PLOS ONE: Snail réglementés miR-375 inhibe la migration et l'invasion des cellules de cancer gastrique par ciblage JAK2

Résumé

microARN (miARN) ont été signalés à jouer un rôle crucial dans l'invasion du cancer et des métastases. Notre étude antérieure a montré que miR-375 fréquemment régulés à la baisse dans le cancer gastrique inhibe la prolifération cellulaire en ciblant la Janus Kinase 2 (JAK2). Ici, nous avons constaté en outre que le niveau d'expression de miR-375 est significativement diminuée dans les tissus de cancer métastatique de l'estomac par rapport aux témoins non métastases. L'expression ectopique de miR-375 inhibe la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques partiellement en ciblant JAK2. En outre, miR-375 expression est régulée négativement par la métastase associée facteur de transcription Snail, qui se lie directement au promoteur putatif de miR-375. En outre, la surexpression de l'escargot peut partiellement inverser l'inhibition de la migration gastrique des cellules cancéreuses provoquées par miR-375. Pris ensemble, ces données suggèrent que miR-375 peut être régulée négativement par Snail et impliqué dans la migration des cellules de cancer de l'estomac et de l'invasion potentiellement en ciblant JAK2

Citation:. Xu Y, Jin J, Liu Y, Huang Z, Deng Y, vous T, et al. (2014) Snail réglementés miR-375 inhibe la migration et l'invasion des cellules de cancer gastrique par ciblage JAK2. PLoS ONE 9 (7): e99516. doi: 10.1371 /journal.pone.0099516

Editeur: Ming Tan, University of South Alabama, États-Unis d'Amérique

Reçu 7 Février 2014; Accepté: 15 mai 2014; Publié le 23 Juillet, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Xu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par la Fondation Natural Scientific de Chine (31301149, 31071221, 31190063, 31125017 et 31100975), Ministère de la science et de la technologie de Chine (2013CB945603, 2012CB945004 et (2011CBA01001), Ministère de l'Education de Chine (20110101110103 et (20130101120001), Natural Scientific Fondation de la province du Zhejiang, en Chine (LQ13H160013, LQ14H160003, Z2100247 et Y2100106), le 111 projet (B13026), les Fonds de la recherche fondamentale pour les universités centrales (2014QNA7015) et du programme provincial du Zhejiang pour la culture de haut niveau talents de santé novateurs. la les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

intérêts concurrents:.. les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

introduction

Métastases sont les aspects les plus terribles du cancer et a été étudié pendant plus de 100 ans [1], [2]. Dans le cancer gastrique, la mortalité élevée attribue principalement aux retards de diagnostic en raison de l'absence de symptômes spécifiques à un stade précoce. Et des métastases est responsable de la mortalité liée au cancer gastrique [3], [4]. Migration et l'invasion des cellules cancéreuses sont des processus essentiels au cours de cancer procession métastatique qui consiste en une série d'étapes interdépendantes, y compris la prolifération, le détachement, la circulation, le transport, l'arrestation dans les organes, l'adhésion à la paroi du vaisseau, extravasation, mise en place d'un microenvironnement, et la prolifération dans des organes éloignés. Dans le cancer gastrique, les cellules invasion dans le tissu environnant est une première étape cruciale [3], [5]. Cependant, les mécanismes de l'estomac cellules cancéreuses la migration, l'invasion et les métastases ne sont pas entièrement comprises.

