PLoS ONE: Slak-Gereglementeerde MiR-375 Remt Migratie en invasie van maagkanker cellen door Targeting JAK2

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) zijn gemeld aan een cruciale rol bij kanker invasie en metastase spelen. Onze eerdere studie toonde aan dat miR-375 vaak neerwaarts gereguleerd bij maagkanker onderdrukt celproliferatie door zich te richten Janus kinase 2 (JAK2). Hier hebben we verder gevonden dat de expressie van miR-375 aanzienlijk uitgezaaide maagkanker weefsels is verminderd vergeleken met de niet-metastase controles. Ectopische expressie van miR-375 remt de migratie en invasie van maagkanker cellen gedeeltelijk door zich te richten JAK2. Verder wordt miR-375 expressie negatief gereguleerd door de metastase geassocieerde transcriptiefactor Snail, die direct bindt aan de vermeende promotor van miR-375. Bovendien, overexpressie van Snail kan gedeeltelijk de remming van maagkanker celmigratie veroorzaakt door miR-375 te keren. Samen vormen deze gegevens suggereren dat miR-375 negatief kan worden gereguleerd door de slak en betrokken bij maagkanker cel migratie en invasie potentieel door zich te richten JAK2

Visum:. Xu Y, Jin J, Liu Y, Z Huang, Deng Y, U T, et al. (2014) van de slak-Regulated MiR-375 Remt Migratie en invasie van maagkanker cellen door zich te richten JAK2. PLoS ONE 9 (7): e99516. doi: 10.1371 /journal.pone.0099516

Editor: Ming Tan, Universiteit van Zuid-Alabama, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 7 februari 2014; Geaccepteerd: 15 mei 2014; Gepubliceerd: 23 juli 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door Natural Scientific Foundation of China (31301149, 31071221, 31190063, 31125017 en 31100975), het ministerie van Wetenschap en Technologie van China (2013CB945603, 2012CB945004 en (2011CBA01001), Ministerie van Onderwijs van China (20110101110103 en (20130101120001), natuurwetenschappelijke Stichting van de provincie Zhejiang, China (LQ13H160013, LQ14H160003, Z2100247 en Y2100106), de 111 Project (B13026), het fundamentele onderzoek fondsen voor de Central Universiteiten (2014QNA7015) en Zhejiang Provinciaal Programma voor de teelt van hoog niveau Innovative Health talenten. de financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. de auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Metastase is de ergste aspecten van kanker en is onderzocht voor meer dan 100 jaar [1], [2]. Bij maagkanker, de hoge mortaliteit attributen voornamelijk vertraagde diagnose door het ontbreken van specifieke symptomen in een vroeg stadium. En metastase is verantwoordelijk voor de gastrische kanker-gerelateerde sterfte [3], [4]. Migratie en invasie van kankercellen essentiële processen tijdens kanker metastatische processie die bestaat uit een aantal onderling samenhangende stappen, waaronder proliferatie, onthechting, verkeer, transport, aanhouding in organen, naleving vaatwand extravasatie instelling van een micro-omgeving, en proliferatie in gelegen organen. Bij maagkanker cellen invasie in het omringende weefsel is een belangrijke eerste stap [3], [5]. De mechanismen van maagkanker cellen migratie, invasie en metastase zijn niet volledig begrepen.

