlacionada com a expressão do gene em diferentes tipos de cancro [12, 14]. Enquanto TWIST1
metilação pode ser um biomarcador útil para prever os resultados clínicos quanto à recorrência e sobrevida em pacientes com cânceres [12, 13, 15], continua a ser controverso ou não o TWIST1
metilação na região promotora leva ao silenciamento do gene.

a regulação transcricional de genes está correlacionada com padrões de lisina (K) na cauda de metilação das histonas que consistem em três estados lisina metilação diferentes (mono-, di- e tri-). Tri-metilação de H3K4 (H3K4me3) está relacionada com a activação de genes, e que de H3K9me3 H3K27me3 e a repressão do gene [7-9]. Embora esses padrões H3-methyaltion três histonas estão ligados a metilação CGI, bem como, os mecanismos reguladores da transcrição para TWIST1
subjacente a modificação da histona são mal compreendidos em células cancerosas.

GC é a segunda mais frequente causa de morte por câncer no mundo [16]. GC é classificada em dois tipos histológicos principais; difusa e intestinal, que são duas vias distintas carcinogénicas [17]. cancro gástrico do tipo difuso (DGC) é conhecido por exibir invasão e metástase frequente, resultando em um prognóstico pobre [18]. Perda de E-caderina e p53 tem sido relatada na carcinogênese gástrica do tipo difuso [19-21]. Vários relatos demonstraram a superexpressão frequente de TWIST1 no PED humanos [22, 23].

Nós já projetou um double knockout condicional rato linha (DCKO) como a E-caderina e p53, que são especificamente inativado no estômago [ ,,,0],19]. Todos os ratos DCKO desenvolvido PED fatais dentro de um ano, os fenótipos sendo alta capacidade de invasão e metástase frequente para os gânglios linfáticos. Vale ressaltar que os padrões de expressão gênica de PED nos ratos DCKO detectados na análise microarray foram muito semelhantes aos dos outros do que os intestinais PED primários humanos. Assim, o nosso modelo de rato DCKO é uma ferramenta poderosa para investigar o papel da função do gene em DGC carcinogênese e para o desenvolvimento de uma estratégia terapêutica. No presente estudo, nós estabelecemos linhas de células DGC TWIST1 expressão positivos e negativos, que são derivados a partir de ratinhos DCKO. Como consequência da análise das alterações epigenéticas, o mecanismo de regulação comum de TWIST1
foi elucidado, e avaliados em ambos os PED murino e humanos neste estudo.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos in vivo
procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Terapia animal de Tokyo Medical and Dental University (permissão No. 0160073A). Quanto a amostras de mucosa gástrica humana normais, consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos, eo estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Tokyo Medical and Dental University (No.1115).

celular culturas e amostras de tecido

Nós previamente estabelecido um E-caderina /p53 DCKO ( Atp4b-Cre
^{+
; CDH1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
) mouse modelo [19]. De seus tecidos cancerosos, estabelecemos cinco linhas de células de rato DGC e nomeou-os MDGCs (Shimada S, observação não publicada). MDGC-1 e células MDGC-3 foram cultivadas em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) contendo alto teor de glucose suplementado com soro fetal bovino a 10%, e MDGC-7, MDGC-8 e MDGC-9 foram cultivadas em meio F12 de Ham suplementado com 5% de soro de cavalo. A análise do DNA foi realizada a fim de detectar a truncado CDH1
e Trp53
alelos (S1 FIG). Oito linhas de células humanas de GC (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, e NUGC4 HSC60) também foram utilizados neste estudo. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY e KATO-III foram adquiridos a partir de banco de células RIKEN (Tsukuba, Japão). células NUGC4 e AGS foram obtidos a partir da pesquisa da ciência Banco de Recursos Humanos (Osaka, Japão) e a ATCC (American Type recolha de células). HSC60 células foram obtidas do Dr. Kazuyoshi Yanagihara (National Câncer Research Center, Tóquio, Japão) [24]. células KATO-III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS e HSC60 foram cultivadas em meio RPMI 1640, e GCIY foi cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco, ambos os quais foram complementados com soro bovino fetal a 10%. Para os estudos de-metilação, murino e células GC humanos foram tratados diariamente com 500 nM de 5-aza-desoxicitidina (5-aza-dC, Sigma; # A3656) durante 72 horas. Tratamos essas células GC com 100nM tricostatina A (TSA, Wako;È-11993) durante 24 horas ou 100 nM mitramicina A (Wako;„-17101) durante 24 horas}

