PLoS ONE: Die MicroRNA-217 Funktionen als Potenzial Tumor Suppressor in Magenkrebs durch GPC5 Targeting

Abstrakt

Magenkrebs (GC) ist eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen weltweit. Beweise Schwellen hat, dass die anomale Expression von microRNAs gezeigt (miRNAs) spielt eine wichtige Rolle bei der Tumorprogression. Es ist jedoch wenig über die mögliche Rolle der miR-217 in GC bekannt. In dieser Studie untersuchten wir die Rolle von miR-217 auf GC Zellproliferation und Invasion. Die Expression von miR-217 wurde herunterreguliert in GC-Zellen und menschlichen GC Gewebe. Erzwungene Expression von miR-217 gehemmt GC-Zellen-Proliferation und Invasion. Außerdem Glypican-5 (GPC5), eine neue ocncogene, wurde als potentielles Ziel von miR-217 identifiziert. Darüber hinaus Überexpression von miR-217 beeinträchtigt GPC5 induzierte Förderung der Proliferation und Invasion in der GC-Zellen. Abschließend zeigten diese Ergebnisse, dass miR-217 als Tumorsuppressor funktioniert und hemmte die Proliferation und Invasion von GC-Zellen durch GPC5 Targeting, die somit als therapeutisches Ziel für die GC-Patienten dienen könnten

Citation:. Wang H Dong X, Gu X, Qin R, Jia H, Gao J (2015) Die MicroRNA-217 Funktionen als Potenzial Tumor Suppressor in Magenkrebs durch GPC5 Targeting. PLoS ONE 10 (6): e0125474. doi: 10.1371 /journal.pone.0125474

Editor: Juni Li, Sun Yat-sen University Medical School, CHINA

Empfangen: 10. Oktober 2014; Akzeptiert: 24. März 2015; Veröffentlicht: 22. Juni 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

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Finanzierung:.. die Autoren keine Unterstützung oder Finanzierung zu berichten

konkurrierende Interessen:. die Autoren, dass keine Interessenkonflikte bestehen erklärt haben

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die vierthäufigste menschlichen Tumoren und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle weltweit, mit geschätzten eine Million neue Fälle pro Jahr [1-4]. Trotz der jüngsten Fortschritte bei diagnostischen Verfahren, OP-Technik und neue Chemotherapien, die langfristige Überlebensrate für GC ist immer noch recht niedrig [5, 6]. Bei vielen Patienten ist GC im fortgeschrittenen Stadium mit umfangreichen Invasion und lymphatischen Metastasierung diagnostiziert. Erfolgreiche therapeutische Strategien sind begrenzt, und die Sterblichkeit ist hoch [7]. Daher ist es dringend die grundlegenden molekularen Mechanismen, die unter der Arzneimittelresistenz, histologische Heterogenität und die Entwicklung von Metastasen zu untersuchen neuartige Marker für die Diagnose und Behandlung von GC zu identifizieren.

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine, etwa 22 -nucleotide, nicht-kodierenden RNAs, die als negative Regulatoren der Protein-kodierenden Gene auf posttranskritionelle Ebene funktionieren [8, 9]. Durch die Bindung an den komplementären Sequenzen in den 3'-untranslatierten Regionen (3'-UTR) der Ziel-mRNAs können miRNAs direkte mRNA Degradation oder translationale Hemmung induzieren [10-13]. Zunehmende Beweise darauf hin, dass miRNAs in vielen wichtigen biologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich Zellproliferation, Differenzierung, Apoptose, Angiogenese und Immunantwort. Deregulation von miRNAs kann anomale Genexpression bei verschiedenen Krankheiten einschließlich Magenkrebs führen [14-16]. Allerdings ist das Verständnis der Rolle und Funktion der miRNAs in der GC noch in der Anfangsphase. Ebenso sind die Rollen vieler anderer aberrantly ausgedrückt miRNAs in GC Entwicklung noch unbekannt.

Das Herunterregulieren von miR-217 ist ein häufiges Ereignis in verschiedenen Krebsarten, ihre wichtige Rolle bei der Tumorentstehung was darauf hindeutet, [17-19]. Es ist jedoch wenig über die mögliche Rolle der miR-217 in GC bekannt. In dieser Studie wurde die Expression von miR-217 in GC-Zelllinien und Geweben verringert. Darüber hinaus geringere Expression von miR-217was mit pTNM Bühne verbunden. Die Überexpression von miR-217 unterdrückt GC Zellinvasion und Proliferation. Darüber hinaus bestätigte Luciferase-Reporter-Assay und Western-Blot, dass miR-217might Funktion als Tumorsuppressor in GC von targetingGlypican-5 (GPC5).

