Ploche ONE: metylácie DNA v Exon 1 kraja a komplexné úpravy Twist1 Expresia v žalúdku nádorových buniek

Abstraktné

Twist1 nadmerná expresia je často pozorované u rôznych druhov rakoviny, vrátane rakoviny žalúdka (GC). Hoci DNA metylácie Twist1
génu bola hlásená u rakovinových buniek, mechanizmy transkripčný aktiváciu zostáva neistý. V tejto štúdii sme sa prvýkrát skúmal epigenetické zmeny na Twist1
pomocou Twist1
transkripcie-pozitívnych a -negativní bunkové línie, ktoré sú odvodené od nášho založená difúzna typu modelu GC myši. Liečba DNA demetylácia činidlá 5-aza-dC re-aktivovaná expresie v Twist1 Twist1 GC buniek expresnými-negatívny. Podľa metylácie-špecifické PCR a sekvenčné analýzou hydrogensiričitanovú, metylácie v CPG-bohaté oblasti v Twist1
kódujúci exon 1, skôr než jeho promotorové oblasti, bola pevne spojená s transkripčný umlčanie Twist1
expresie v myších GC buniek. Chromatín Imunoprecipitácia testy odhalili, že aktívna histónov značka H3K4me3 bol obohatený Twist1 expresných-pozitívnych buniek, a neaktívne histónov značka H3K9me3 bol obohatený Twist1 expresných-negatívnych buniek. Hladiny expresie Suv39h1 stroje a Suv39h2
, histónov metyltransferáza pre H3K9me3, boli negatívne koreluje s Twist1
vyjadrenia, a porazený zo Suv39h1
alebo Suv39h2
indukované Twist1
výraz. Okrem toho, Sp1 transkripčný faktor viaže na exóne 1 CPG bohatých regiónu v Twist1 expresných-pozitívnych bunkových línií, a Twist1
expresie bola znížená o mithramycin, ktorá, ktorá by ovplyvňovala Sp1 väzby na CPG bohatých regulačných sekvencií. Naše štúdie naznačujú, že Twist1
prepis do GC buniek by mohla byť regulovaná prostredníctvom možnú spoluprácu metylácie DNA, modifikácie histónov v komplexe SP1 väzby na CPG bohatých regiónov v rámci regiónu Exon 1.

citácie: Sakamoto a, Akiyama Y, Shimada s, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka s (2015) metylácie DNA v exóne 1 kraja a komplexné regulácia Twist1 prejavu v žalúdočnej rakovinové bunky. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10,1371 /journal.pone.0145630

Editor: Tae-Young Roh, Pohang University of Science and Technology (poštou), Kórejská republika

prijatá: 21.septembra 2015; Prijaté: 06.12.2015; Uverejnené: 22 decembra 2015

Copyright: © 2015 Sakamoto et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje spadajú do papiera a jeho podporné informácie súbory

Financovanie :. Táto práca bola podporená granty-v-pomoc pre vedecký výskum (c) (24590444) a (a) (25253081), a Foresight programu A3 (AA005) z Japonska spoločnosť pre podporu vedy (JSP) a praktického výskumu pre inovačné boja proti rakovine (15Ack0106017h0002) z japonskej agentúry pre lekársky výskum a vývoj, Amed; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.

súťažiť záujmy: autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Skratky :. BS, bisulfitového sekvenovania; CGI, CPG ostrova; Čipe, ​​chromatínu immunoprecipitation; DCKO, double podmienečný knockout myší; DGC, difúzny typ rakoviny žalúdka; GAPDH, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy; GC, rakovina žalúdka; H3K4me3, Histon H3 lyzín 4 tri-metylácie; H3K9me3, Histon H3 lyzín 9 tri-metylácie; H3K27me3, Histon H3 lyzín 27 tri-metylácie; MSP, metylácie špecifickej polymerázovej reťazovej reakcie; RT-PCR, reverznej transkripcie-polymerázovej reťazovej reakcie; QRT-PCR, kvantitatívnej RT-PCR; ZTS, tumor supresorových génov; TSS, prepis miesto počiatku; 5-aza-DC, 5-aza-2'-deoxycitidine

Úvod

Twist1, konajúci ako základný helix-loop-helix transkripčný faktor, nachádza sa priamo viaže na E-box prvkov (NCANNTGN ) na špecifických cieľových génov [1]. Twist1 je všeobecne známe, že je nevyhnutné pre tvorbu mesoderm počas skorého embryonálneho vývoja Drosophila a myši [2, 3]. V ľudských rakovín, ektopická expresia Twist1 Uvádza sa, že sú spojené s malígne progresie, invázia, epiteliálne-to-mechencymal prechodu, metastázy a stemness, čo naznačuje potenciálne onkogénnych funkcií Twist1 [4-6]. Tak, že je veľmi dôležité na objasnenie transkripčný regulačné mechanizmy pre Twist1 v nádorových bunkách.