Dezoito tecidos GC primárias e correspondente. mucosas gástricas cancerosas não foram obtidas de 15 ratos DCKO. Quanto aos tecidos do estômago humanos, usamos três mucosa gástrica não-cancerosas de pacientes do GC. Também obtivemos cinco mucosa gástrica normal a partir de Atp4b-Cre
^{-
; CDH1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
ratos que foram utilizados como controlos negativos em nosso estudo anterior [19]. Neste estudo, chamado de "mucosas normais gástrica" ​​Se as amostras foram obtidas de camundongos de controle, e "mucosa gástrica não-cancerosas" se as amostras foram obtidas de camundongos DCKO e pacientes GC humanos neste estudo.}

A transcrição reversa (RT) -PCR e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR)

o ARN total foi isolado com um kit RNeasy Mini (Qiagen;˥34) e o ADNc foi preparado a partir de RNA usando um kit SuperScript III (Invitrogen;´80044) de acordo com os protocolos do fabricante. ponto final RT-PCR realizada com vários números de ciclo, 28-35 ciclos. Como um controlo interno, da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (
GAPDH) foi amplificado com 21 ciclos para garantir a qualidade e quantidade de ADNc para cada RT-PCR. Os produtos amplificados foram carregados para geles de agarose a 2% ou quantificados por RT-PCR quantitativo utilizando LightCycler ADN mestre SYBR Green I (Roche Diagnostics;/07516001). Os programas de amplificação para PCR foram repetidos para 40 ciclos para GAPDH e 45cycles para outros genes, excepto para GAPDH. Os produtos de PCR foram clonados no vector de T-pMD20 usando um kit de clonagem TA poderoso (Takara BIO INC;ɚ8), e, em seguida, sequenciados directamente. As sequências dos iniciadores e tamanhos de produtos PCR são mostrados na Tabela S1.

análise de metilação

extraiu-se DNA genómico a partir de células de murídeo e linhas GC humanos pelo método de fenol-clorofórmio, e, em seguida, levada a cabo bissulfito modificação e o procedimento MSP. tratamento com bissulfito de ADN foi realizada com o EZ Metilação de DNA-ouro (Zymo Research; # D5006), e em seguida de PCR (MSP) específicos para a metilação foi conduzido. Resumidamente, a reacção de PCR foi realizada durante 35 ciclos em 25 ul de uma mistura compreendendo ADN modificado com bissulfito, 2.5μl de 10x tampão PCR, 1,25 ul de 25 mM de dNTPs, 25 pmol /l de cada iniciador e 1 U de polimerase JumpStart RedTaq (Sigma; # D0563). As condições de PCR foram as seguintes: 95 ° C durante 5 minutos; 35 ciclos de 95 ° C durante 1 minuto, 53 ° C durante 2 minutos, e 72 ° C durante 1,5 minutos; e uma extensão final a 72 ° C durante 5 minutos. Tal como para os tecidos do rato GC, o DNA foi extraído de tecidos embebidos em parafina e fixados em formalina (FFPE). ADN bissulfito foi amplificada com iniciadores de PCR que flanqueiam e MSP, em seguida, foi realizado aninhados [25, 26]. As sequências dos iniciadores e tamanhos de produtos de PCR são apresentados na Tabela S2

cromatina imunoprecipitação (CHIP) Ensaio

O ensaio ChIP foi realizada utilizando um kit ChIP-IT Express (Motif ativa;Ȓ08). de acordo com o protocolo do fabricante. enriquecimento ADN imunoprecipitado foi normalizada como para a entrada. Os anticorpos utilizados neste estudo foram anti-histona H3K4me3 (Motif ativa;Ə15), (Motif ativa;ƍ65) anti-H3K9me3, anti-H3K27me3 (Motif ativa;Ƈ55), anti-H3K36me2 (Abcam; # ab9049) , anti-SP1 (Abcam; # ab13370), e (motivo Activo;Ƈ63) anti-Histona H3 anticorpos. IgG normal de coelho (Cell Signaling Technology,Đ9s) foi utilizado como um controlo negativo para o chip. As sequências dos iniciadores e tamanhos de produtos de PCR são mostrados na Tabela S2.