Materialien und Methoden

Ethik Statement

vereinbart Alle Patienten in der Studie teilzunehmen und gab eine schriftliche Einverständniserklärung. Diese Studie und Zustimmung wurde von der Ethikausschuss des Instituts der angeschlossenen YanAn Krankenhaus von Kunming Medical University und eingehalten Deklaration von Helsinki genehmigt.

Gewebeproben

Proben von menschlichem Gewebe GC und gepaart -adjacent nicht-Tumor-Magen-Gewebe, die weiter als 5 cm von den Tumoren waren, wurden von 50 Patienten, die Chirurgie Resektion im The Affiliated YanAn Krankenhaus von Kunming Medizinischen Universität unterzog. Frische Proben wurden schockgefroren inliquid Stickstoff unmittelbar nach der Resektion und bei -80 ° C gelagert. Alle Proben wurden mit Patienteneinwilligungserklärung erhalten und wurden durch Färben mit Hämatoxylin-Eosin histologischen bestätigt. Die histologischen Grad von Krebserkrankungen wurde nach den Kriterien der Weltgesundheitsorganisation bewertet. Keiner der Patienten erhielt eine Strahlentherapie oder eine Chemotherapie vor der Operation. Die Charakteristika der Patienten sind in S1 Tabelle beschrieben.

Die Zelllinien und Zellkultur

menschlichen Magenkrebszelllinien SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 und ein normales Magenepithelzellen Zelllinie GES-1 (als Kontrolle) wurden vom Institut für Biochemie und Zellbiologie an der chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erworben. SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 wurden in RPMI 1640-Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und GES-1 wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (Invitrogen) vermehrt propagiert. Alle Medien wurden with10% fötalem Rinderserum ergänzt war. Zelllinien wurden bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 kultiviert.

RNA Extraktion und qRT-PCR

Gesamt-RNA aus gefrorenen Proben extrahiert wurde (oder die Zellen) unter Verwendung von Trizol ( Invitrogen) im Anschluss an die Führung des Herstellers. 1 ml RNA wurde verwendet, um die Expression von miR-217 durch quantitative RT-PCR (qRT-PCR) mit den TaqMan miRNA reverse Transkription-Kit andtheTaqMan miRNA-Assay-spezifische RT Primer für miR-217 gemäß den Anweisungen des Herstellers zu messen (Applied Biosystems, Foster City, CA). Die Expression von U6 wurde als interne Kontrolle verwendet. Real-time PCR wurde mit 1 ml jeder cDNA auf einem Step One Plus Real-Time PCR-System (Applied Biosystems, Foster City, CA) in Duplikaten durchgeführt. Die Expression von miR-217 wurde auf der Basis des Schwellenzyklus (Ct) definiert, und die relativen Expressionsniveaus wurden AS22 berechnet ^{- [(Ct von miR-217) - (Ct von U6)] nach der Normalisierung mit Bezug auf die Expression von U6 small nuclear RNA [20, 21] (S2 Tabelle).}

Western-Blot

das Gesamtprotein wurde aus gefrorenen Proben (oder die Zellen) extrahiert, um ein Gesamtprotein Extraction Kit (KeyGen, Nanjing China,) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Messung der Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines BCA Protein Assay Kit (KeyGen) durchgeführt. Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben [22]. Die primären Antikörper für Western-Blot verwendet wurden, waren polyklonalen Kaninchen-anti-GPC5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), Maus-monoklonalen anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

Zell Transfektion

Die miR-217 Mimik, Mimik-Steuerung (Scramble), miR-217-Inhibitor, Inhibitor Kontrolle, PEZ-GPC5 und Steuervektor wurden von RiboBio (Guangzhou, China) erworben. Die HGC-27-Zellen wurden in Platten mit sechs Vertiefungen bei 30% Konfluenz einen Tag vor der Transfektion ausgesät. Lipofectamine2000 (Invitrogen) wurde für die Transfektion von Plasmid allein oder zusammen mit RNA-Oligonukleotide verwendet.