Ces dernières années, diverses molécules, par exemple, des facteurs de croissance, des cytokines, des molécules de matrice remodelage extracellulaire, et certains facteurs de transcription tels que Snail, Twist and ZEB1 [6], [7], [8], [9], [10], [11], ont été révélées pour conduire les progrès de la migration des cellules cancéreuses, l'invasion et les métastases. Ces derniers temps, il est devenu évident que, en plus des anomalies dans les gènes codant pour des protéines, des altérations dans des gènes non codantes peuvent également contribuer à la migration des cellules cancéreuses, l'invasion et les métastases, tels que les miARN, qui sont une classe de petits monocaténaire molécules non codantes d'ARN qui régulent l'expression des gènes avec un grand potentiel et ont été impliqués dans la régulation des cellules cancéreuses migration, l'invasion et la métastase comme activateurs ou suppresseurs [12], [13], [14], [15], [16] . À ce jour, un certain nombre de miARN ont été étudiés pour être impliqué dans l'estomac progression de métastases du cancer, par exemple, miR-218, miR-9, miR-7, et miR-146a [6], [17], [18], [19]. Nous avons étudié l'association entre miRNA dérégulée spécifique et l'étape de la métastase spécifique du cancer de l'estomac, qui fournira un aperçu des mécanismes potentiels de l'estomac cellules cancéreuses migration, l'invasion et les métastases.

Dans notre étude précédente, miR-375 était significativement régulée à la baisse dans le cancer gastrique et inhibe les cellules cancéreuses gastriques prolifération en ciblant JAK2 [20]. Fait intéressant, dans la présente étude, nous avons encore constaté que le niveau de miR-375 expression était encore plus faible dans les échantillons de cancer gastrique de patients atteints de métastases positives compaired avec celle des patients sans métastase. Ainsi, nous avons proposé que miR-375 pourrait avoir un rôle causal dans les métastases du cancer gastrique. Nos études ont révélé que l'expression ectopique de miR-375 a inhibé la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques aussi partiellement en ciblant JAK2. Nous avons également invité à découvrir comment l'expression de miR-375 a été réglée dans le cancer gastrique. Les résultats ont indiqué que miR-375 était une cible associée à des métastases du facteur de transcription Snail et son expression a été inversement corrélée à Snail dans le cancer gastrique. La surexpression de Snail peut partiellement inverser l'inhibition de la migration gastrique des cellules cancéreuses causées par miR-375. Ainsi, nos résultats démontrent que miR-375 inhibe gastrique la migration des cellules cancéreuses et l'invasion par Snail voie /miR-375 /régulation de JAK2.

échantillons Matériels et méthodes
cliniques (Déclaration d'éthique) et cellulaire lignes

spécimens de cancer gastrique cliniques et leurs échantillons gastriques non malignes paires appariées de 39 patients subissant une résection du cancer gastrique ont été fournis par Sir Run Run Shaw Hôpital (Hangzhou, Chine). Tous les échantillons ont été recueillis avec le consentement écrit des patients comme décrit précédemment [20]. Les deux tissus tumoraux gastriques et les tissus gastriques non tumoral adjacents recueillies après la chirurgie ont été et divisé en deux parties. On a congelé dans de l'azote liquide immédiatement pour une utilisation ultérieure, une autre partie a été conservée dans le formol pour l'analyse de la pathologie. Les patients participant à notre étude ont été séparés en sans métastase et les groupes de métastases positives (9/30). Les lignées de cancer gastrique de cellules (AGS et MGC-803) et une ligne non-maligne des cellules épithéliales gastriques (GES-1) ont été décrits précédemment [20].

ARN extraction

ARN total à partir des échantillons et des lignées cellulaires gastrique a été extrait en utilisant le kit d'isolation MIRVANA miRNA (Ambion, TX, USA) en suivant le protocole de la fabrication.

quantitative PCR en temps réel l'analyse

l'expression de miR-375 a été dosée à l'aide du Taqman microARN Assays (Applied Biosystems, CA, USA) avec des amorces spécifiques (P /N: 4373151, Applied Biosystems). réaction de transcription inverse a été réalisée à partir de 10 ng d'ARN total en utilisant les amorces en boucle. Quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) a été réalisée en utilisant le protocole standard Taqman microARN Essais sur le système de détection PCR ABI7500 en temps réel. La méthode ΔΔCt pour la quantification relative a été utilisée pour déterminer l'expression des miARN. Le Ct est le nombre de cycles fractionnaire à laquelle la fluorescence de chaque échantillon passe le seuil fixé. Le ACt a été calculé en soustrayant le Ct de snRNA U6 (RNU6B, P /N: 4373381, Applied Biosystems) du Ct du miARN d'intérêt. Le ΔΔCt a été calculé en soustrayant le ACt de l'échantillon de référence (paires de tissu non malin des échantillons chirurgicaux, des tissus normaux et des cellules GES-1 pour les lignées cellulaires de cancer de l'estomac) à partir du ACt de chaque échantillon. Pliez le changement a été déterminé comme 2 ^-ΔΔCt.