análise Knockdown usando pequenos RNAs de interferência

knockdown à base de siRNA de Suv39h1
e Suv39h2
foi realizada utilizando um (sistema de transfecção de néon, Invitrogen), a electroporação de acordo com as instruções do fabricante. células DMLU foram transfectadas com 50nM siRNA de Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226) ou controle negativo siRNA (Missão siRNA Universal Negative Control, Sigma). Após 48 horas de cultura, as células foram colhidas para RT-PCR, análises de Western blot, a migração, invasão e ensaio de proliferação.

Análise Western Blot

GC células foram lisadas com tampão RIPA Pierce (Thermo Scientific;΃00). As proteínas foram separadas em géis de SDS-poliacrilamida e, em seguida, transferido para o fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas, seguido por incubação com anticorpos dissolvidos em solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 2% de leite desnatado e 10% de Tween 20. Os anticorpos primários utilizados neste estudo foram monoclonal de ratinho anti-TWIST1 (1: 100, Santa Cruz Biotecnologia; # SC-81417), anticorpos policlonais de coelho anti-SP1 (1: 200, motivo Activo;Ɔ58), e anticorpo monoclonal de ratinho anti-α-tubulina ( 1: 200, Santa Cruz; # sc-8035) anticorpos. Os anticorpos secundários eram anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina (1: 3000, Bio-Rad Laboratories;ª6518) e anti-IgG de ratinho (1: 3000, Bio-Rad Laboratories;ª6520). As manchas foram desenvolvidos com ImmunoStar AP Substrato (Bio-Rad Laboratories;
.705.018)

Imunohistoquímica

seções FFPE (4 mm) foram desparafinados em xileno, reidratados em soluções de etanol classificados e, em seguida, a recuperação Antigen. foi realizada em tampão de ácido cítrico 10 mM, por microondas. A imuno-histoquímica foi realizada utilizando anticorpos anti-TWIST1 (Santa Cruz, 1:20), como descrito anteriormente [19]. Expressão de TWIST1 foi definida como a coloração nuclear positiva em mais de 10% das células, e a intensidade foi marcado como- (negativo), + (fraco) e ++ (moderada a forte) por três investigadores independentemente.

Resultados

expressão TWIST1 em murino e linhas de células GC humanos

A partir de tecidos de camundongos DGC DCKO, TWIST1
linhas celulares de transcrição-positivas (DMLU-7, MDGC- 8 e MDGC-9) e linhas de células negativas (MDGC-1 e MDGC-3) foram estabelecidos (Figura 1A e Figura S2A), e a expressão de proteína TWIST1 foi confirmada em cada linha celular (Figura 1B). TWIST1 expressão foi aumentada aos níveis de mRNA e proteína em células MDGC expressão negativa TWIST1 após o tratamento com o agente de ADN desmetilação 5-aza-dC (Fig 1C e 1D), enquanto que a sua expressão não foi mudado após o tratamento com TSA inibidor da desacetilase de histona (S2B FIG). Em oito linhas de células humanas examinadas GC, TWIST1
expressão foi regulada negativamente em quatro linhas de células (Fig 1E, esquerda), três (KATO-III, e GCIY AGS) dos quais demonstrou a re-activação de expressão TWIST1
após o tratamento com 5-aza-dC por RT-PCR (exemplo, a Fig 1E, direita). Quanto a TWIST1
linhas celulares GC expressão positiva, depois de 5-aza-dC tratamento, 2.1- e 3,2 vezes aumento da regulação do TWIST1
foi detectado em MKN45 e MKN7, respectivamente, por qRT-PCR, enquanto a expressão TWIST1 não foi alterado no DMLU-9 células (Fig 1F).