Luciferasetests

Zellen von 8 x 10 ^{3 wurden plattiert in 96-Well-Platten. Nach 24-hincubation wird eine Mischung aus 100-ng pLUC-3'-UTR, 5-pmol negative Kontrolle, miR-217mimic mit 20 ng Renilla in Zellen unter Verwendung von Lipofectamine 2000 Vierundzwanzig hoursafter Transfektion firefly und Renilla-Luciferase-Aktivitäten co-transfiziert wurde, waren gemessen mit einem Dual-Luciferase Reporter-System (Promega, Madison, WI, USA). Die Transfektionseffizienz wurde durch Co-Transfektion mit einem Renilla-Reportervektor normalisiert.}

Die Zellproliferation

Die Zellen (3000 /Vertiefung) wurden in 96-Wellplatten gesammelt und ausgesät und bei 37 ° C nach der Transfektion inkubiert. Nach Inkubation für 1 bis 5 Tage, bis das Medium von jeder Vertiefung 10% Zell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan) zugegeben, und die Platten wurden weiter für weitere 3 Stunden bei 37 ° C inkubiert wurden. Dann wurde das Medium mit 150 ml Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich) ersetzt wurde, und die Extinktion wurde bei 450 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegerät (Sunrise) gemessen. Der Test wurde 3 mal wiederholt mit sechs Wiederholungen.

Northern Blot

Die Gesamt-RNA aus jedem Gewebe isoliert wurde mit Trizolreagenz (Invitrogen Life Technologies) und Northern Blot wurde als vorherige beschrieben [23] durchgeführt, . Perfekte folgenden Hyb Plus-Hybridisierung bei 68ºC wurden die Membranen entwickelt und analysiert. Northern-Blots mit einer 18S ribosomalen RNA hybridisiert (rRNA) cDNA wurden als Kontrollen verwendet.

Zellinvasion

Invasion Assays wurden dreifach durchgeführt unter Verwendung von Kammern Transwell-Invasions beschichtet mit Matrigel (BD, USA), wie in dem Herstellerprotokoll beschrieben. Zellen wurden withmiR-217 ahmt transfiziert, Inhibitor oder negativen Kontroll-Oligonukleotids, kultiviert für 48 Stunden, und in einem serumfreien DMEM (1 × 10 ^{5 Zellen pro Transwell) auf der Oberseite der Matrigel-beschichteten invasion Kammern überführt. DMEM, enthaltend 10% fötales Kälberserum in die untere Kammer gegeben. Nach einer Inkubation von 24 h wurden Zellen, die auf der Oberseite des Filters blieben, wurden geschrubbt und Zellen, die an der unteren Oberfläche migrierten IN90% Alkohol fixiert und mit Kristallviolett-Färbung folgte.}

Histologie

die histologische Diagnose war nach dem triple-Website Methode Magen-Biopsie. . Die Gewebe wurden über Nacht in gepuffertem Formalin, in Paraffin eingebettet, geschnitten bis 3 &mgr; m Dicke und gefärbt mit Hämatoxylin-Eosin (H & E) fixiert Färbung

Die statistische Analyse

Statistische Analysen wurden durchgeführt mit Hilfe der SPSS 17.0 Statistik-Software-Paket. Experimente wurden unabhängig mindestens dreimal wiederholt und die Daten als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Assoziation zwischen miR-217 und GPC5 wurde mit Spearman-Korrelationstest analysiert. Vergleiche zwischen den Gruppen für die statistische Signifikanz wurden mit Student gepaart zwei tailed t-Test oder Einweg-ANOVA durchgeführt. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnis

Die Expression von miR-217 ist in GC-Zelllinien nach unten reguliert

Wir zunächst das Expressionsniveau quantifiziert miR-217 in vier Mensch GC-Zelllinien (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) und GES-1 unter Verwendung von Northern Blot (1A). Die Expression von miR-217 wasdecreased in GC-Zelllinien im Vergleich zu GES-1. QuantitativeRT-PCR zeigte auch, dass die Expression von miR-217 in GC-Zelllinien verringert wurde (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) im Vergleich mit GES-1, eine normale Magen-epithelialen Zelllinie (1B ).

miR-217 in GC Gewebe nach unten reguliert wird

Quantitative RT-PCR wurde verwendet, miR-217 Expression in 50 GC Gewebe und deren gepaart benachbarten noncancerous Gewebe zu untersuchen. Die repräsentativen histologischen Merkmale von GC und seine gepaarte benachbarte noncancerous Gewebe wurden in 2A gezeigt ist. Unter 50 Tumorgewebe zeigten 44 Fälle verringerte Expression von miR-217 im Vergleich zu den benachbarten normalen Geweben (88%, 44 von 50, 2B). Die Expression von miR-217 war niedriger bei GC Gewebe als in benachbarten noncancerous Gewebe (2C). Darüber hinaus geringere Mengen von miR-217 Expression mit dem pTNM Stadium der GC Patienten in Verbindung gebracht (Abb 2D).