Migration et le dosage de l'invasion

Les cellules ont été transfectées avec 20 nM pré-miR-375 ou contrôle négatif en utilisant Transfection Agent (Ambion, TX, USA) suivant le protocole de fabrication dans des plaques à 24 puits. 24 h après la transfection, Transwell test de migration et Matrigel test d'invasion ont été réalisées séparément à l'aide de 24 puits Transwell insère avec 8 taille um des pores (Corning Costar Corp). Pour l'essai de migration Transwell, 2 × 10 ^{4 AGS ou 3 × 10 4 MGC-803 cellules en suspension dans 100 ul de milieu de culture correspondante sans sérum de veau fœtal (FBS) ont été chargés dans la chambre supérieure de Transwell insert avec non membrane revêtu de. Matrigel pour essai d'invasion, 5 × 10 4 AGS ou MGC-803 cellules ont été étalées dans 100 de milieu sans sérum pi dans la chambre de Matrigel revêtue supérieure à la place. Dans les deux essais, la chambre inférieure a été contenant 600 ul de milieu avec 20% de FBS. Les cellules ont ensuite été autorisés à migrer ou envahi pendant 12 h à 37 ° C. Les cellules qui ont migré ou envahies dans la chambre inférieure ont été fixées, colorées avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1:1000), visualisées sous microscope à contraste de phase et photographié. Nombre total de cellules ayant migré ou envahis a été compté par IPP logiciel (Image-Pro Plus 6.0). Toutes les expériences ont été répétées de manière indépendante au moins trois fois.}

Anti-cicatrisante dosage

Des cellules ont été transfectées comme décrit précédemment et on a laissé croître jusqu'à la confluence. Les cellules ont ensuite été cultivées dans un milieu correspondant sans FBS pendant 12 h puis grattées avec une pointe de pipette. zones de plaies ont été marquées et photographiés à 0 h, 12 h, 24 h et 36 h respectivement. Le taux de migration des cellules a été évaluée à la fois par photographie et de quantifier la distance migré des cellules déplacés du bord de la plaie vers le centre en utilisant IPP système 6.0. Toutes les expériences ont été répétées trois fois.

Constructs

Pour produire pGL3-375pro plasmide, la séquence d'ADN contenant pri-miR-375 (primaire miR-375), le promoteur a été amplifié par RT-PCR en utilisant les amorces 5'-ATCG CTCGAG ACA GAC CCT GCT AAG CGA CTC-3 'et 5'-ATCG AAGCTT ACG CCT TGG AGC TTG TCC-3', puis cloné dans le vecteur pGL3-basic (Promega). Pour construire le plasmide qui exprime Snail dans les cellules, la séquence cadre de lecture ouvert (ORF) de Snail a été cloné dans le vecteur d'expression de mammifère pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA) en utilisant les amorces 5'ATCG AA GCT TCG ATG GCC CCG TCT TTC CTC G-3 'et 5'-ATCG GGA TCC TCA GCG GGG ACA TCC TGA GCA-3'. Pour l'expression ectopique de JAK2 étiquetée FLAG, JAK2 humaine avec la région codante a été cloné dans 2C vecteur pCMV-Tag. Pour construire le plasmide qui exprime miR-375 dans des cellules de mammifères, les oligonucléotides appariés en fonction de la séquence primaire de a-miR-375 et de ses régions adjacentes ont été clonées dans le vecteur d'expression de mammifère pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA). Toutes les constructions ont été confirmées par séquençage.

