PLOS ONE: DNA-metylering i Exon 1 regionen och Complex förordning av TWIST1 Expression i Gastric Cancer Cells

Abstrakt

TWIST1 uttryck observeras ofta i olika typer av cancer, inklusive magcancer (GC). Även DNA-metylering av TWIST1
genen har rapporterats i cancerceller, mekanismerna bakom transkriptionsaktivering förblir osäkra. I denna studie undersökte vi epigenetiska förändringar av TWIST1
med TWIST1
transkriptions positiv och -negativ cellinjer som härrör från vår etablerade diffusa-typ GC musmodell. Behandling med ett DNA-demetylering medel 5-aza-dC re-aktiveras TWIST1 expression i TWIST1 expressions-negativa GC-celler. Enligt metylering-specifik PCR och bisulfit sekvenseringsanalys, metylering vid CpG-rika region inom TWIST1
kodning exon 1, snarare än dess promotorregion, var tätt kopplad till transkriptionstystande av TWIST1
expression i mus-GC-celler. Kromatin immunoprecipitation analyser visade att aktiv histon varumärket H3K4me3 anrikades i TWIST1 uttrycks-positiva celler, och inaktiva histon märke H3K9me3 anrikades i TWIST1 uttrycks-negativa celler. De uttrycksnivåer av Suv39h1 Köpa och Suv39h2
, histonmetyltransferas för H3K9me3 var omvänt korrelerade med TWIST1
uttryck, och knockdown av Suv39h1
eller Suv39h2
inducerad TWIST1
uttryck. Dessutom Sp1 transkriptionsfaktör bunden till exon 1 CpG-rik region i TWIST1 expressionspositiva cellinjer, och TWIST1
expression minskade med mitramycin, vilket som stör Sp1 bindning till CpG-rika regulatoriska sekvenser. Våra studier tyder på att TWIST1
transkription i GC-celler kan regleras genom eventuellt samarbete av DNA-metylering, histon modifiering i komplex med Sp1 bindning till CpG-rika regioner inom exon en region.

Citation: Sakamoto A, Akiyama Y, Shimada S, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka S (2015) DNA-metylering i Exon 1 regionen och Complex förordning av TWIST1 Expression i Gastric cancerceller. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10.1371 /journal.pone.0145630

Redaktör: Tae-Young Roh, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), Republiken Korea

Mottagna: 21 september 2015, Accepteras: 6 december 2015, Publicerad: 22 december 2015

Copyright: © 2015 Sakamoto et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet: Alla relevanta uppgifter är inom pappers- och dess stödjande information filer

Finansiering:. Detta arbete har finansierats med bidrag-i-stöd för vetenskaplig forskning (C) (24.590.444) och (A) (25.253.081) och A3 syns Program (AA005) från Japan Society för främjande av Science (JSPS), och tillämpad forskning för innovativ cancerkontroll (15Ack0106017h0002) från Japan byrån för medicinsk forskning och utveckling, AMED; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.

konkurrerande intressen: författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Förkortningar:. BS, bisulfit sekvense; CGI, CpG-ö; Chip, kromatin immunoprecipitation; DCKO, dubbel villkorlig knockout-mus; DGC, diffus typ magcancer; GAPDH, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenas; GC, magsäckscancer; H3K4me3, histon H3 lysin fyra tri-metylering; H3K9me3, histon H3 lysin 9 tri-metylering; H3K27me3, histon H3 lysin 27 tri-metylering; MSP, metylering specifika polymeraskedjereaktion; RT-PCR, omvänd transkription-polymeraskedjereaktion; QRT-PCR, kvantitativ RT-PCR; GTS, tumörsuppressorgener; TSS, avskrift startställe; 5-aza-dC, 5-aza-2'-deoxycitidine

Inledning

TWIST1, i egenskap av en grundläggande helix-loop-helix transkriptionsfaktor, binder direkt till E-box-element (NCANNTGN ) på specifika målgener [1]. TWIST1 är allmänt känt att vara avgörande för mesoderm bildning under tidig embryonal utveckling av Drosophila och mus [2, 3]. I human cancer, är ektopisk TWIST1 expression rapporterats vara associerade med malign progression, invasion, epitelial-till-mechencymal övergång, metastas och stemness, vilket indikerar potentiella onkogena funktionerna hos TWIST1 [4-6]. Således är det mycket viktigt att klargöra transkriptionsregleringsmekanismer för TWIST1 i cancerceller.