miR-217 GC hemmt die Zellproliferation und Invasion

Die Expression von miR-217was erhöht in transfizierten HGC-27-Zellen miR-217-Mimetika (3A) mit und miR-217-Inhibitor (3B) verringerte sich verwenden. Die Proliferation wurde in den HGC-27-Zellen, die withmiR-217-Mimetika im Vergleich zu Zellen, die mit Gerangel oder unbehandelt (3C) transfiziert reduziert. Inzwischen wurde die Proliferation in HGC-27-Zellen erhöht withmiR-217inhibitor transfiziert im Vergleich zu mit Kontrolle transfizierten Zellen oder unbehandelt (Bild 3D). Die Invasivität mit miR-217 imitiert transfizierten Zellen wurde mit den Scramble-Gruppe oder Kontrollgruppe Zellen und miR-217-Inhibitor erhöhte Zellinvasion im Vergleich zu den Scramble-Gruppe oder Kontrollgruppe Zellen (Abb 3E) sank im Vergleich.

miR -217 posttranskritionelle reduziert Ausdruck GPC5 durch direkte Eingabe der 3'UTR

die Analyse unter Verwendung von verfügbaren Algorithmen angegeben Targeting, dass GPC5 ein theoretisches Ziel-Gen von miR-217 (4A) war [24]. Um zu beweisen, dass miR-217 direkt auf die GPC53'UTR gezielte, führten wir Luciferase-Reporter-Assays. Ectopic von miR-217 reduziert die Luciferase-Aktivität in der GPC5 Wildtyp-Reporter-Gen, aber nicht das mutierte GPC5 3'UTR, was darauf hinweist, dass miR-217 direkt auf die GPC5 3'UTR (4B) ausgerichtet. Die mRNA-Ebene von GPC5 wurde nach der Transfektion mit miR-217 imitiert verringert und erhöht nach der Transfektion mit miR-217-Inhibitor mit qRT-PCR (4C). In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis ist die Fähigkeit von miR-217, die Expression des Proteins GPC5 zu regulieren wurde durch Western Blotting (4D) verifiziert.

Restaurierung von miR-217 GPC5-vermittelte GC Zell-Proliferation und Invasion hemmt

die Überexpression von GPC5 förderte die GC-Zell-Proliferation und Invasion. Wenn miR-217 Mimik und PEZ-GPC5 in HGC-27-Zellen cotransfiziert wurden, reduzierte miR-217 Expression der GPC5-induzierte GC Zell-Proliferation und Invasion (5A und 5C). Die Hemmung der GPC5 reduziert, um die GC-Zell-Proliferation und Invasion. Wenn miR-217-Hemmer und shGPC5 in HGC-27-Zellen cotransfiziert wurden, gefördert miR-217-Inhibitor die shGPC5 gehemmten Zellproliferation und Invasion (5B und 5D).

GPC5 wird in GC-Zelllinien und Proben upregulated

Die Expression von GPC5 höher war in GC-Zelllinien (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) im Vergleich zu GES-1, eine normale Magen-epithelialen Zelllinie (6A). Die Proteinspiegel von GPC5 waren ebenfalls höher in GC Gewebe als in benachbarten noncancerous Gewebe unter Verwendung von Western-Blot (6B).

Diskussion

GC verursacht fast eine Million Todesfälle weltweit pro Jahr [25] . Vor kurzem hat vermehrt Hinweise vorgeschlagen, dass miRNAs eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der GC durch Regulierung der Zellproliferation spielen, Apoptose, Migration, Anzeigen Invasion [26-28]. In dieser Studie wurde miR-217 in der menschlichen GC-Zelllinien und Gewebe und die untere Ebene von miR-217 häufig herunter reguliert wurde mit pTNM Stadium der GC verbunden. Weitere Experimente zeigten, dass die Überexpression von miR-217 kann GC Zellmigration und Invasion zu unterdrücken. GPC5 wurde als direkte und funktionelle Ziel von miR-217 identifiziert. Wir schließen daraus, dass miR-217 ein neuer Tumor-Suppressor in GC zu sein scheint und dass downregulated miR-217 kann zur Tumorentstehung und Progression in GC-Patienten beitragen. Das Herunterregulieren von miR-217 ist ein häufiges Ereignis in verschiedenen Krebsarten, ihre wichtige Rolle bei der Tumorentstehung was darauf hindeutet, [17-19]. Li und seine Kollegen zeigten, dass miR-217 wurde herunterreguliert in klarzelligen Nierenzellkarzinom (ccRCC) im Vergleich zu normalem Gewebe gepaart [29]. Lower miR-217-Expressionsniveau wurde mit einem höheren Tumorgrad und Stufe zugeordnet. In dieser Studie wurde miR-217 häufig in der GC nach unten reguliert. Faszinierend, Patienten mit niedriger Expression von miR-217 eher fortgeschrittenen TNM-Stadium zu haben, was darauf hindeutet, dass niedrige Expression ofmiR-217was mit GC Progression. Weitere Studien haben gezeigt, dass die Überexpression von miR-217 unterdrückt GC Zellinvasion und Proliferation. Zusammen mit früheren Ergebnissen, legen diese Daten nahe, dass miR-217might eine entscheidende Rolle bei GC Gewebshomöostase und deregulatedmiR-217 spielen könnten, um die Entwicklung eines Magen Neoplasie beitragen.