De laatste jaren diverse moleculen, bijvoorbeeld groeifactoren, cytokinen, extracellulaire-matrix remodeling moleculen, en enkele transcriptiefactoren zoals Slak, Twist en ZEB1 [6], [7], [8], [9], [10], [11], zijn geopenbaard om de voortgang van kankercellen migratie, invasie en metastase rijden. De laatste tijd is het duidelijk geworden dat, naast afwijkingen in eiwit-coderende genen, veranderingen in niet-coderende genen kunnen ook bijdragen aan de kankercellen migratie, invasie en metastase, zoals miRNAs, die een klasse van klein enkelstrengs niet-coderende RNA moleculen die genexpressie met een groot potentieel reguleren en zijn betrokken bij de regulering van kankercellen migratie, invasie en metastase als activatoren of suppressors [12], [13], [14], [15], [16] . Tot op heden zijn een aantal miRNAs onderzocht te worden betrokken bij maagkanker metastase progressie bijvoorbeeld miR-218, miR-9, miR-7 en miR-146a [6], [17], [18], [19]. We hebben de koppeling tussen specifieke ontregelde miRNA en specifieke metastase stap van maagkanker, die inzicht zal geven in de mogelijke mechanismen van maagkanker cellen migratie, invasie en metastase onderzocht.

In onze vorige studie, miR-375 was aanzienlijk downregulated bij maagkanker en maagkanker remden celproliferatie doelwit JAK2 [20]. Interessant is dat in de onderhavige studie hebben we vonden verder dat het expressieniveau van miR-375 was zelfs lager in maagkanker monsters van metastase-positieve patiënten compaired met die van metastase-vrije patiënten. Zo hebben wij voorgesteld dat miR-375 een causale rol bij maagkanker metastase zou kunnen hebben. Onze studies ontdekt dat ectopische expressie van miR-375 remde de migratie en invasie van maagkanker cellen deels ook door zich te richten JAK2. We verder gevraagd om uit te vinden hoe miR-375 expressie werd gereguleerd bij maagkanker. Resultaten gaven aan dat miR-375 was een doelstelling van de metastase geassocieerde transcriptiefactor Snail en de expressie werd omgekeerd gecorreleerd met Snail bij maagkanker. Overexpressie van Snail kan de remming van maagkanker celmigratie veroorzaakt door miR-375 gedeeltelijk te keren. Zo, onze bevindingen tonen aan dat miR-375 remt maagkanker cellen migratie en invasie door middel van de slak /miR-375 /JAK2 regelgeving weg.

Materialen en methoden

klinische monsters (Ethiek verklaring) en mobiele lijnen

Clinical maagkanker exemplaren en hun-pair geëvenaard niet-kwaadaardige maag monsters van 39 patiënten die maagkanker resectie werden verstrekt door Sir Run Run Shaw Ziekenhuis (Hangzhou, China). Alle monsters werden verzameld met schriftelijke toestemming van de patiënt zoals eerder [20] beschreven. Beide maag tumor weefsels en aangrenzende nontumorous maag weefsels verzameld na de operatie waren en verdeeld in twee delen. Een werd bevroren in vloeibare stikstof onmiddellijk voor verder gebruik, een ander deel was opgeslagen in formaline voor pathologische analyse. De bij onze studie patiënten werden verdeeld in metastase-vrije en metastase-positieve groepen (9/30). De maagkanker cellijnen (AGS en MGC-803) en een niet-maligne maagepitheel cellijn (GES-1) zijn eerder beschreven [20].

RNA-extractie

Totaal RNA uit maag monsters en cellijnen werd geëxtraheerd met de Mirvana miRNA Isolatie Kit (Ambion, TX, USA) volgens het protocol van de fabrikant.

Kwantitatieve real-time PCR-analyse

de expressie van miR-375 werd bepaald met behulp van de Taqman MicroRNA assays (Applied Biosystems, CA, USA) met specifieke primers (P /N: 4.373.151, Applied Biosystems). Reverse transcriptiereactie werd uitgevoerd uitgaande van 10 ng totaal RNA met behulp van de lus primers. Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) werd uitgevoerd met behulp van de standaard Taqman MicroRNA Testen protocol over ABI7500 Real-Time PCR Detection System. De ΔΔCt Werkwijze voor relatieve kwantisering gebruikt om miRNA expressie te bepalen. De Ct is het fractionele cyclusnummer waarbij de fluorescentie van elk monster de vaste drempel. De ACt werd berekend door de Ct van U6 snRNA (RNU6B, P /N: 4.373.381, Applied Biosystems) vanaf de Ct van het miRNA plaats. De ΔΔCt werd berekend door de ACt van het referentiemonster (gepaarde niet-kwaadaardig weefsel voor chirurgische monsters, normale weefsels en GES-1 cel maagkanker cellijnen) vanaf de ACt van elk monster. Voudige verandering werd bepaald als 2 ^-ΔΔCt.