Epigenetiska förändringar, såsom DNA-metylering och histon modifiering, är tätt kopplade till geners uttryck [7-9]. Även epigenetiska förändringar på CGI (CpG-ö) promotorregionen av tumörsuppressorgener (GTS) är väl kända för att vara associerade med deras geninaktivering [10], är mekanismerna för epigenetisk reglering av onkogener dåligt kända. Flera grupper har visat att TWIST1
återaktiveras genom behandling med en de-metylering läkemedel, 5-aza-2'-deoxycitidine (5-aza-dC) i cancerceller [11, 12]. Avvikande DNA-metylering vid CGI-promotorn i humant TWIST1
har ofta upptäcks i primära cancrar inkluderande av magcancer (GC) [11-14]. Det finns dock en hel del fynd att DNA-metylering vid är TWIST1
promotorregion inte korrelerade med uttryck av genen i olika typer av cancer [12, 14]. Medan kan TWIST1
metylering vara en användbar biomarkör för att förutsäga de kliniska resultaten som att återfall och överlevnad hos patienter med cancer [12, 13, 15], är det fortfarande kontroversiellt huruvida TWIST1
metylering vid promotorregionen leder till tystande av genen.

Transkriptionsreglering reglering~~POS=HEADCOMP av gener är korrelerat med lysin (K) metyleringsmönster i histon svans som består av tre olika lysin metylering tillstånd (mono-, di- och tri-). Tri-metylering av H3K4 (H3K4me3) är relaterad till genaktivering, och av H3K9me3 och H3K27me3 till gen repression [7-9]. Även om dessa tre histon H3-methyaltion mönster är kopplade till CGI metylering också, transkriptionsregleringsmekanismer för TWIST1
underliggande histon modifiering är dåligt kända i cancerceller.

GC är den näst vanligaste dödsorsaken i cancer i världen [16]. GC klassificeras i två huvud histologiska typer; diffus och tarm, vilket är två skilda cancerframkallande vägar [17]. magcancer Diffus-typ (DGC) är känt för att visa frekvent invasion och metastas, vilket resulterar i en dålig prognos [18]. Förlust av E-cadherin och p53 har rapporterats i diffus-typ gastric cancer [19-21]. Flera rapporter visade ofta överuttryck av TWIST1 i mänskliga DGCs [22, 23].

Vi har tidigare konstruerat en dubbel villkorad knockout (DCKO) mus linje som E-cadherin och p53, som specifikt inaktiveras i magen [ ,,,0],19]. Alla DCKO möss utvecklade dödliga DGCs inom ett år, fenotyperna är hög invasiv och ofta metastaser till lymfkörtlarna. Det är anmärkningsvärt att de genexpressionsmönster av DGCs i DCKO möss upptäckts på microarray analys var mycket liknar mänskliga andra än tarm de primära DGCs. Således är vår DCKO musmodell ett kraftfullt verktyg för att undersöka betydelsen av geners funktion i DGC cancer och för att utveckla en terapeutisk strategi. I denna studie har vi etablerat TWIST1 uttryck-positiva och -negativa DGC cellinjer som härrör från de DCKO möss. Som en följd av analys av de epigenetiska förändringar, var den gemensamma regleringsmekanism av TWIST1
klarlagts och utvärderats både murina och humana DGCs i denna studie.