Um den molekularen Mechanismus des Tumor-Suppressor-Rolle untersuchen von miR-217 in GC verwendeten wir Luciferase-Reporter-Assay und Western-Blot, dass GPC5 ein Ziel von miR-217 zur Bestätigung in GC-Zellen war. Um die direkte Regulierung von GPC5 von miR-217 bestätigen, haben wir GPC 3 'UTR-Reportervektor das Potential miR-217-Bindungsstelle in dem fluoreszierenden Reporter tragen. Darüber hinaus qRT-PCR und Western-Blot-Test zeigte, dass die Überexpression von miR-217 GPC-Expression gehemmt. Glypicans sind eine Familie von Proteoglycanen, die zur exocytoplasmic Oberfläche der Plasmamembran über einen Glykosyl-Phosphatidylinositol-Anker verknüpft sind [30, 31]. Sechs glypicans wurden in Säugetieren (GPC1 zu GPC6) [32, 33] identifiziert. GPC5 ist vor allem bei der Entwicklung des zentralen Nervensystems ausgedrückt, Gliedmaßen, Niere, Lunge und Leber [34, 35]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass einige GPCs, insbesondere GPC3 andGPC5, könnte bei der Regulierung der Krebsprogression eine wichtige Rolle spielen [35, 36]. Zum Beispiel: Zhang
et al. zeigte, dass in SACC-M (hohe Lunge metastasiert Zelllinie) und in klinischen Proben von Speichel adenoidzystische Karzinom (SACC) Fälle hoch mit Lungenmetastasen [36] GPC5 ausgedrückt wurde. Der Gesamtexpressionsniveau von GPC5 in klinischen Fällen von SACC mit Lungenmetastasen war höher. Williamson et al. zeigte, daß die codierende Gen GPC5was in 20% der Patienten mit alveolärer Rhabdomyosarkom (RMS) und dass diese glypican in RMS-Patienten überexprimiert wurde amplifiziert. Außerdem Herunterregulierung der GPC5-Expression durch siRNA hemmte die Proliferationsrate von RMS-Zellen. Eine andere Studie fand heraus, dass ein hohes Maß an GPC5 Ausdruck schlechten postoperativen Überlebenszeiten für kurativ respektiert NSCLC-Patienten vorhergesagt, was darauf hindeutet, den Wert von GPC5 als molekularer prognostischer Indikator [35, 37]. In unserer Studie war die Expression von GPC5 in höheren GC-Zelllinien und die Proteinspiegel von GPC5 waren ebenfalls höher in GC Geweben als in benachbarten noncancerous Geweben. Die Hemmung der GPC5 reduziert, um die GC-Zell-Proliferation und Invasion. Die Wiederherstellung der miR-217 gehemmt GPC5-vermittelte GC Zell-Proliferation und Invasion. Diese Ergebnisse zeigten, dass miR-217might wirken als Tumorsuppressor bei Magenkrebs durch GPC5 Targeting.

Im Ergebnis der vorliegenden Studie zeigte, dass miR-217was in GC Geweben und Zelllinien nach unten reguliert. Niedrige Konzentrationen von miR-217 Expression wurden mit pTNM Stadium der Patienten in Verbindung gebracht. Ectopic miR-217 Expression führte zu einer Hemmung der GC-Zell-Proliferation und Invasion. Weitere Untersuchungen haben ergeben, dass GPC5 ein potenzielles Ziel von miR-217 war. miR-217 kann als Indikator für die Prognose und therapeutisches Ziel für die GC-Patienten dienen.

Grundinformationen
S1 Tabelle. Zusammenfassung der klinisch-pathologischen Parameter von Patienten mit Magenkrebs
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125474.s001
(DOCX)
S2 Tabelle. Primer-Sequenz
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125474.s002
(DOCX)

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