Luciferase Assay

quarante mille cellules ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits 24 heures avant la transfection. Les cellules ont été transfectées avec pGL3-375pro ou vecteur pGL3-Basic. Le vecteur pRL-TK (Promega, WI, USA) contenant Renilla la luciférase a également été cotransfecté comme témoin de référence. Firefly et activités de luciférase de Renilla ont été mesurées en utilisant Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega) 24 h après transfection. Firefly activité luciférase a été normalisée à l'activité de la luciférase Renilla.

Analyses statistiques

Les données sont représentées sous forme de moyenne ± erreur standard (SE) de trois expériences indépendantes. Les relations entre l'expression de miR-375 et l'expression de Snail ARNm ont été explorés par coefficient de corrélation de Pearson, qui a été décrit précédemment [20]. Étudiant de t
-test et X
^{2 tests ont été effectués pour déterminer la signification statistique. P
< 0,05 a été considérée comme statistiquement significative}

Les de

Résultats miR-375 est considérablement downregulated dans les cellules et les tissus de cancer gastrique de patients atteints de métastases positives
.

Pour savoir si miR-375 est associée à des métastases du cancer gastrique, nous avons d'abord détecté le niveau d'expression de miR-375 dans les tissus de cancer gastrique primaire de patients atteints de métastases-positif et sans métastase. En comparaison avec des échantillons provenant de patients sans métastase, le niveau de miR-375 expression était la réduction de près de deux fois dans les tissus de patients atteints de métastases-positive ( P
< 0,05) (figure 1A). En accord avec ce résultat, le niveau d'expression de miR-375 dans des lignées cellulaires gastriques a été négativement associée aux capacités de migration des cellules et de l'invasion. Les propriétés métastatiques des lignées de cellules epitheliales gastriques (Ges-1, MGC-803 AGS) ont été caractérisés. Comme cela est représenté sur la figure 1C et 1D, la migration et l'invasion des capacités de la lignée de cellules AGS étaient supérieures à celle de la MGC-803 et Ges-1 lignées cellulaires ( P
< 0,01). A l'inverse, miR-375 l'expression dans les cellules AGS était inférieur à celui des MGC-803 et les cellules Ges-1 ( P
< 0,01) (figure 1B). En un mot, miR-375 est downregulated dans les tissus de cancer gastrique de patients atteints de métastases positives et dans les cellules de cancer gastrique avec une plus grande migration et l'invasion des capacités. Cette corrélation indique que miR-375 pourrait avoir un rôle causal dans les métastases du cancer gastrique.

surexpression de miR-375 inhibe gastrique la migration des cellules cancéreuses et l'invasion

Pour explorer le rôle de miR-375 en les métastases du cancer gastrique, nous avons examiné l'effet de miR-375 surexpression sur la migration et l'invasion de l'AGS et MGC-803 cellules de cancer gastrique avec une faible expression endougenous de miR-375. Les cellules ont été transfectées avec miR-375 précurseur (miR-375) ou des oligonucléotides de contrôle précurseurs négatif (négatif) ou aucune de ce qui précède (Mock). L'essai de migration Transwell a montré que la surexpression de miR-375 inhibe fortement la migration de l'AGS (figure 2A, 2B) et MGC-803 cellules (figure S1A, S1B). En accord avec ces résultats, le test anti-cicatrisation a également révélé que les vitesses des AGS (figure 2C, 2D) et MGC-803 cellules (Figure S1C, S1D) migration vers la surface de la plaie ont été réduits de manière significative après la surexpression de miR-375 . Nous avons utilisé plus Matrigel test d'invasion et a constaté que la surexpression de miR-375 a conduit à une réduction de plus de deux fois dans les propriétés invasives des AGS (figure 3A, 3B) et MGC-803 cellules (figure 3C, 3D). Collectivement, ces résultats indiquent que la surexpression de miR-375 est suffisante pour inhiber à la fois la migration et l'invasion des capacités des cellules de cancer gastrique.