Material och metoder

Etik Statement

Alla in vivo
förfaranden godkändes av Animal Care kommittén för Tokyo Medical and Dental University (Tillstånd nr 0160073A). När det gäller normala humana gastriska slemhinnor prover, var skriftligt informerat samtycke erhölls från alla individer, och studien godkändes av den etiska kommittén i Tokyo Medical and Dental University (No.1115).

cellkulturer och vävnadsprover

Vi har tidigare etablerat en E-cadherin /p53 DCKO ( Atp4b-Cre
^{+
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
) musmodell [19]. Från dess cancervävnader, har vi etablerat fem mus DGC cellinjer och namngav dem MDGCs (Shimada S, opublicerad observation). MDGC-1 och MDGC-3-celler odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) innehållande hög glukoshalt kompletterat med 10% fetalt bovint serum, och MDGC-7, MDGC-8 och MDGC-9 odlades i Hams F12 kompletterat med 5% hästserum. DNA-analys utfördes för att detektera den trunkerade Cdh1
och Trp53
alleler (S1 FIG). Åtta humana GC cellinjer (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 och HSC60) användes också i denna studie. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY och KATO-III köptes från RIKEN cellbank (Tsukuba, Japan). NUGC4 och AGS-celler erhölls från Human Science Research Resources Bank (Osaka, Japan) och ATCC (American Type Cell Collection). HSC60 celler erhölls från Dr. Kazuyoshi Yanagihara (National Cancer Research Center, Tokyo, Japan) [24]. KATO-III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS och HSC60-celler odlades i RPMI 1640, och GCIY odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium, som båda var kompletterat med 10% fetalt bovint serum. För de-metylering studier, murina och humana GC-celler behandlades dagligen med 500 nM 5-aza-deoxicytidin (5-aza-dC, Sigma; # A3656) under 72 timmar. Vi behandlade dessa GC celler med 100 nM trichostatin A (TSA, Wako,Ètill 11.993) under 24 timmar eller 100 nM mitramycin A (Wako,„till 17.101) under 24 timmar}

Arton primära GC vävnader och motsvarande. godartade magsår slemhinnor erhölls från 15 DCKO möss. När det gäller mänskliga magen vävnader, använde vi tre godartade gastric slemhinnor från GC patienter. Vi fick också fem normal gastric slemhinnor från Atp4b-Cre
^{-
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
möss som användes som negativa kontroller i vår tidigare studie [19]. I denna studie, kallade vi "normal gastric slemhinnor" om prover erhölls från kontrollmöss, och "icke-cancer gastric slemhinnor" om prover erhölls från DCKO möss och GC patienter mänskliga i denna studie.}

Omvänd transkription (RT) -PCR och kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) Review

Totalt RNA isolerades med ett RNeasy Mini kit (Qiagen,˥34) och cDNA framställdes från RNA med användning av en Superscript III kit (Invitrogen;´80044) enligt tillverkarens protokoll. Slutpunkt RT-PCR genomfördes med flera cykelnummer, 28-35 cykler. Som en intern kontroll, glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas ( GAPDH
) förstärktes med 21 cykler för att säkerställa cDNA kvalitet och kvantitet för varje RT-PCR. De förstärkta produkterna lastades till 2% agarosgeler eller kvantifieras genom kvantitativ RT-PCR med användning av LightCycler DNA master SYBR Green I (Roche Diagnostics,/07516001). Förstärknings program för PCR upprepades under 40 cykler för GAPDH och 45cycles för andra gener med undantag för GAPDH. PCR-produkter klonades in i pMD20 T-vektorn genom användning av en Mighty TA-kloningssats (Takara BIO INC;ɚ8), och därefter sekvenser direkt. Primersekvenserna och PCR-produktstorlekarna visas i S1 tabell.

Metylering analys

Vi extraherade iskt DNA från mus och människa GC cellinjer av fenol-kloroform-metoden, och sedan genomförs bisulfit modifiering och MSP förfarande. Bisulfit behandling av DNA utfördes med EZ DNA-metylering-guld (Zymo FORSKNING, # D5006), och sedan metylering-specifik PCR (MSP) genomfördes. I korthet sattes PCR-reaktionen utfördes under 35 cykler i en 25 | il blandning innefattande bisulfit-modifierad DNA, 2.5μl av 10x PCR-buffert, 1,25 pl av 25 mM dNTP, 25 pmol /l av varje primer och 1 U av Jump RedTaq polymeras (Sigma; # D0563). Betingelserna för PCR var följande: 95 ° C under 5 minuter; 35 cykler av 95 ° C för 1minutes, 53 ° C under 2 minuter, och 72 ° C för 1.5minutes; och en slutlig förlängning vid 72 ° C under 5 minuter. Som för mus GC vävnader extraherades DNA från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnader. Bisulfit DNA förstärktes med flankerande PCR-primers och sedan kapslade MSP genomfördes [25, 26]. Primersekvenserna och PCR-produktstorlekarna visas i S2 Tabell