migratie en invasie assay

De cellen werden getransfecteerd met 20 nM pre-miR-375 of negatieve controle gebruikt Transfectie Agent (Ambion, TX, USA) volgens het protocol van vervaardiging in 24-well platen. 24 uur na transfectie werden Transwell migratieanalyse en Matrigel invasie assay afzonderlijk uitgevoerd middels 24 putjes Transwell inzetstukken met 8 urn poriegrootte (Corning Costar Corp.). Voor Transwell migratie assay, 2 × 10 ^{4 AGS of 3 x 10 4 MGC-803 cellen gesuspendeerd in 100 pi corresponderende kweekmedium zonder foetaal runderserum (FBS) werden geladen in de bovenste kamer van transwell insert met niet gecoate membraan. Voor Matrigel invasie assay 5 x 10 4 AGS of MGC-803 cellen werden uitgeplaat in 100 ul serumvrij medium in het bovenste Matrigel beklede kamer plaats. In beide testen werd de onderste kamer bevattende 600 ul medium met 20% FBS. De cellen mochten vervolgens gemigreerd of binnengevallen gedurende 12 uur bij 37 ° C. De cellen die gemigreerd of binnengedrongen in de onderste kamer werden vastgesteld, gekleurd met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 1:1000), gevisualiseerd onder fasecontrastmicroscoop en gefotografeerd. Totaal aantal gemigreerd of binnengedrongen cellen werd geteld door IPP (Image-Pro Plus 6.0) software. Alle experimenten werden onafhankelijk tenminste driemaal herhaald.}

Scratch-wondgenezende assay

De cellen werden getransfecteerd zoals eerder beschreven en kunnen groeien tot confluentie. De cellen werden vervolgens in overeenkomstige medium zonder FBS gedurende 12 uur en daarna gekrabd met een pipetpunt. Wond gebieden werden gekenmerkt respectievelijk gefotografeerd op 0 uur, 12 uur, 24 uur en 36 uur. De snelheid van de cellen migratie werd geëvalueerd door zowel fotograferen en kwantificeren van de gemigreerde afstand van de cellen verplaatst van de wondrand naar het midden met behulp van IPP 6.0-systeem. Alle experimenten werden driemaal herhaald.

Constructen

Om pGL3-375pro plasmide te produceren, de DNA-sequentie die miR-375 (primaire miR-375) promoter werd geamplificeerd door RT-PCR met behulp de primers 5'-ATCG CTCGAG ACA GAC CCT GCT CGA AAG CTC-3 'en 5'-ATCG AAGCTT ACG CCT AGC TGG TTG TCC-3' en vervolgens gekloneerd in pGL3-basisvector (Promega). Het plasmide dat slak uit in cellen construeren, het open leesraam (ORF) sequentie van Snail werd gekloneerd in zoogdierlijke expressievector pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA) met behulp van de primers 5'- ATCG AA GCT TCG ATG CCG CGC TCT TTC CTC G-3 'en 5'-GGA TCC ATCG TCA GCG GGG ACA TCC TGA GCA-3'. Voor ectopische expressie van FLAG-tag JAK2, menselijk JAK2 met coderende gebied werd gekloond in pCMV-Tag 2C vector. Het plasmide dat miR-375 tot expressie in zoogdiercellen te construeren, de gepaarde oligonucleotiden op basis van de primaire sequentie van is-miR-375 en de flankerende gebieden werden gekloneerd in zoogdierlijke expressievector pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA). Alle constructen werden bevestigd door sequentiebepaling.