JAK2 miR-375-régulée est impliquée dans la régulation de l'estomac la migration des cellules cancéreuses et l'invasion

Notre étude précédente a identifié JAK2 comme une cible en aval de miR-375 [20]. Ici, nous sommes intéressés à étudier si JAK2 est impliqué dans la régulation de l'estomac la migration des cellules cancéreuses et l'invasion. Nous avons utilisé la technique de RNAi vectoriel pour épuiser JAK2 endogène et constaté que les activités de migration et d'invasion de AGS (Figure 4) et MGC-803 cellules (Figure S2) ont tous deux été inhibées grandement. Dans le même temps, nous avons étudié si JAK2 pourrait contrecarrer l'effet d'inhibition de la migration gastrique des cellules cancéreuses et l'invasion provoquée par miR-375. Les cellules ont été co-transfectées avec miR-375 précurseur et soit surexpression vecteur JAK2 (miR-375 + JAK2) ou contrôler le vecteur vide (miR-375 + Vec). La surexpression de JAK2 nettement favorisé la migration des cellules et de l'invasion comme représenté sur la figure 4 et S2. Ainsi, en accord avec notre hypothèse, miR-375 peut inhiber la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques partiellement en ciblant JAK2. Nous avons en outre déterminé que JAK2 surexpression n'a aucun effet sur le niveau de miR-375 expression comme le montre la Figure S3. Cependant, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que la dysrégulation de miR-375 interfère avec d'autres cibles requises pour gastrique migration des cellules cancéreuses et l'invasion.

Snail miR-375 régule négativement l'expression

Les résultats ci-dessus indiquent que miR-375 peut être ciblé par certains facteurs de transcription qui sont associés à des cancers envahissants et les processus de métastases. Naturellement, nous nous concentrons sur la façon dont l'expression miR-375 est réglementé. Nous avons d'abord découvert une région d'ADN conversé en amont de pri-miR-375 gène, qui a été signalé à contenir le gène promoteur pri-miR-375 [21]. Nous avons ensuite effectué le programme Consite (http://asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite) et nous avons trouvé qu'il y avait six sites de liaison du facteur de transcription Snail dans la région d'ADN (figure 5A). La région de l'ADN a été clone dans le vecteur pGL3-basic (Promega) (pGL3-375pro) pour mesurer l'activité de promoteur. En accord avec les données du groupe Walker [21], nos résultats ont montré que cette région d'ADN contenant le promoteur du gène de pri-miR-375 et qui est capable de diriger l'expression de la luciférase (figure 5B). L'activité luciférase a été efficacement réprimée quand pGL3-375pro vecteur a été co-transfectées avec le vecteur d'expression Snail (escargot), mais pas en cas de co-transfectées avec le contrôle vecteur vide (Mock) (Figure 5C). En outre, Snail surexpression pourrait réduire le niveau de miR-375 expression de 46% (figure 5D). Afin de déterminer la pertinence clinique de ces résultats, nous avons encore corrélé le niveau d'expression de miR-375 avec le niveau Snail ARNm dans les mêmes patients atteints de cancer gastrique. Comme le montre la figure 5E, une corrélation inverse distincte a été trouvée entre le niveau de miR-375 et Snail expression de l'ARNm ( P
< 0,05, r = -0.6). Par conséquent, ces observations démontrent que Snail est un régulateur amont potentiel de miR-375 expression.

Snail est impliqué dans la régulation de l'estomac la migration des cellules cancéreuses en ciblant miR-375

Pour élucider davantage le corrélation de miR-375 et Snail, nous avons étudié si Snail est impliqué dans la régulation de l'estomac la migration des cellules cancéreuses en ciblant miR-375. Nous avons utilisé la technique à base de vecteurs à upregulate niveau d'expression Snail et a constaté que l'activité de migration des cellules AGS (figure 6) ont été grandement favorisé. En même temps, nous avons étudié si Snail pourrait contrecarrer l'effet de l'inhibition de la migration gastrique des cellules cancéreuses causées par miR-375. Les cellules ont été co-transfectées avec le vecteur de surexpression de miR-375 et le vecteur de surexpression Snail (escargot + miR-375). Surexpression d'escargot cellules nettement favorisé la migration et peut partiellement compenser l'effet d'inhibition des ulcères gastriques la migration des cellules cancéreuses provoquées par miR-375, comme illustré sur la figure 6. Ainsi, en accord avec notre hypothèse, l'escargot peut inhiber la migration des cellules de cancer gastrique partiellement en ciblant miR-375.