metilação CGI e expressão de TWIST1
em GC linhas celulares

TWIST1
tem uma região CGI denso a partir do promotor de todo o exão 1, sendo esta região altamente conservada entre vertebrados, incluindo rato e humana (Figura S3). Para esclarecer o CGI no rato e humano TWIST1
, foi realizada a análise computacional utilizando UCSC Genome Browser de (http://genome.ucsc.edu/index.html) e MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /), que é amplamente utilizado como identificação de CGI e primers MSP [27]. Foram analisados ​​aproximadamente região de 1,4 kb incluindo o promotor e todo o exão 1. UCSC Genome Browser no rato e humano exibiu uma análise CGI na região examinada (dados não mostrados). No entanto, dois locais putativos CGI foram detectados na região em ambos rato e humano, quando foram utilizados os critérios de CGI com teor de GC de 50% e observada /esperada proporção de CpG de 0,8 por MethPrimer (Fig 2A e 2C). Estas duas regiões CGI putativos foram localizados no promotor e do exão 1. Uma vez que a metilação na região promotora foi descrita em vários cancros humanos [12, 14], que inicialmente examinados o estado de metilação da região em murino e linhas de células humanas GC pelo MSP. No entanto, o estado de metilação na região promotora de TWIST1
não correspondia à sua expressão em todas as linhas de células GC examinados (P1 região, Fig 2A). Para determinar as regiões criticamente metilados associadas à expressão TWIST1 em células DMLU, realizamos mais MSP na região do CGI no exão 1 (E1-1, E1-2 e E1-3), eo site costa CpG previu localizado a cerca de 1,6 kb a partir de TSS (local transcrição início, S1) (Fig 2A). Como resultado, a metilação CGI na região (E1-1 e E1-2) em torno do TSS em TWIST1
exão 1 foi encontrada para corresponder a expressão do gene em células MDGC, embora não houvesse nenhuma correlação entre -los na região prevista costa (S1) e a extremidade da região do exão 1 (E1-3) (figura 2B, esquerda) em células MDGC. Sem metilação foi detectado em quaisquer regiões CpG em três mucosa gástrica normal, sem expressão TWIST1 de Atp4b-Cre
^{-
; CDH1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
camundongos (Fig 2B). Na mucosa gástrica humana, nenhuma TWIST1
metilação foi também encontrada em três mucosa gástrica não-cancerosas de pacientes GC (Fig 2D), um dos quais mostraram muito fraco expressão TWIST1
(dados não mostrados ). Examinámos também quatro mucosa gástrica não-canceroso adicional de pacientes de GC, enquanto que a metilação não foi detectada na região E1-2 em todos os casos (dados não mostrados). sequenciação de bissulfito (BS) demonstraram que a região do CGI no exão 1 mostrou metilação densa em células MDGC-3 Expressão-negativo TWIST1 mas não em TWIST1-positiva MDGC-9 células (BS-C, Figura 2A e 2B, à direita), enquanto há houve diferença nos padrões de metilação entre eles na costa de CpG e regiões promotoras (BS-a-B e BS, S4A FIG). Entre as linhas de células GC humanos, KATO-III e GCIY sem TWIST1
expressão mostrou metilação CGI densa na região do exão 1 (E1-2) que é consistente com os de rato TWIST1
(Figura 2C e 2D, esquerda). Ambos metilação e unmethylation na região de E1-2 foram detectados em células MKN45 MKN7 e por sequenciação de MSP e bissulfito (Figura 2D), que são expressas TWIST1 basal, mas os seus níveis de expressão aumentaram após o tratamento com 5-aza-dC (Figura 1F). Assim, os nossos dados indicam que a metilação na região do exão 1 de TWIST1
detectados neste estudo está relacionada à sua expressão.}