Luciferase assay

Veertig duizend cellen werden gezaaid in 24-well platen 24 uur voor transfectie. Cellen werden getransfecteerd met hetzij pGL3-375pro of pGL3-Basic vector. Het pRL-TK vector (Promega, WI, USA) bevattende Renilla luciferase
werd gecotransfecteerd als referentie controle. Firefly en Renilla
luciferase activiteiten werden gemeten door het gebruik van Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega) 24 uur na transfectie. Vuurvlieg luciferase activiteit werd genormaliseerd tot Renilla luciferaseactiviteit.

Statistische analyses

De gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± standaardfout (SE) van drie onafhankelijke experimenten. Relaties tussen de expressie van miR-375 en de expressie van Snail mRNA werden onderzocht door Pearson's
correlatiecoëfficiënt, die eerder werd beschreven [20]. Student's T Shirts-test en X
^{2 testen werden uitgevoerd om statistische significantie te bepalen. P Restaurant < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant}

Resultaten

MiR-375 drastisch neerwaarts gereguleerd bij maagkanker cellen en weefsels van metastase-positieve patiënten
te zijn.

Om te achterhalen of miR-375 wordt geassocieerd met maagkanker metastase achterhalen, we eerst ontdekt de expressie van miR-375 in het primair maagkanker weefsels van metastase-positieve en metastase-vrije patiënten. Vergeleken met monsters van metastase-vrije patiënten, de expressie van miR-375 bijna tweevoudige reductie in weefsels van metastase-positieve patiënten ( P
< 0,05) (Figuur 1A). In de lijn van dit resultaat werd het expressieniveau van miR-375 in de maag cellijnen negatief verband met de capaciteiten van cellen migratie en invasie. De metastatische eigenschappen van maag epitheliale cellijnen (GES-1, MGC-803, AGS) werden gekarakteriseerd. Zoals getoond in Figuur 1C en 1D, migratie en invasie mogelijkheden van AGS cellijn waren groter dan die van MGC-803 en GES-1 cellijnen ( P
< 0,01). Omgekeerd, miR-375 AGS expressie in cellen lager was dan die van MGC-803 en GES-1-cellen ( P
< 0,01) (Figuur 1B). In een woord, is miR-375 neerwaarts gereguleerd bij maagkanker weefsels van metastase-positieve patiënten en bij maagkanker cellen met een grotere migratie en invasie vaardigheden. Deze correlatie geeft aan dat miR-375 een causale rol bij maagkanker metastase zou kunnen hebben.

overexpressie van miR-375 remt maagkanker cellen migratie en invasie

Om de rol van miR-375 verkennen in maagkanker metastase, het effect van miR-375 overexpressie op de migratie en invasie van AGS en MGC-803 maagkanker cellen met lage endougenous expressie van miR-375 onderzocht. Cellen werden getransfecteerd met hetzij miR-375 precursor (miR-375) of precursor-oligonucleotiden negatieve controle (negatief) of geen van beide (Mock). De Transwell migratie assay toonde dat overexpressie van miR-375 sterk remde de migratie van AGS (figuur 2A, 2B) en MGC-803 cellen (Figuur S1A, S1B). In overeenstemming met deze resultaten, de scratch-wondgenezing test bleek ook dat de snelheden van AGS (figuur 2C, 2D) en MGC-803 cellen (figuur S1C, S1D) migratie naar de wond aanzienlijk werden verlaagd na overexpressie van miR-375 . We verder werkzaam Matrigel invasie assay en gevonden dat overexpressie van miR-375 leidde tot een meer dan tweevoudige verlaging van de invasieve eigenschappen van AGS (figuur 3A, 3B) en MGC-803-cellen (Figuur 3C, 3D). Gezamenlijk geven deze resultaten aan dat overexpressie van miR-375 is voldoende om zowel de migratie en invasie mogelijkheden van maagkanker inhiberen.