Discussion

MiRNAs ont été signalés à réguler la migration de la tumeur, l'invasion et les métastases, y compris le cancer gastrique [6], [22]. MiR-375 a déjà été démontré à jouer un rôle important dans l'estomac des cellules cancéreuses prolifération [20], [23]. Cependant, les mécanismes de régulation restent floues. Dans la présente étude, nous avons exploré davantage la fonction et les mécanismes potentiels de miR-375 dans la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques. Nous avons découvert que la surexpression de miR-375 a inhibé la prolifération, la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques partiellement en ciblant JAK2. Il a été plus d'une décennie depuis JAK2 a été cloné [24]. JAK2 est exprimé dans presque tous les tissus et associé à de nombreux anatomopathologique progresse. Bien qu'il soit évident que JAK2 agit comme un oncogène dans les deux troubles myéloprolifératifs et certaines tumeurs solides [25], [26], [27], sans participation directe de JAK2 dans la migration du cancer, l'invasion ou de métastase n'a été rapporté. Excitant, notre première étude a démontré que abattre JAK2 par ARNi a inhibé les activités de migration et d'invasion de cellules de cancer gastrique similaire à celle de la surexpression de miR-375. En outre, la surexpression de JAK2 pourrait favoriser la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques. Ainsi, nous avons supposé que JAK2 pourrait contrebalancer l'effet inhibiteur sur la migration des cellules provoquée par l'invasion et miR-375. Étant donné le rôle critique de miR-375 et JAK2 comme régulateurs maîtres dans l'estomac des cellules cancéreuses prolifération, la migration et l'invasion, deux d'entre eux a un potentiel thérapeutique dans le traitement du cancer gastrique. Par conséquent, il reste à étudier s'il y a d'autres cibles participent à miR-375 métastase gastrique médiée.

D'un intérêt particulier, nous avons étudié davantage comment miR-375 impliqués dans la carcinogenèse gastrique. Bien qu'il y ait une évidence que la méthylation de l'ADN et la désacétylation des histones sont les mécanismes possibles impliqués dans la régulation à la baisse miR-375 dans le cancer gastrique [23]. Les mécanismes sous-jacents miR-375 dysrégulation dans les métastases de cancer de l'estomac sont encore mal compris. Il y a possibilité d'un blocage de la transcription de l'expression du gène miR-375 dans ce processus. Ici, nous montrons que la métastase associée facteur de transcription Snail est un régulateur amont potentiel d'expression de miR-375. Escargot est un sel de zinc protéine de liaison d'ADN du doigt et a été rapporté comme répresseur de la transcription [28]. preuves montrent que Acumulating escargot se lie à Télébadges dans le promoteur de la E-cadhérine et réprime sa transcription pour réguler le développement de l'invasion tumorale [29]. En outre, la surexpression de Snail dans les cancers a été trouvée être associée aux métastases des ganglions lymphatiques, de la rechute de la tumeur et le pronostic [30], [31], [32], [33], [34], [35]. En accord avec les autres rapports, notre étude a révélé que l'ARNm de l'escargot est surexprimée dans les tissus du cancer de l'estomac en comparaison avec les tissus non malins adjacents. Comme l'activité de promoteur de miR-375 pourrait être supprimée par Snail et surexpression de Snail pourrait réduire le niveau d'expression de miR-375 de manière significative, nous avons encore trouvé une corrélation inverse distincte entre le niveau d'expression de miR-375 et le niveau de Snail ARNm dans le cancer gastrique échantillons. Snail se trouve également être impliqués dans la régulation de l'estomac la migration des cellules cancéreuses en ciblant miR-375.