TWIST1
metilação e expressão em DCKO rato GC amostras de tecido

Foi examinado o estado de metilação de TWIST1
usando 18 tecidos GC primárias de 15 ratos DCKO. Dado que as regiões de GC foram muito pequena e o seu ADN a partir de amostras de FFPE mostraram baixas concentrações, foi realizada MSP aninhada [25, 26]. TWIST1
metilado foi significativamente (18/09, 50%) em comparação com GCs primárias correspondentes tecidos não cancerosos (1/10, 10%), sendo diferença estatisticamente significativa (P < 0,05, Quadro 1). Os dados representativos de MSP estão apresentados na Fig 3A. Entre eles, 4 de 10 (40%) casos foram intramucosal e 5 de 8 (62,5%) foram GCs invasiva (Tabela 1). Neste estudo, TWIST1
casos de metilação positivo demonstrado bandas MSP não metiladas, assim, que, devido à presença do normal do estroma /fibroblastos e células inflamatórias em secções de tecido de câncer, embora não podia negar a possibilidade de metilação parcial como MKN45 e MKN7 e heterogeneidade do tumor.
expressão da proteína

TWIST1 foi detectada em 7 de 18 (38,9%) em comparação com GCs correspondente mucosa gástrica não-canceroso por imuno-histoquímica. imagens representativos são mostrados na figura 3B. Analisamos ainda mais a relação entre a TWIST1
níveis de expressão e de metilação nestes casos. Entre os 18 GC primária examinados, nove casos mostrou correlação entre a TWIST1
metilação e de expressão (Fig 3C). Três dos quatro casos com TWIST1 expressão fraca exibiu sua metilação, possivelmente, que a baixa expressão de TWIST1 pode ser causada por sua metilação. No entanto, cinco casos restantes não exibiu metilação e de expressão (Tabela 1).

metilação histona está relacionada com a regulação da TWIST1
expressão

A seguir, investigou se ou não o nível de metilação de lisina de histona H3 contribui para a expressão TWIST1
. imunoprecipitação ensaios (chip) Chromatin foram realizados sobre o CpG costa previsto (CP1.3k), promotor (CP1), e os exões 1 2 regiões (CE2) (Fig 2A) (CE1-1 e CE1-2) e. Nas regiões CP1 e CE1-2, marca histona ativa H3K4me3 foi enriquecida em células de expressão positiva TWIST1 (DMLU-7 e DMLU-9), mas marca de histona inativa H3K9me3 foi enriquecida em células de expressão negativa TWIST1 (DMLU-1 e DMLU -3) (Fig 4A e 4B). Os ensaios de ChIP exibiu tanto sinais H3K9me3 H3K4me3 e em MDGC-1 e células MDGC-3 com 5-aza-dC tratamento, indicando os níveis elevados H3K4me3 nestas células (FIG 4c). Pelo contrário, os níveis H3K27me3 e H3K36me2 não foram correlacionadas com a expressão TWIST1 em quaisquer células MDGC examinadas neste estudo. Como para linhas de células GC humanos, uma região semelhante localizado a partir do promotor ao exão 1 mostrou H3K4me3 enriquecimento em TWIST1
células MKN45 expressão positiva, e H3K9me3 em TWIST1
expressão negativa KATO-III células (Figuras 2C e 4D).

Suv39h1
e Suv39h2
, uma metiltransferase histona, regula H3K9me3

Há uma grande quantidade de metiltransferases de histonas associadas com H3K4, H3K9 e H3K27 [28]. Portanto, para determinar quais as enzimas de modificação das histonas são responsáveis ​​pelo enriquecimento H3K4me3 ou H3K9me3 no TWIST1
exão 1 região em células GC, examinamos dez H3K4me3 ( Mll1
, MLL2
, Mll3
, Mll4
, Setd1a
, Setd1b
, Ash1
, Ash1l
, Smyd3
e Meisetz
), sete H3K9me3 ( Suv39h1
, Suv39h2
, G9a
, Setdb1
, Clld8
, Glp
e Riz1
), e um H3K27me3 ( EZH2
) genes relacionados. Os dados representativos são apresentados na Fig 5A. Entre eles, os níveis de expressão Suv39h1
e Suv39h2
foram inversamente correlacionada com a expressão TWIST1
. No entanto, os níveis de permanecer 16 genes da histona methylatasferase examinados expressão não foram associados com expressão TWIST1
em células DMLU. Foi realizada knockdown à base de siRNA de Suv39h1
ou Suv39h2
nos respectivos DMLU-1 e DMLU-3 células de expressão positiva por eletroporação (Fig 5B). Knockdown de Suv39h1
ou Suv39h2
nestas linhas celulares levou a um aumento de TWIST1
expressão observável na RT-PCR (Fig 5B) e qRT-PCR (MDGC- 1, Fig 5C)