Kromatin immunoprecipitation (chip) analys

Chipet utfördes med hjälp av ett chip-IT Express kit (Active Motif,5.008). enligt tillverkarens protokoll. Immunoprecipiterade DNA anrikning normaliserades som till ingången. De antikroppar som används i denna studie var anti-histon H3K4me3 (Active Motif,Ə15), anti-H3K9me3 (Active Motif,'.765), anti-H3K27me3 (Active Motif,Ƈ55), anti-H3K36me2 (Abcam, # ab9049) , anti-Sp1 (Abcam, # ab13370), och anti-Histon H3 (Active Motif,'.163) antikroppar. Normalt kanin-IgG (Cell Signaling Technology,Đ9s) användes som en negativ kontroll för chip. Primersekvenserna och PCR-produktstorlekarna visas i S2 tabell.

Knockdown analys med hjälp av små störande RNA

siRNA-baserade knockdown av Suv39h1 Köpa och Suv39h2
utfördes med användning av en elektroporering (neon transfektionssystem, Invitrogen) i enlighet med tillverkarens instruktioner. MDGC celler transfekterades med 50 nM siRNA enligt Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226) eller negativ kontroll siRNA (Mission siRNA Universal negativ kontroll, Sigma). Efter 48 timmar odling, skördades celler för RT-PCR, Western blot-analyser, migration, invasion och proliferationsanalys.

Western blot-analys

GC-celler lyserades med Pierce RIPA-buffert (Thermo vetenskaplig;΃00). Proteiner separerades på SDS-polyakrylamidgeler och överfördes sedan till polyvinylidenfluorid (PVDF) membran, följt av inkubering med antikroppar lösta i Tris-buffrad saltlösning (TBS) innehållande 2% skummjölk och 10% Tween 20. De primära antikropparna som användes i detta studien var mus monoklonal anti-TWIST1 (1: 100, Santa Cruz Bio-technology, # sc-81417), kanin polyklonal anti-Lp1 (1: 200, Active Motif,Ɔ58), och mus-monoklonal anti-α-tubulin ( 1: 200, Santa Cruz, # sc-8035) antikroppar. De sekundära antikropparna var alkalisk fosfataskonjugerad anti-kanin-IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories,
.706.518) och anti-mus-IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories,
.706.520). Blottar framkallades med ImmunoStar AP Substrat (Bio-Rad Laboratories,ª5018) katalog

Immunohistokemi

FFPE sektioner (4 pm) avparaffinerades i xylen, rehydratiserades i graderade etanollösningar och sedan antigenåtervinning. genomfördes i 10 mM citronsyrabuffert genom mikrovågsugnen. Immunohistokemi utfördes med användning av anti-TWIST1 antikroppar (Santa Cruz, 1:20) såsom beskrivits tidigare [19]. Uttryck av TWIST1 definierades som positiv nukleär färgning i mer än 10% av cellerna, och intensiteten poängsattes som- (negativ), + (svagt) och ++ (måttlig till stark) av tre undersökare oberoende av varandra.

Resultat

TWIST1 uttryck i murina och GC cellinjer mänskliga

från DGC vävnader DCKO möss, TWIST1
transkriptions positiva cellinjer (MDGC-7, MDGC- 8 och MDGC-9) och negativa cellinjer (MDGC-1 och MDGC-3) fastställdes (Fig 1A och S2A fig), och uttrycket av TWIST1 protein bekräftades i varje cellinje (Fig 1B). TWIST1 expression förstärktes vid mRNA och proteinnivåer i TWIST1 expressionsnegativa MDGC celler efter behandling med DNA-demetylering medlet 5-aza-dC (Fig 1C och 1D), medan dess expression inte förändrades efter behandling med histondeacetylasinhibitor TSA (S2B Fikon). I undersökte åtta humana GC cellinjer, TWIST1
uttryck nedregleras i fyra cellinjer (Fig 1E, vänster), tre (KATO-III, GCIY och AGS) som visade återaktivering av TWIST1
uttryck efter behandling med 5-aza-dC genom RT-PCR (exempel visar fig 1E, höger). När det gäller TWIST1
uttryck positiva GC cellinjer, efter 5-aza-dC behandling, 2,1- och 3,2-faldig uppreglering av TWIST1
upptäcktes i MKN45 och MKN7 respektive av QRT-PCR, medan TWIST1 uttryck inte ändrades i MDGC-9-celler (Fig 1F).