epigenetických zmien, ako je metylácie DNA a modifikácie histónov, sú pevne spojené s umlčanie génu [7-9]. Aj keď epigenetické zmeny v CGI (CPG ostrov), promotorové oblasti tumor supresorových génov (ZTS) sú veľmi dobre známe, že sú spojené s ich génov inaktiváciu [10], mechanizmy epigenetické regulácia onkogénov sa zle rozumie. Niekoľko skupín ukázalo, že Twist1
sa znovu aktivuje spracovaním s de-metylácie liek, 5-aza-2'-deoxycitidine (5-aza-dC), v nádorových bunkách [11, 12]. Aberantne metylácie DNA v CGI promótor v ľudskom Twist1
bola často detekovaná v primárnych nádorov, vrátane rakoviny žalúdka (GC) [11-14]. Avšak, existuje mnoho poznatkov, že metylácie DNA na Twist1
promotorová oblasť nie je v korelácii s expresiou génu v rôznych druhov rakoviny [12, 14]. Kým Twist1
metylácie môže byť užitočným biomarker predpovedať klinické výsledky, pokiaľ ide recidívy a prežitie u pacientov s nádormi [12, 13, 15], zostáva kontroverzné, či je alebo nie je Twist1
metylácie v oblasti promotora vedie k umlčanie génu.

regulácia transkripcie génov koreluje s lyzín (k) metylácie vzory v Histon chvosta, ktoré sa skladajú z troch rôznych lyzínu metylačnej stavy (mono-, di- a tri-). Tri-metylácie H3K4 (H3K4me3) sa vzťahuje k aktivácii génov, a to H3K9me3 a H3K27me3 na gén potláčanie [7-9]. Hoci tieto tri históny H3-methyaltion vzory sú spojené s CGI metylácie rovnako, transkripčný regulačné mechanizmy Twist1
základné modifikácie histónov sú zle chápané v rakovinových bunkách.

GC je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu vo svete [16]. GC je rozdelená do dvoch hlavných histologických typov; difúzna a čriev, čo sú dve odlišné cesty karcinogénne [17]. rakovina žalúdka difúzny typ (DGC) je známe, že vykazujú časté invázie a metastáz, čo má za následok zlou prognózou [18]. Strata E-cadherinu a p53 bola hlásená u difúzny type žalúdočné karcinogenéze [19-21]. Niekoľko správ preukázali častou zvýšenú expresiu Twist1 v ľudských DGCs [22, 23].

sme skôr navrhovaný dvojaký podmienečný knockout (DCKO), myš linka pokiaľ ide o E-cadherinu a p53, ktoré sú špecificky inaktivovaný v žalúdku [ ,,,0],19]. Všetky myši DCKO vyvinutý fatálne DGCs počas roka, fenotypmi najvyšším invázie a časté metastázy do lymfatických uzlín. Je pozoruhodné, že sa expresia génu vzormi DGCs u myší DCKO zistených na microarray analýzy boli veľmi podobné tým, ktoré ľudských inými ako črevnú primárnych DGCs. Tak, náš model myš DCKO je výkonný nástroj pre skúmanie role génovej funkcie v DGC karcinogenéze a pre vývoj terapeutické stratégie. V tejto štúdii sme založili Twist1 expresie pozitívnych a negatívnych bunkových línií DGC, ktoré sú odvodené od myší DCKO. V dôsledku analýzy epigenetických zmien, spoločný regulačný mechanizmus Twist1
bola objasnená, a vyhodnotená v oboch myšiam a ľudským DGCs v tejto štúdii.

Materiály a metódy

Vyhlásenie etika

Všetko in vivo
postupy boli schválené výborom pre Animal Care of Tokyo lekárskych a stomatologických University (Povolenie č 0160073A). Pokiaľ ide o normálne ľudské žalúdočnej sliznice vzoriek, písomný informovaný súhlas bol získaný od všetkých subjektov, a štúdia bola schválená etickou komisiou Tokio lekárskych a stomatologických University (No.1115).