Associação de SP1 com a regulação da transcrição da TWIST1

o consenso 5 '-. (G /T) GGGCGG (G /a) ( sequência G /a) (C /T) -3 'é conhecido como o motivo de ligação de factor de transcrição Sp1, e uma relação entre a metilação do CGI e Sp1 ligação no promotor foi relatada [29, 30]. Vários locais de ligação SP1 foram previu na região CpG-ricos dentro TWIST1
exão 1 com TFBIND (http://tfbind.hgc.jp) e Jaspar (http://jaspar.binf.ku.dk) . O papel do SP1 na transcrição da TWIST1
foi então examinado com referência à modificação epigenética do gene. Detectamos expressão de ARNm e proteína de Sp1 em todas as células de murino e GC humano examinadas, mesmo nas células de expressão-negativo MDGC-1, 3-MDGC, KATOIII e GCIY TWIST1 (Fig 6A).

Para determinar se ou Sp1 não se liga às regiões do TWIST1
promotor e do exão 1 em células de GC, foi realizado ensaio ChIP de Sp1 usando células MDGC (Fig 2A). Sp1 ligado às regiões do TWIST1
promotor (CP1) e o exão 1 (CE1-2) em linhas celulares de expressão positiva TWIST1 (MDGC-7 e MDGC-9) (Fig 6B). Em contraste, as linhas celulares de expressão negativa TWIST1 (DMLU-1 e DMLU-3) apresentaram níveis indetectáveis ​​do SP1 sinais de ligação às regiões CP1 e CE1-2. Sp1 não se ligou a quaisquer regiões do regiões 2 (EC2) nestas células MDGC expressão positivos e negativos TWIST1 costa previu CpG (CP1.3k) e o exão. A desmetilação com 5-aza-dC ligação aumentada Sp1 nas regiões 1 TWIST1
de promotor como de exões em células de expressão-negativo TWIST1 MDGC-1 e MDGC-3 (Fig 6B). Mitramicina A é conhecida para interferir com a ligação SP1 para sequências reguladoras ricos em CpG [31, 32]. Notou-se que TWIST1
expressão foi regulado negativamente após o tratamento com mitramicina A em suas células de expressão GC-positivo (MDGC-7, 9-MDGC, MKN7 e células MKN45 (Figura 6C) e S6 FIG). Mitramicina A não mostrou qualquer efeito na expressão de Sp1 nestas células (dados não apresentados). Aumento da regulação do TWIST1
por 5-aza-dC foi diminuída em mitramicina Um tratamento em células DMLU-3 (p = 0,04, Fig 6D).

Discussão

os mecanismos subjacentes regulação epigenética da oncogene são mal compreendidos. A relação entre o estado de metilação no TWIST1
regiões promotoras e expressão de TWIST1
é controverso, e há quase nenhum dos relatórios sobre a modificação da histona alterada na expressão TWIST1
. Assim, permanece incerto se ou não mudanças epigenéticas estão relacionados com a TWIST1
ativação em células cancerosas. À medida que novas descobertas deste estudo, elucidou o TWIST1
mecanismo regulador subjacente máquinas epigenética fundamental que a metilação do DNA, modificação da histona e agir Sp1 em concerto com expressão TWIST1 em células GC.