CGI metylering och uttryck av TWIST1
i GC cellinjer

TWIST1
har en tät CGI region från promotorn till hela exon 1, varvid denna region starkt konserverade bland ryggradsdjur inklusive mus och människa (S3 Fig). För att tydliggöra CGI i mus och människa TWIST1
utförde vi beräknings analys med hjälp av UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/index.html) och MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /) som ofta används som identifiering av CGI och MSP primers [27]. Vi analyserade cirka 1,4 kb regionen, inklusive promotorn och hela exon 1. UCSC Genome Browser på mus och människa analys uppvisade ett CGI i regionen undersökte (data visas ej). Emellertid var förmodade två CGI platser detekteras i regionen både mus och människa när vi använde kriterierna för CGI med GC-halt av 50% och observerade /förväntade CpG-förhållande av 0,8 genom MethPrimer (Fig 2A och 2C). Dessa två förmodade CGI regioner var belägna vid promotom och exon 1. Eftersom metylering vid promotorregionen har rapporterats i olika humana cancerformer [12, 14], först undersökte vi metyleringsstatus vid området i murina och GC cellinjer humana av MSP. Men metylering status vid promotorregionen av TWIST1
inte överensstämde med dess uttryck i någon GC cellinjer undersöktes (region P1, Fig 2A). För att bestämma kritiskt metylerade regioner som förknippas med TWIST1 uttryck i MDGC celler, ytterligare genomförde vi MSP på CGI-regionen i exon 1 (E1-1, E1-2 och E1-3), och den förutspådda CpG shore plats ligger cirka 1,6 kb från TSS (avskrift startstället, S1) (Fig 2A). Som ett resultat, CGI metylering vid området (E1-1 och E1-2) runt TSS i TWIST1
exon 1 visade sig motsvara till expression av genen i MDGC celler, men det fanns ingen korrelation mellan dem vid den förutsagda shore-regionen (S1) och änden av exon 1-regionen (E1-3) (fig 2B, till vänster) i MDGC celler. Ingen metylering upptäcktes vid några CpG regioner tre normal gastric slemhinnor utan TWIST1 uttryck från Atp4b-Cre
^{-
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
möss (Fig 2B). I human gastrisk slemhinnor, ingen TWIST1
metylering konstaterades också i tre godartade gastric slemhinnor från GC patienter (Fig 2D), varav visade mycket svag TWIST1
uttryck (data visas inte ). Vi undersökte också ytterligare fyra godartade gastric slemhinnor från GC patienter, medan ingen metylering upptäcktes vid E1-2-regionen i alla fall (data visas ej). Bisulfit sekvensering (BS) visade att CGI-regionen i exon 1 visade tät metylering i TWIST1 expressionsnegativa MDGC-3-celler men inte i TWIST1-positiva MDGC-9-celler (BS-c, Fig 2A och 2B, till höger), medan det var ingen skillnad i metylering mönster mellan dem på CpG stranden och promotorregioner (BS-a och BS-B, S4A Fig). Bland de humana GC cellinjer, KATO-III och GCIY utan TWIST1
expression visade tät CGI metylering vid regionen av exon 1 (E1-2) vilket överensstämmer med de av mus TWIST1
(fig 2C och 2D, vänster). Både metylering och unmethylation i E1-2-regionen detekterades i MKN7 och MKN45-celler genom MSP och bisulfit sekvensering (fig 2D), som basalt uttrycks TWIST1 men deras expressionsnivåer ökade efter 5-aza-dC-behandling (figur 1F). Således, våra data tyder på att metylering i exon 1-regionen av TWIST1
upptäckt i denna studie är korrelerad till sitt uttryck.}