bunkových kultúr a vzorky tkaniva

Už skôr sme založili E-cadherinu /p53 DCKO ( Atp4b-Cre
^{+
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
) modelu u myší [19]. Od svojich rakovinových tkanív, sme založili päť myší DGC bunkových línií a pomenoval im MDGCs (Shimada S, nepublikované pozorovanie). MDGC-1 a MDGC-3 bunky boli kultivované v Dulbeccova modifikovanom Eaglovho média (DMEM) s vysokým obsahom glukózy, doplnenom 10% fetálneho séra hovädzieho dobytka, a MDGC-7, MDGC-8 a MDGC-9 boli kultivované v Hamově F12 doplnenom 5% konského séra. analýza DNA bola vykonaná s cieľom zistiť zrezaného Cdh1 stroje a Trp53
alely (S1 Obr). Osem ľudských GC bunkové línie (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 a HSC60) boli taktiež použité v tejto štúdii. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY a KATO-III boli získané od bunkovej banky Riken (Tsukuba, Japonsko). NUGC4 a AGS bunky boli získané z ľudského Science Research Resources Bank (Osaka, Japonsko) a ATCC (American Type Cell Collection). HSC60 bunky boli získané od Dr. Kazuyoshi Yanagihara (Cancer National Research Center, Tokyo, Japonsko) [24]. KATO-III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS a HSC60 bunky boli kultivované v médiu RPMI 1640, a GCIY bol kultivované v Eaglovho média Dulbecco, ktoré boli obaja, doplnenom 10% fetálneho hovädzieho séra. Pre de-metylácii štúdií, myšiach a ľudských GC buniek boli ošetrené denne 500 nm 5-aza-deoxycytidínu (5-aza-dC, Sigma, # A3656) po dobu 72 hodín. Liečili sme tieto GC buniek s 100 nM trichostatin A (TSA, Wako;È-11993) po dobu 24 hodín alebo 100 nM mithramycin A (Wako;„-17101) po dobu 24 hodín}

Osemnásť primárnej GC tkaniva a zodpovedajúce. non-rakovinové žalúdočnej sliznice boli získané z 15 DCKO myší. Pokiaľ ide o ľudské žalúdočné tkaniva, sme použili tri Nerakovinový žalúdočnej sliznice od pacientov GC. Sme tiež získať päť normálne žalúdočnej sliznice zo Atp4b-Cre
^{-
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
myši, ktoré boli použité ako negatívne kontroly v našej predchádzajúcej štúdii [19]. V tejto štúdii sme nazvali "normálne žalúdočnej sliznice" v prípade, vzorky boli získané od kontrolných myší, a "non-rakovinové žalúdočnej sliznice" v prípade, vzorky boli získané od DCKO myšiach a ľudských pacientov GC v tejto štúdii.}

reverznej transkripcie (RT) -PCR a kvantitatívnej RT-PCR (QRT-PCR)

Celková RNA bola izolovaná pomocou súpravy RNeasy Mini (Qiagen;˥34) a cDNA bol pripravený z RNA pomocou súpravy Superscript III (Invitrogen;´80044) podľa protokolov výrobcu. Koncový bod RT-PCR vykonávaná s viac čísel cyklov, 28-35 cyklov. Ako vnútorná kontrola, glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy ( GAPDH
) bola amplifikovaná s 21 cyklami pre zabezpečenie kvality cDNA a množstvo každého RT-PCR. Amplifikované produkty boli naložené na 2% agarózovom gélu, alebo kvantifikujú pomocou kvantitatívnej RT-PCR s použitím DNA LightCycler hlavné SYBR Green I (Roche Diagnostics,/07516001). Amplifikačnej program pre PCR bola opakovaná počas 40 cyklov pre GAPDH a 45cycles pre iné gény okrem GAPDH. PCR produkty boli klonované do pMD20 T-vektora pomocou Mighty TA-klonovania Kit (Takara BIO INC;ɚ8), a potom sekvenované priamo. Tieto sekvencie primérov a veľkosti produktov PCR sú uvedené v tabuľke S1.

Metylácia Analýza

extrahuje sme genómovej DNA z myších a ľudských bunkových línií GC metódou fenol-chloroformom, a potom vykonáva bisulfitového modifikácie a postup MSP. Bisulfitového DNA bola vykonaná s EZ metylácie DNA-zlato (ZYMO výskum, # D5006) a potom metyláciou špecifická PCR (MSP) bola vykonaná. V stručnosti, PCR reakcia bola vykonávaná po dobu 35 cyklov v 25 ul zmesi obsahujúce bisulfitová modifikované DNA, 2.5μl 10X PCR pufra, 1,25 ul 25 mM dNTP, 25 pmol /l každého primeru a 1 U polymerázy z JumpStart RedTaq (Sigma , # D0563). Podmienky pre PCR boli nasledujúce: 95 ° C po dobu 5 minút; 35 cyklov 95 ° C počas 1 minúta, 53 ° C počas 2minutes a 72 ° C počas 1.5minutes; a záverečná extenzie pri 72 ° C po dobu 5 minút. Pokiaľ ide o myší GC tkanív, DNA bola extrahovaná z parafínových (FFPE) tkanív formalínom fixované. Hydrogensiričitanovú DNA bola amplifikovaná so sprievodnými primerov PCR a potom vnorené MSP bola vykonaná [25, 26]. Tieto sekvencie primérov a veľkosti produktov PCR sú uvedené v tabuľke S2 ​​