É amplamente conhecido que a metilação do ADN na região do promotor de CGI é crítica para o silenciamento do gene, e metilação aberrante CGI resulta na perda da expressão de vários ETG [10]. TWIST1 foi re-activado em ambas as células GC murinos e humanos com 5-aza-dC tratamento neste estudo, indicando que a activação da transcrição de TWIST1 também é modulado por metilação do DNA. metilação CGI do TWIST1 e região promotor foi encontrado em vários tipos de câncer, como gástrico, de mama, colorretal e de pulmão aqueles [11, 12, 14], a maioria dos quais não mostraram nenhuma correlação entre a TWIST1
metilação e expressão. Observou-se que a metilação do CGI em TWIST1
exão 1 excepto na região promotora correspondeu à sua expressão de genes em células de rato GC. Como para linhas de células GC humanos, TWIST1
linhas celulares de expressão-negativos foram totalmente metilado, mas suas linhas de células de expressão positivo exibiram tanto metilação e unmethylation de TWIST1
, todos os quais up-regulada expressão TWIST1
após o tratamento com 5-aza-dC (Figura 1F). Estes dados indicam que as células MKN45 e MKN7 mostrou parcialmente metilação do TWIST1
, e os níveis de meia de TWIST1
expressão foram basally detectado nestas células, que foram expressas a partir alelo DNA não metilado. Relatórios recentes indicam que CpG metilação costa está relacionado com a expressão do gene [7, 33]. No entanto, o estado de metilação na região do sítio costa previu CpG não se correlacionou com a expressão TWIST1
. Nossos dados indicam que TWIST1
é epigenetically silenciados pela metilação do DNA em murino e células GC humana linhas.

De acordo com a análise computacional de mouse e CGIs humana a partir do promotor a toda a região de codificação na gene TWIST1
, duas regiões CGI putativos foram localizados no promotor e exão 1 por análise MethPrimer. Aqui observamos que a metilação CGI no exão 1, ao invés de sua região promotora, foi correlacionada com a expressão TWIST1
em células GC. Tais padrões de metilação distintos associados com o silenciamento do gene têm sido relatados em vários genes [26, 34, 35]. Por exemplo, SOX2
e AP2α
exibiram putativos dois CGIs do promotor e do exão 1, e metilação na região do exão 1 tem mostrado ser significativamente correlacionada com a sua expressão de genes em GCs e de mama cancros [34, 35]. Foi relatado que a metilação CGI em torno do local de iniciação da tradução no receptor beta do ácido retinóico (RAR-SS) gene dramaticamente correspondia à sua expressão em cancros do pulmão de murino em relação à metilação na região promotora localizada no mesmo CGI [26]. Assim, os nossos dados sugerem que a metilação CGI na região do exão 1 em TWIST1
é importante para o seu silenciamento de genes em células de GC. No entanto, desconhece-se o mecanismo desta metilação discrepantes entre a 1 regiões promotora e exão. Vários locais de ligação de factor de transcrição, tais como elementos de SP1 e modificação das histonas têm sido relatados para proteger CGI metilação [36, 37]. É importante examinar esses elementos e máquinas epigenética nas regiões CGI de TWIST1
mais.

Em GCs primária de camundongos DCKO, 50% dos GCs exibiu TWIST1
metilação por MSP aninhada. Os nossos ratos DCKO mostram focos parietal relacionados com células atípicas no estômago, e PED intramucoso compostos de células pouco diferenciadas e células em anel de sinete frequentemente detectados em 6 meses. Portanto, temos proposto anteriormente que os nossos PED em camundongos DCKO desenvolvido através da linhagem de células parietais [19]. TWIST1
foi metilado em 40% dos cânceres intramucoso, enquanto que a frequência de metilação na mucosa gástrica não-cancerosas, incluindo focos atípica foi rara (10%), indicando que TWIST1
metilação é um início evento em DGC carcinogênese nosso modelo de rato. Entre os 18 GCs primários analisados, cinco casos foram TWIST1
methylation- e expressão negativa.

• PLOS ONE: As estatinas Attenuate Helicobacter pylori CagA translocação e reduzir a incidência de câncer gástrico: In Vitro e de Base Populacional Estudos de Casos e Controles
• PLOS ONE: ressecção endoscópica Comparado com Gastrectomia tratar precoce do câncer gástrico: uma revisão sistemática e meta-Analysis