TWIST1
metylering och uttryck i DCKO mus GC vävnadsprover

Vi undersökte metylering status TWIST1
använder 18 primära GC vävnader från 15 DCKO möss. Eftersom GC regionerna var mycket små och deras DNA från FFPE prover uppvisade låga koncentrationer, utförde vi kapslade MSP [25, 26]. TWIST1
signifikant denaturerad (9/18, 50%) i primära GC jämfört med motsvarande icke-cancervävnader (1/10, 10%), är statistiskt signifikant skillnad (P < 0,05, Tabell 1). Representativa data från MSP är visade i fig 3A. Bland dem var fyra av tio (40%) fall intramucosal och fem av åtta (62,5%) var invasiva GC (tabell 1). I denna studie, TWIST1
metylering-positiva fall visade ometylerade MSP band också, som på grund av närvaron av normala stromaceller /fibroblaster och inflammatoriska celler i cancer vävnadssnitt, även om vi inte kunde förneka möjligheten till partiell metylering som MKN45 och MKN7 och tumör heterogenitet.

TWIST1 protein uttryck detekterades i 7 av 18 (38,9%) GC jämfört med motsvarande icke-cancer gastric slemhinnor genom immunhistokemi. Representativa bilder visas i figur 3B. Vi analyserade vidare förhållandet mellan TWIST1
uttryck och metylering nivåerna i dessa fall. Bland de 18 främsta GC undersöktes visade nio fall korrelationen mellan TWIST1
metylering och uttryck (Fig 3C). Tre av fyra fall med TWIST1 svagt uttryck uppvisade dess metylering, möjligen att låg expression av TWIST1 kan orsakas av dess metylering. Dock uppvisade återstående fem fall ingen metylering och uttryck (tabell 1).

Histon metylering är relaterad till regleringen av TWIST1
uttryck

undersökte vi nästa huruvida lysin metylering nivå histon H3 bidrar till TWIST1
uttryck. Kromatin immunoprecipitation (chip) utfördes på den förutspådda CpG shore (CP1.3k), promotor (CP1), och exonerna 1 (CE1-1 och CE1-2) och 2 (CE2) regioner (Fig 2A). Vid CP1 och CE1-2 regioner, var aktiv histon märke H3K4me3 anrikad på TWIST1 expressionspositiva celler (MDGC-7 och MDGC-9), men inaktiv histon märke H3K9me3 anrikades i TWIST1 expressions-negativa celler (MDGC-1 och MDGC -3) (fig 4A och 4B). ChIP-analyser uppvisade både H3K4me3 och H3K9me3 signaler i MDGC-1 och MDGC-3-celler med 5-aza-dC behandling, vilket indikerar de förhöjda H3K4me3 nivåer i dessa celler (fig 4C). Tvärtom har de H3K27me3 och H3K36me2 nivåerna inte korrelerade med TWIST1 uttryck i några MDGC celler undersöktes i denna studie. När det gäller mänskliga GC cellinjer, ett liknande område som ligger från promotorn exon 1 visade H3K4me3 anrikning i TWIST1
uttryck positiva MKN45 celler, och H3K9me3 i TWIST1
uttryck negativa KATO-III celler (fig 2C och 4D).