chromatín Imunoprecipitácia (Chip) test

Test čip bol vykonaný s použitím súpravy Chip-IT Express (Active Motif,Ȓ08). podľa protokolu výrobcu. Imunoprecipitovány obohatenie DNA sa normalizujú na vstup. Protilátky použité v tejto štúdii boli anti-Histon H3K4me3 (Active Motif;Ə15), anti-H3K9me3 (Active Motif;ƍ65), anti-H3K27me3 (Active Motif;Ƈ55), anti-H3K36me2 (abca; # ab9049) , anti-SP1 (abca; # ab13370), a anti-Histon H3 (Active Motif;Ƈ63) protilátky. Normálne králičie IgG (Cell Signaling Technology,Đ9s) bola použitá ako negatívna kontrola pre triesok. Tieto sekvencie primérov a veľkosti produktov PCR sú uvedené v tabuľke S2.

Knockdown analýzy pomocou malej interferujúce RNA

siRNA na báze porazený zo Suv39h1 stroje a Suv39h2
sa vykonáva za použitia elektroporácie (transfekční systém neón, Invitrogen) podľa inštrukcií výrobcu. MDGC bunky boli transfekovány 50 nM siRNA Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226), alebo negatívna kontrola siRNA (siRNA Mission univerzálne negatívne kontroly, Sigma). Po 48 hodinách kultivácie boli bunky izolované pre RT-PCR, Western blot analýzy, migrácie, invázie a proliferácie.

Analýza Western Blot

GC boli bunky lyžovanie s Pierce RIPA pufra (Thermo vedecký;΃00). Proteíny boli separované na SDS-polyakrylamidových géloch a prenesené do polyvinylidénfluoridu (PVDF) membrány, s následnou inkubáciou s protilátkami rozpustené v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku (TBS) obsahujúcim 2% odstredeného mlieka a 10% Tween 20. Primárne protilátky použité v tejto štúdie boli myšou monoklonálna anti-Twist1 (1: 100, Santa Cruz Bio-technika; # sc-81417), králičie polyklonálne anti-Sp1 (1: 200, Active Motif,Ɔ58) a myšou monoklonálnou anti-α-tubulín ( 1: 200, Santa Cruz, # sc-8035), protilátky. Sekundárne protilátky boli alkalickou fosfatázou konjugovanou anti-králičie IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories,ª6518) a anti-myší IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories,ª6520). Bloty boli vyvinuté s ImmunoStar AP substrátu (Bio-Rad Laboratories,ª5018)

Imunohistochémia

FFPE úseky (4 um) boli deparafinizovány v xyléne, rehydrated v odstupňovaných roztokoch etanolu a potom Antigen načítanie. bola vykonaná v 10 mM pufri kyseliny citrónovej sa v mikrovlnnej rúre. Imunohistochémia bola vykonaná s použitím anti-Twist1 protilátky (Santa Cruz, 1,20), ako bolo opísané skôr [19]. Expresia Twist1 bola definovaná ako pozitívna jadrové farbenie u viac ako 10% buniek, a intenzita bola hodnotená as- (negatívne), + (slabý) a ++ (stredné až silné), vyšetrovatelia tromi nezávisle.

Výsledky

výrazom Twist1 v myšiach a ľudských bunkových línií GC

z DGC tkanív DCKO myšou, Twist1
transkripčný-pozitívne bunkové línie (MDGC-7, MDGC- 8 a boli stanovené MDGC-9) a negatívne bunkové línie (MDGC-1 a MDGC-3) (obr 1A a obr S2A), a expresie Twist1 proteínu bola potvrdená v každej bunkovej línii (obrázok 1B). Twist1 expresie bola zvýšená na úrovni mRNA a bielkovín v Twist1 expresných-negatívne MDGC buniek po liečbe s DNA demetylovaného činidlá 5-aza-dC (obr 1C a 1D), zatiaľ čo jeho expresie sa nemení po ošetrení TSA inhibítora Histon Deacetylase (S2B obr). V osem ľudských GC bunkové línie skúmal, Twist1
expresie bola downregulated v štyroch bunkových líniách (Obr 1E, vľavo), tri (KATO-III, GCIY a AGS), z ktorých preukázal opätovnej aktivácie Twist1
expresie po liečbe s 5-aza-dC pomocou RT-PCR (napríklad obr 1E, vpravo). Čo sa týka Twist1
expresné-pozitívny GC bunkové línie, po 5-aza-DC liečby, 2.1- a 3,2-násobne up-regulácia Twist1
bola zistená v MKN45 a MKN7, v uvedenom poradí, podľa QRT-PCR, zatiaľ čo Twist1 výraz nebol zmenený v MDGC-9 buniek (obr 1F).