MiR-375-gereguleerde JAK2 is betrokken bij de regulatie van maagkanker cellen migratie en invasie

Onze vorige studie heeft JAK2 geïdentificeerd als een stroomafwaarts doelwit van miR-375 [20]. Hier zijn we geïnteresseerd in het bestuderen van de vraag of JAK2 is betrokken bij de regulatie van maagkanker cellen migratie en invasie. We gebruikten vector-gebaseerde RNAi techniek endogene JAK2 afbreken en vond dat de migratie en invasie activiteiten van AGS (figuur 4) en MGC-803 cellen (Figuur S2) werden beide grotendeels geïnhibeerd. Tegelijkertijd onderzocht of JAK2 de inhibitie effect van maagkanker cellen migratie en invasie door miR-375 kon tegengaan. De cellen werden gecotransfecteerd met miR-375 precursor en ofwel JAK2 overexpressie vector (miR-375 + JAK2) of controle lege vector (miR-375 + Vec). Overexpressie van JAK2 duidelijk bevorderd cellen migratie en invasie als getoond in figuur 4 en S2. Dus in overeenstemming met onze hypothese, miR-375 kan de migratie en invasie van maagkanker inhiberen gedeeltelijk doelwit JAK2. Verder hebben we vastgesteld dat JAK2 overexpressie geen effect op de expressie van miR-375 zoals weergegeven in figuur S3. We kunnen echter niet de mogelijkheid uitsluiten dat de ontregeling van miR-375 interfereert met andere doelen vereist voor maagkanker cellen migratie en invasie.

Snail downregulates miR-375 expressie

De bovenstaande resultaten geven aan dat miR-375 kan worden gericht door transcriptie factoren die zijn geassocieerd met kanker en metastase proces. Natuurlijk richten we ons op hoe miR-375 expressie wordt gereguleerd. We hebben eerst een converseerde DNA-gebied stroomopwaarts van pri-miR-375-gen, dat werd gemeld aan de pri-miR-375-gen promoter [21] bevatten. Vervolgens hebben we Consite programma (http://asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite) uitgevoerd en vond dat er waren zes binding sites van de transcriptiefactor Snail in de DNA-regio (Figuur 5A). De regio DNA werd gekloneerd in pGL3-basisvector (Promega) (pGL3-375pro) om de promotoractiviteit te meten. In overeenstemming met de gegevens van Walker groep [21] Onze resultaten tonen dat dit DNA-gebied bevat de miR-375-genpromotor en in staat is luciferase-expressie (Figuur 5B). Luciferase activiteit werd onderdrukt efficiënt wanneer pGL3-375pro vector werd gecotransfecteerd met Snail expressievector (slak) maar niet wanneer gecotransfecteerd met lege controlevector (Mock) (figuur 5C). Bovendien kan overexpressie Slak de expressie van miR-375 verminderen met 46% (figuur 5D). Om de klinische relevantie van deze resultaten kunnen bepalen werden verder gecorreleerd de expressie van miR-375 met de slak mRNA niveau in dezelfde maagkankerpatiënten. Zoals weergegeven in figuur 5E, werd een duidelijke omgekeerde correlatie gevonden tussen de expressie van miR-375 en Slak mRNA ( P Restaurant < 0,05, r = -0,6). Vandaar dat deze waarnemingen tonen aan dat de slak is een potentiële upstream regulator van miR-375 expressie.