Suv39h1 Köpa och Suv39h2
, en histonmetyltransferas, reglerar H3K9me3

Det finns en hel del histonmetyltransferas associerade med H3K4, H3K9 och H3K27 [28]. Därför, för att avgöra vilka histon modifiering enzymer är ansvariga för H3K4me3 eller H3K9me3 anrikning på TWIST1
exon en region i GC-celler, undersökte vi tio H3K4me3 ( Mll1
, Mll2
, Mll3
, Mll4
, Setd1a
, Setd1b
, Ash1
, Ash1l
, Smyd3 Mössor och Meisetz
), sju H3K9me3 ( Suv39h1
, Suv39h2
, G9a
, Setdb1
, Clld8
, Gip Mössor och Riz1
), och en H3K27me3 ( Ezh2
) relaterade gener. Representativa data visas i Fig 5A. Bland dem, de uttrycksnivåer av Suv39h1 Köpa och Suv39h2
var omvänt korrelerade med TWIST1
uttryck. Emellertid var de expressionsnivåer av resterande 16 histon methylatasferase undersökta gener inte förknippas med TWIST1
uttryck i MDGC celler. Vi utförde siRNA-baserade knockdown av Suv39h1
eller Suv39h2
i respektive uttryck-positiva MDGC-1 och MDGC-3-celler genom elektroporering (Fig 5B). Knockdown av Suv39h1
eller Suv39h2
i dessa cellinjer har lett till en ökning av TWIST1
uttryck observeras på RT-PCR (Fig 5B) och QRT-PCR (MDGC- 1, Fig 5C) katalog

Association of Sp1 med transkriptionsreglering av TWIST1

konsensus 5 '-. (G /T) GGGCGG (G /A) ( G /A) (C /T) -3 'sekvens är känd som den bindande motivet av Sp1 transkriptionsfaktor, och en relation mellan CGI-metylering och Sp1 bindning i promotorn har rapporterats [29, 30]. Flera Sp1 bindningsställen förutsågs i CpG-rika region inom TWIST1
exon 1 med TFBIND (http://tfbind.hgc.jp) och Jaspar (http://jaspar.binf.ku.dk) . Rollen för Sp1 i transkription av TWIST1
undersöktes sedan med hänvisning till epigenetisk modifiering av genen. Vi upptäckt uttryck av Sp1 mRNA och protein i alla murina och mänskliga GC-celler undersökta, även i TWIST1 uttryck negativa MDGC-1, MDGC-3, KATOIII och GCIY celler (Fig 6A).

För att bestämma huruvida inte Sp1 binder till regioner i TWIST1
promotor och exon 1 i GC-celler, genomförde vi ChIP analys av Sp1 använder MDGC celler (Fig 2A). Sp1 bunden till regionerna TWIST1
promotorn (CP1) och exon 1 (CE1-2) i TWIST1 expressionspositiva cellinjer (MDGC-7 och MDGC-9) (fig 6B). Däremot TWIST1 uttryck negativa cellinjer (MDGC-1 och MDGC-3) visade odetekterbara nivåer av Sp1 bindande signaler vid CP1 och CE1-2 regioner. Sp1 band inte till några regioner i den förutsagda CpG 2 (CE2) regionerna i dessa TWIST1 uttryck-positiva och -negativa MDGC celler shore (CP1.3k) och exon. Demetylering med 5-aza-dC ökade Sp1 bindning på TWIST1
promotor och exon 1-regionerna i TWIST1 uttrycks-negativa MDGC-1 och MDGC-3-celler (Fig 6B). Mitramycin A är känd för att störa Sp1 bindning till CpG-rika regulatoriska sekvenser [31, 32]. Det konstaterades att TWIST1
uttryck nedregleras efter behandling med mitramycin A i sitt uttryck-positiva GC-celler (MDGC-7, MDGC-9, MKN7 och MKN45 celler) (Fig 6C och S6 FIG). Mitramycin A visade inte någon effekt på Sp1 uttryck i dessa celler (data visas ej). Uppreglering av TWIST1 Musik av 5-aza-dC minskades med mitramycin En behandling i MDGC-3-celler (P = 0,04, Fig 6D).

Diskussion

mekanismerna bakom epigenetisk reglering av onkogen är dåligt kända. Förhållandet mellan metylering status på TWIST1
promotorregioner och uttryck av TWIST1
är kontroversiell, och det finns nästan ingen av rapporter om förändrad histon ändring i TWIST1
uttryck. Således är det fortfarande osäkert om eller inte epigenetiska förändringar och TWIST1
aktivering i cancerceller. Som nya rön i denna studie, klar vi TWIST1
reglerande mekanismen bakom grundläggande epigenetisk maskiner som DNA-metylering, histon modifiering och Sp1 agerar i samförstånd med TWIST1 uttryck i GC-celler.