CGI metylácie a expresie Twist1
v GC bunkové línie

Twist1
má hustú oblasť CGI z promótorom do celého exónu 1, táto oblasť je vysoko konzervovaný medzi stavovce, vrátane človeka a myši (S3) Obr. K objasneniu CGI v myší a ľudskej Twist1
sme vykonali počítačovú analýzu pomocou UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/index.html) a MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /), ktorý je široko používaný ako označenie CGI a MSP primery [27]. Analyzovali sme približne 1,4 kb oblasť vrátane promotora a celý exón 1. UCSC Genome Browser v myší a ľudskej analýze vykazovali jeden CGI v oblasti skúmané (dáta nie sú uvedené). Avšak, dve putativní CGI miesta bola zistená v oblasti ako v myši a človeka, keď sme použili kritériá CGI s obsahom GC 50% a pozorovať /očakávaný pomer CPG 0,8 pomocou MethPrimer (obr 2A a 2C). Tieto dva predpokladané CGI oblasti boli umiestnené na promótor a exóne 1. Vzhľadom na to, metylácie v oblasti promotora bola popísaná v rôznych ľudských nádorov [12, 14], sme najprv skúmala metylačného statusu v regióne v myšiach a ľudských bunkových líniách GC o MSP. Avšak, stav metylácie v promotorové oblasti Twist1
nezodpovedala jeho expresie v žiadnom bunkových línií GC skúmaná (oblasť P1, obr 2A). Pre stanovenie kriticky methylata regióny spojené s expresiou v Twist1 MDGC bunkách, sme ďalej vykonáva MSP v oblasti CGI v exóne 1 (E1-1, E1-2 a E1-3), a predpokladaná breh v mieste CPG sa nachádza približne 1,6 kb z TSS (miesto počiatku prepis, S1) (obrázok 2A). V dôsledku toho, CGI metylácie v oblasti (E1-1 a E1-2) okolo TSS v Twist1
exón 1 bolo zistené, že zodpovedá expresiu génu v bunkách MDGC, hoci tam bola žiadna korelácia medzi je na brehu predpokladané oblasti (S1) a na konci exónu 1 regiónu (E1-3) (obr 2B, vľavo) v MDGC bunkách. Nie metylácie bola detekovaná vo všetkých oblastiach CPG v troch normálne žalúdočnej sliznicou, bez Twist1 výrazu od Atp4b-Cre
^{-
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
myší (obr 2B). V ľudskej žalúdočnej sliznice, nie Twist1
metylácie bola tiež nájdená v troch bez rakoviny žalúdka sliznice z GC pacientov (obr 2D), z ktorých jeden ukázal veľmi slabý Twist1
expresie (údaje nie sú uvedené ). Tiež sme skúmali ďalšie štyri Nerakovinový žalúdočnej sliznice od pacientov GC, zatiaľ čo žiadna metylácie bola detekovaná v oblasti E1-2 vo všetkých prípadoch (dáta nie sú uvedené). Bisulfitového sekvenovania (BS), preukázala, že oblasť CGI v exóne 1 ukázal hustú metylácie v Twist1 bunkách expresných-negatívne MDGC-3, ale nie v Twist1-pozitívnych MDGC-9 bunky (BS-C, obr 2A a 2B, vpravo), zatiaľ čo tam nebol žiadny rozdiel v metylačnej vzoroch medzi nimi na brehu CPG a promotorových oblastí (BS-a a BS-b, S4A obr). Medzi ľudských bunkových línií GC, KATO-III a GCIY bez Twist1
výrazom ukázal hustú CGI metylácie v oblasti exónu 1 (E1-2), čo je v súlade s tými myšou Twist1
(obr 2C a 2D, vľavo). Ako metylácie a unmethylation v oblasti E1-2 boli detekované v MKN7 a MKN45 buniek MSP a hydrogénsiričitanu sekvencovania (obr 2D), ktoré sú vyjadrené basally Twist1 ale ich hladiny expresie boli zvýšené po liečbe 5-aza-dC (obrázok 1F). Tak, naše dáta ukazujú, že metylácie v Exon 1 regióne Twist1
zistené v tejto štúdii je v korelácii s jeho expresie.}