Snail is betrokken bij de regulatie van maagkanker cellen migratie door zich te richten miR-375

Om verder te ontrafelen van de correlatie van miR-375 en Slak, we onderzocht of Snail is betrokken bij de regulatie van maagkanker cellen migratie door zich te richten miR-375. We gebruikten vector-gebaseerde techniek om Snail expressieniveau upregulate en vond dat de migratie activiteit van AGS-cellen (Figuur 6) sterk werden bevorderd. Tegelijkertijd hebben we onderzocht of Snail de remming effect van maagkanker cellen migratie veroorzaakt door miR-375 kon tegen te gaan. De cellen werden gecotransfecteerd met miR-375 overexpressie vector en Slak overexpressie vector (Slak + miR-375). Overexpressie van Snail duidelijk bevorderd cellen migratie en kon gedeeltelijk inhibitie effect van maagkanker cellen wegtrekken als gevolg van miR-375 tegengaan zoals getoond in figuur 6. Aldus, in overeenstemming met onze hypothese, Slak kan de migratie van maagkanker cellen gedeeltelijk doelwit remmen miR-375.

Discussie

MiRNAs zijn gemeld tumor migratie, invasie en metastase waaronder maagkanker regelen [6], [22]. MiR-375 is eerder aangetoond dat een belangrijke rol speelt bij maagkanker celproliferatie [20], [23]. Echter, de regulerende mechanismen blijven onduidelijk. In de onderhavige studie hebben we onderzocht verder de functie en mogelijke mechanismen van miR-375 in de migratie en invasie van maagkanker cellen. We vonden dat overexpressie van miR-375 remde proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen gedeeltelijk doelwit JAK2. Het is meer dan een decennium sinds JAK2 eerste [24] werd gekloond. JAK2 expressie wordt gebracht in bijna alle weefsels en geassocieerd met vele pathologische vordert. Hoewel het duidelijk dat JAK2 werkt als een oncogen zowel myeloproliferatieve aandoeningen en bepaalde solide tumoren [25], [26], [27], geen directe betrokkenheid van JAK2 in migratie kanker, invasie of metastase heeft gemeld. Opwindend, onze studie eerst aangetoond dat neerhalen JAK2 door RNAi remde de migratie en invasie activiteiten van maagkanker cellen vergelijkbaar met die van de overexpressie van miR-375. Naast overexpressie van JAK2 kan de migratie en invasie van maagkanker cellen te bevorderen. Dus verondersteld dat JAK2 het remmende effect op de cellen migratie en invasie door miR-375 kan tegengaan. Gezien de cruciale rol van miR-375 en JAK2 als master regulatoren bij maagkanker celproliferatie, migratie en invasie, beiden therapeutische potentieel in maag kankerbehandeling. Daarom moet nog worden onderzocht of er andere doelen deelnemen aan miR-375 gemedieerde maag metastase.

Van bijzonder belang, we nader onderzocht hoe miR-375 betrokken zijn bij de maag carcinogenese. Hoewel er een duidelijk dat DNA methylatie en histon deacetylering zijn de mogelijke mechanismen betrokken bij de neerwaartse regulatie van miR-375 in maagkanker [23]. De mechanismen die ten grondslag liggen miR-375 ontregeling bij maagkanker metastase zijn nog steeds slecht begrepen. Er is een mogelijkheid voor transcriptionele blokkering van miR-375 genexpressie in dit proces. Hier laten we zien dat de metastase geassocieerde transcriptiefactor Snail is een potentiële upstream regulator van miR-375 expressie. Slak is een DNA-bindend zinkvinger eiwit en werd gerapporteerd als transcriptionele repressor [28]. Acumulating bewijzen tonen aan dat de slak bindt aan E-boxen in de promotor van E-cadherine en onderdrukt de transcriptie te reguleren tumorinvasie ontwikkeling [29]. Bovendien overexpressie van Snail in kankers werd in verband gebracht met lymfeknoop metastase, tumor recidief en prognose [30], [31], [32], [33], [34], [35]. In overeenstemming met andere rapporten, onze studie bleek dat Snail mRNA overexpressie in maagkanker weefsels in vergelijking met hun naburige niet-maligne weefsels. Aangezien de promotoractiviteit van miR-375 kon worden onderdrukt door Slak en overexpressie van Snail zou kunnen verminderen miR-375 expressieniveau, we verder gevonden een duidelijke omgekeerde correlatie tussen de expressie van miR-375 en de hoogte van Snail mRNA in maagkanker samples. Snail wordt ook gevonden in de regulatie van maagkanker cellen migratie worden betrokken door zich te richten miR-375.