Det är allmänt känt att DNA-metylering vid CGI promotorregionen är kritiskt för geners uttryck, och avvikande CGI metylering resulterar i förlust av uttryck av olika GTS [10]. TWIST1 ades återaktiveras i både murina och humana GC-celler med 5-aza-dC behandlingen i denna studie, vilket tyder på att transkriptionell aktivering av TWIST1 också moduleras av DNA-metylering. CGI metylering av TWIST1
promotorregionen har hittats i olika cancerformer, såsom mag-, bröst-, kolorektal och lung sådana [11, 12, 14], varav de flesta inte visade någon korrelation mellan TWIST1
metylering och uttryck. Vi konstaterade att CGI metylering i TWIST1
exon en annan än i promotorregionen motsvarade dess genuttryck i mus GC-celler. Som för humana GC cellinjer, TWIST1
expressions-negativa cellinjer var fullt metylerade, men dess uttryck-positiva cellinjer uppvisade både metylering och unmethylation av TWIST1
, vilka alla uppreglerad TWIST1
uttryck efter 5-aza-dC behandling (Fig 1F). Dessa data indikerar att MKN45 och MKN7 celler visade delvis metylering av TWIST1
, och en halv nivåer av TWIST1
expression basalt detekteras i dessa celler, som uttrycktes från ometylerade DNA-allelen. Nya rapporter indikerade att CpG shore metylering är relaterad till genuttryck [7, 33]. Emellertid metylering status på förutspådda CpG shore plats region inte korrelerade med TWIST1
uttryck. Våra data indikerar att TWIST1
är epigenetiskt tystas genom DNA-metylering i murina och mänskliga GC cellinjer.

Enligt beräknings analys av mus och human CGI från promotorn till hela den kodande regionen i TWIST1
gen, två förmodade CGI regioner ligger vid promotorn och exon 1 av MethPrimer analys. Här har vi konstaterat att CGI metylering vid exon 1, snarare än dess promotorregion, korrelerade med TWIST1
uttryck i GC-celler. Sådana distinkta metylering mönster i samband med geners uttryck har rapporterats i flera gener [26, 34, 35]. Till exempel, Sox2 Mössor och AP2α
uppvisade förmodade två CGI på promotorn och exon 1, och metylering vid exon en region har visat sig vara signifikant korrelerade till dess genuttryck i GC och bröst cancer [34, 35]. Det rapporterades att CGI metylering runt translationsstartstället i retinoinsyra receptorn beta (RAR-ß) genen motsvarade dramatiskt till dess uttryck i murina lungcancer jämfört med metylering vid promotorregionen som ligger i samma CGI [26]. Således, våra data tyder på att CGI metylering vid exon 1-regionen i TWIST1
är viktigt att dess geners i GC-celler. Det är emellertid okänt mekanismen för denna avvikande metylering mellan promotorn och exonet 1-regionerna. Flera transkriptionsfaktorbindningsställen, såsom Sp1 element, och histon modifiering har rapporterats att skydda CGI metylering [36, 37]. Det är viktigt att undersöka dessa faktorer och epigenetiska maskiner i CGI regionerna TWIST1
ytterligare.

I primär GC från DCKO möss, uppvisade 50% av GC TWIST1
metylering av kapslade MSP. Våra DCKO möss visar parietalcellens relaterade atypisk foci i magen, och intramucosal DGCs sammansatta av dåligt differentierade celler och klackring celler ofta detekterats vid 6 månader. Därför har vi tidigare föreslagit att våra DGCs i DCKO möss utvecklas genom parietalcellen härstamning [19]. TWIST1
metylerades i 40% av intramucosal cancer, medan frekvensen av metylering i icke-cancerös gastric slemhinnor inklusive atypisk foci var sällsynta (10%), vilket indikerar att TWIST1
metylering är en tidig händelse i DGC cancer i vår musmodell. Bland de 18 främsta GC undersökta var fem fall båda TWIST1
methylation- och uttryck-negativa.

• PLOS ONE: Statiner dämpa Helicobacter pylori CagA translokation och minska Förekomst av Gastric Cancer: In vitro och populationsbaserade fall-kontrollstudier
• PLOS ONE: Endoskopisk resektion Jämfört med Gastrectomy att behandla tidig ventrikelcancer: en systematisk genomgång och meta-analys