Twist1
metylácie a expresie v DCKO myši GC vzorky tkaniva

skúmali sme metylačného statusu Twist1 for s 18 primárnych GC tkaniva pred 15 DCKO myšou. Vzhľadom k tomu, GC regióny boli veľmi malé a ich DNA zo vzoriek FFPE ukázala nízke koncentrácie, sme vykonali vnorené MSP [25, 26]. Twist1
významne methylata (9/18, 50%), v primárnych GC v porovnaní so zodpovedajúcimi non-rakovinové tkanivá (desatiny, 10%), štatisticky významný rozdiel (P menšia ako 0,05, tabuľka 1). Reprezentatívne údaje od MSP sú uvedené na obrázku 3a. Medzi nimi, 4 z 10 (40%) prípadov bolo intramucosal a 5 z 8 (62,5%) boli invazívne GCS (tabuľka 1). V tejto štúdii, Twist1
metylácie-pozitívnych prípadov preukázali nemethylované MSP pásma i, ktorá v dôsledku prítomnosti normálneho stromálneho /fibroblastov a zápalových buniek v tkanivových rezoch rakoviny, aj keď nemôže poprieť možnosť čiastočného metylácie ako MKN45 a MKN7 a heterogénnosti nádorov.
výraz

Twist1 proteín bol detekovaný v 7 z 18 (38,9%), GC v porovnaní so zodpovedajúcimi Nerakovinový žalúdočnej sliznice imunohistochemicky. Reprezentatívne snímky sú zobrazené na obr 3B. Ďalej sme analyzovali vzťah medzi Twist1
expresie a metylácie úrovniach v týchto prípadoch. Medzi 18 primárnej GC skúmal, deväť prípadov ukázala koreláciu medzi Twist1
metylácie a expresie (obrázok 3C). Tri zo štyroch prípadov sa Twist1 slabou expresiou vykazovali jeho metylácii, prípadne, že nízka expresia Twist1 môže byť spôsobená jeho metylácie. Avšak, zvyšných päť prípadov nepreukázali žiadnu metylácie a expresie (tabuľka 1).

Histon metylácie súvisí s reguláciou Twist1
výraz

Ďalej sme skúmali, či je alebo nie je lyzín úroveň metylácie histónov H3 prispieva k Twist1
výrazu. Chromatín Imunoprecipitácia (čipu) testy boli vykonávané na predpokladané CPG brehu (CP1.3k), promótor (CP1), a exóny 1 (CE1-1 a CE1-2) a 2 (CE2) oblasti (obr 2A). V regiónoch CP1 a CE1-2, aktívne histónov značka H3K4me3 bol obohatený Twist1 expresných-pozitívnych buniek (MDGC-7 a MDGC-9), ale neaktívne histónov značka H3K9me3 bol obohatený Twist1 expresných-negatívnych buniek (MDGC-1 a MDGC -3) (obr 4A a 4B). CHIP testy vykazovali ako H3K4me3 a H3K9me3 signály MDGC-1 a MDGC-3 buniek s 5-aza-dC liečby, čo naznačuje zvýšené hladiny H3K4me3 v týchto bunkách (obrázok 4C). Naopak, hladiny H3K27me3 a H3K36me2 neboli korelované s Twist1 expresie v akýchkoľvek buniek MDGC skúmanej v tejto štúdii. Čo sa týka ľudských GC bunkových línií, podobný región nachádza od promótorom do exónu 1 ukázala H3K4me3 obohatenie Twist1
expresné-pozitívne MKN45 bunky a H3K9me3 v Twist1
expresie negatívny KATO-III bunky (obr 2C a 4D).