En conclusion, nous avons identifié que miR-375 a été exprimé de manière aberrante dans les tissus de cancer gastrique de patients atteints de métastases positives ou des cellules de cancer de l'estomac avec une plus grande migration et l'invasion des activités en comparaison avec les tissus des patients sans métastases ou la lignée cellulaire épithéliale gastrique non-invasive GES-1, respectivement. La surexpression de miR-375 a réduit les activités de migration des cellules cancéreuses et l'invasion gastrique au moins partiellement en ciblant JAK2. De plus, Snail peut être un régulateur en amont de miR-375, qui régule négativement l'expression de miR-375 et a été impliqué dans la régulation de l'estomac la migration des cellules cancéreuses en ciblant miR-375. Ensemble, nos résultats fournissent une voie non décrite, dans laquelle un facteur de transcription Snail régule l'expression de miR-375, ce qui supprime sa JAK2 cible directe, ce qui conduit à inhiber la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques. Nos données indiquent que la restauration de miR-375 ou l'inhibition de Snail ou JAK2 peut être des stratégies thérapeutiques utiles pour le traitement du cancer gastrique. Il sera certainement très intéressant d'explorer davantage l'efficacité potentielle de ces molécules ciblant miR-375, JAK2 ou Snail dans le traitement du cancer gastrique. Un autre sujet intéressant pour la recherche future sera l'identification d'autres cibles possibles de miR-375, et, plus précisément, la possible implication de JAK2 dans les métastases du cancer gastrique.

Informations complémentaires
Figure S1.
expression ectopique de miR-375 supprime la migration des MGC-803 cellules. MGC-803 cellules transfectées avec miR-375 précurseur (miR-375), le contrôle négatif (négatif) ou aucune de ce qui précède (Mock) ont été soumis à essai Transwell de migration (A) et anti-cicatrisante analyse (C). (A) Les champs représentatifs de cellules invasives sur la face inférieure de la membrane qui ont été fixées et colorées avec du DAPI. (B) Nombre total de cellules migrées sur la face inférieure de la membrane a été compté par le logiciel IPP 6.0. (C) La migration des cellules vers la zone blessée a été photographié par microscopie à 0 h, 12 h, 24 h et 36 h après la blessure. Les lignes pointillées indiquent les zones dépourvues de cellules. (D), le taux de migration a été examiné en mesurant la distance des cellules déplacées à partir du bord de la plaie vers le centre en 36 heures après le grattage. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± ET d'au moins trois expériences indépendantes. Bars, 50 um. * P
< 0,05, ** P
< 0,01
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s001
(TIF)
Figure S2 .
surexpression de JAK2 inverse miR-375 inhibition induite de MGC-803 cellules migration et l'invasion. Les cellules transfectées avec les vecteurs ou des oligonucléotides indiqués ont été soumis à la migration Transwell (A) ou de dosage d'invasion de Matrigel (C). Les expériences de sauvetage pour miR-375 surexpression ont été réalisées par l'expression ectopique de JAK2 sans 3'-UTR dans les cellules miR-375-traités. (A, C) Les champs représentatifs des cellules sur la chambre inférieure à la migration post-12 h ou de l'invasion ont été montrées. Les barres d'échelle, 50 um. (B, D) Le nombre total de cellules ayant migré ou invasives de neuf champs choisis au hasard a été compté par IPP 6.0. * P
< 0,05, ** P
< 0,01
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s002
(TIF)
Figure S3 .
JAK2 n'a pas d'effet sur l'expression de miR-375. AGS et MGC-803 cellules ont été transfectées avec le vecteur d'expression ou JAK2 vecteur de commande et soumis à une analyse par RT-PCR pour le niveau d'expression de miR-375. Le niveau de l'ARN U6 a été utilisé comme témoin
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s003
(TIF)

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