Suv39h1 stroje a Suv39h2
, Histon metyltransferáza, reguluje H3K9me3

Existuje množstvo histónov metyltransferáza spojené s H3K4, H3K9 a H3K27 [28]. Preto, aby určiť, ktoré modifikácie histónov enzýmy sú zodpovedné za obohatenie na H3K4me3 alebo H3K9me3 Twist1
Exon 1 región GC buniek, sme skúmali desať H3K4me3 ( Mll1
Mll2
, Mll3
Mll4
Setd1a
Setd1b
Ash1
Ash1l
Smyd3 stroje a Meisetz
), sedem H3K9me3 ( Suv39h1
Suv39h2
G9a
Setdb1
, Clld8
GLP stroje a Riz1
), a jeden H3K27me3 ( Ezh2
) súvisiace gény. Reprezentatívne údaje sú uvedené na obr 5A. Medzi nimi expresné hladiny Suv39h1 stroje a Suv39h2
bola nepriamo úmerná Twist1
výrazu. Avšak, expresné hladiny zvyšných 16 histónov methylatasferase gény preskúmané neboli spojené s Twist1
expresie v MDGC bunkách. Vykonali sme siRNA na báze vyraďujúce Suv39h1
alebo Suv39h2
v príslušných MDGC-1 a MDGC-3 buniek expresie pozitívnych elektroporácie (obr 5B). Vyradenie Suv39h1
alebo Suv39h2
v týchto bunkových líniách viedlo k zvýšeniu o Twist1
výraz pozorovateľný na RT-PCR (obr 5B) a QRT-PCR (MDGC- 1, obr 5C)

Združenie SP1 s transkripčný reguláciou Twist1

konsenzom 5 '-. (G /T) GGGCGG (G /A) ( G /a) (C /T) -3 'sekvencie je známa ako väzbové motívy SP1 transkripčný faktor, a vzťah medzi CGI a metylácie Sp1 väzbové v promótorom bola označená [29, 30]. Niekoľko väzbové miesta SP1 boli predpovedal v CPG-bohaté oblasti v rámci Twist1
exón 1 s TFBIND (http://tfbind.hgc.jp) a JASPAR (http://jaspar.binf.ku.dk) , Úloha SP1 v transkripcie Twist1
sa preskúmalo vzhľadom na epigenetické modifikácie génu. Zistili sme expresiu SP1 mRNA a proteín pri všetkých myšiach a ľudskej GC buniek vyšetrených, a to aj v Twist1 expresných negatívnych MDGC-1, MDGC-3, KATOIII a GCIY buniek (obr 6a).

Ak chcete zistiť, či nie je Sp1 sa viaže na krajoch Twist1
promótor a exóne 1 v GC buniek, sme vykonali CHIP testu SP1 pomocou MDGC buniek (obr 2A). SP1 viazaný na krajoch Twist1
promótor (CP1) a exón 1 (CE1-2) v Twist1 expresných-pozitívnych bunkových líniách (MDGC-7 a MDGC-9) (obr 6B). Na rozdiel od toho Twist1 expresné-negatívne bunkové línie (MDGC-1 a MDGC-3) ukázala, nedetegovateľné hladiny Sp1 väzbové signálov v oblastiach CP1 a CE1-2. SP1 neviazal na akékoľvek regiónoch predpovedal brehu CPG (CP1.3k) a exón 2 (CE2) regióny v týchto Twist1 vyjadrení pozitívnych a negatívnych MDGC buniek. Demetylácia s 5-aza-DC zvýšil Sp1 väzbové na Twist1
promotorových a exon regiónoch 1 v MDGC-1 a MDGC-3 buniek Twist1 expresných-negatívne (obr 6B). Mitramycin A je známe, že interferujú s Sp1 väzby na CPG bohatých regulačnými sekvenciami [31, 32]. Bolo zistené, že Twist1
expresie bola down-regulované po ošetrení mithramycin A v jeho GC buniek expresnými-pozitívne (MDGC-7, 9-MDGC, MKN7 a MKN45 buniek) (obr 6C a S6 Obr). Mitramycin DID nevykazujú žiadny vplyv na SP1 expresiu v týchto bunkách (dáta nie sú uvedené). Up-regulácia Twist1
o 5-aza-dC bola znížená o mithramycin ošetrenie v MDGC-3 bunkách (p = 0,04, obr 6D).

Diskusia

tieto mechanizmy epigenetické reguláciu onkogénu sú zle pochopené. Vzťah medzi metylačného statusu u Twist1
promotorových oblastí a expresie Twist1
je kontroverzný, a tam sú takmer nikto správ na zmenené modifikácie histónov v Twist1
výrazu. To znamená, že zostáva neisté, či sú alebo nie sú epigenetické zmeny súvisia s Twist1
aktivácia v rakovinových bunkách. Ako nových poznatkov v tejto štúdii sme objasnil Twist1
regulačný mechanizmus, z ktorého základné epigenetické stroje, ktoré metylácie DNA, modifikácie histónov a SP1 konať v zhode s Twist1 expresie v GC buniek.

Je široko známe, že metylácie DNA v oblasti promotora CGI je rozhodujúci pre umlčanie génu, a aberantne výsledky CGI metylácie v strata expresie rôznych zaručené tradičné špeciality [10]. Twist1 bol znovu aktivovaný v oboch myšiach a ľudských GC buniek s 5-aza-dC liečby v tejto štúdii, ukazuje, že transkripčný aktivácia Twist1 je tiež modulovaný metylácie DNA. CGI metylácie Twist1
promotorová oblasť bola nájdená v rôznych druhov rakoviny, ako je žalúdočné, prsníka, hrubého čreva a pľúc tie [11, 12, 14], z ktorých väčšina nevykazovali žiadnu koreláciu medzi Twist1
metylácie a vyjadrenia. Pozorovali sme, že CGI metylácie v Twist1
exón 1, ako v oblasti promotora zodpovedal tejto génovej expresie u myší GC buniek. Čo sa týka ľudských GC bunkových línií, Twist1
expresné-negatívne bunkové línie boli plne metylovaný, ale jeho expresie-pozitívne bunkové línie vykazovali ako metylácii a unmethylation o Twist1
, z ktorých všetky up-regulované Twist1
expresie po pôsobení 5-aza-dC (obr 1F). Tieto dáta ukazujú, že MKN45 a MKN7 bunky vykazovali čiastočne metylácii Twist1 stroje a úrovne polovica Twist1
expresie boli basally zistené v týchto bunkách, ktoré boli vyjadrené nemethylovaných alely DNA. Nedávne správy ukázali, že CPG metylácie shore sa týka génovej expresie [7, 33]. Avšak, stav metylácie v CPG predpokladanej shore lokality regiónu nebola korelované s Twist1
výrazu. Naše dáta ukazujú, že Twist1
je epigenetické umlčaný metylácie DNA v myšiach a ľudský GC bunkových línií.

Podľa počítačovej analýze myší a ľudské CGI z predkladateľom celej kódujúci oblasti v Twist1
gén, dva predpokladané CGI oblasti boli umiestnené na promótor a exón 1, a to MethPrimer analýzou. Tu sme pozorovali, že CGI metylácie v exóne 1, skôr než jeho promotorové oblasti, korelovala s Twist1
expresiu v GC buniek. Takéto odlišné metylácie vzory spojené s umlčanie génov boli hlásené v niekoľkých génov [26, 34, 35]. Napríklad SOX2 stroje a AP2α
vykazovali predpokladané dva CGI na promótor a exóne 1, a metylácie v oblasti exónu 1 sa ukázala byť významne koreluje s jeho génovú expresiu v GC a prsníka rakoviny [34, 35]. Bolo oznámené, že CGI metylácie okolo translačného štartového miesta na receptor kyseliny retinovej beta (RAR-SS) génu výrazne zodpovedal jeho expresie v myších pľúc v porovnaní s metyláciou v promotorové oblasti nachádzajúcej sa v tej istej CGI [26]. Tak, naše údaje naznačujú, že CGI metylácie v regióne exónu 1 v Twist1
je k jeho umlčanie génu v GC buniek dôležitá. Avšak, to je neznámy mechanizmus tohto protichodným metylácie medzi promótorom a exón 1 regiónmi. Niekoľko väzbové miesta transkripčný faktor, ako SP1 prvkov a modifikácie histónov boli hlásené k ochrane CGI metylácie [36, 37]. Je dôležité skúmať tieto prvky a epigenetické stroja v CGI regiónoch Twist1
ďalej.

V primárnom GC od DCKO myší, 50% GC vystavených Twist1
metylácie o vnorené MSP. Naše myšou DCKO ukazujú parietálnych buniek súvisiace s atypickou ložiská v žalúdku a intramucosal DGCs zložené zo zle diferencovaných buniek a pečatný prsteň buniek často zistených na 6 mesiacov. Preto sme už skôr navrhol, že naše DGCs v DCKO myšou vyvíjala cez parietálnej bunky línie [19]. Twist1
sa methyluje v 40% intramucosal rakoviny, zatiaľ čo frekvencia metylácie v non-rakovinové žalúdočnej sliznice, vrátane atypických ohniská bola vzácna (10%), čo naznačuje, že Twist1
metylácie je skorý udalosť v GŘC karcinogenéze v našom modeli myši. Medzi 18 primárnych GC skúmaných päť prípadov boli obaja Twist1
methylation- a vyjadrenia negatívne.

• Ploche ONE: Statíny zmierniť Helicobacter pylori ČAGA Premiestnenie a znížiť výskyt rakoviny žalúdka: In vitro a plošné Case-Control Studies
• Ploche ONE: endoskopická resekcia V porovnaní s gastrektómii liečiť včasnou rakovinou žalúdka: výzva na systematickom preskúmaní a Meta-Analysis