Tot slot, we hebben vastgesteld dat miR-375 ontspoord in de maagkanker weefsels werd tot expressie gebracht van metastase-positieve patiënten of maagkanker cellen met grotere migratie en invasie activiteiten in vergelijking met weefsels van metastase-vrije patiënten of non-invasieve maagepitheel cellijn GES-1 respectievelijk. Overexpressie van miR-375 verminderde maagkanker cellen migratie en invasie activiteiten ten minste gedeeltelijk door zich te richten JAK2. Bovendien kan de slak een stroomopwaartse regulator van miR-375, die negatief reguleert de expressie van miR-375 en was betrokken bij de regulatie van maagkanker cellen migratie door zich te richten miR-375 zijn. Samen onze resultaten vormen een onbeschreven route, waarbij een transcriptiefactor Snail de expressie van miR-375, die zijn direct doelwit JAK2 onderdrukt, waardoor de migratie en invasie van maagkanker cellen te remmen. Onze gegevens blijkt dat herstel van miR-375 of remming van Snail of JAK2 kunnen nuttige therapeutische strategieën voor de behandeling van kanker maag. Het zal zeker interessant zijn om de mogelijke effectiviteit van die moleculen te richten miR-375, JAK2 of Slak in de behandeling van maagkanker verder te verkennen. Een ander interessant onderwerp voor toekomstig onderzoek zal de identificatie van andere mogelijke doelwitten van miR-375, en meer in het bijzonder de mogelijke betrokkenheid van JAK2 bij maagkanker metastase.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
Ectopische expressie van miR-375 onderdrukt de migratie van MGC-803 cellen. MGC-803 cellen getransfecteerd met miR-375 precursor (miR-375), negatieve controle (negatief) of geen van beide (Mock) onderworpen aan Transwell migratieanalyse (A) en scratch-wondgenezende analyse (C). (A) Representatieve gebieden van invasieve cellen op de onderzijde van membraan die werden gefixeerd en gekleurd met DAPI. (B) Totaal aantal gemigreerde cellen op de onderzijde van membraan werd geteld door IPP 6,0 software. (C) De cellen migratie naar de gewonde gebied werd gefotografeerd door microscopie bij 0 uur, 12 uur, 24 uur en 36 uur na de verwonding. De stippellijnen geven de gedeeltes zonder cellen. (D) De snelheid van migratie werd onderzocht door het meten van de afstand van de cellen verplaatst van de wondrand in de richting van het centrum in 36 uur na krabben. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SE van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Bars, 50 urn. * P Restaurant < 0,05, ** P Restaurant < 0,01
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s001
(TIF)
Figuur S2 .
Overexpressie van JAK2 keert miR-375-geïnduceerde remming van MGC-803 cellen migratie en invasie. De cellen getransfecteerd met de aangegeven vectoren of oligonucleotiden werden onderworpen met Transwell migratie (A) of Matrigel invasie assay (C). De redding experimenten voor miR-375 overexpressie werden uitgevoerd door ectopische expressie van JAK2 zonder 3'-UTR in miR-375-behandelde cellen. (A, C) Representatieve gebieden van de cellen op de onderste kamer bij 12 uur na migratie of invasie werden. Schaalbalken, 50 urn. (B, D) Het totaal aantal gemigreerd of invasieve cellen van negen willekeurig gekozen velden werd geteld door IPP 6.0. * P Restaurant < 0,05, ** P Restaurant < 0,01
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s002
(TIF)
Figuur S3 .
JAK2 heeft geen effect op de miR-375 expressie. De AGS en MGC-803 cellen werden getransfecteerd met vector JAK2 overexpressie of controlevector en onderworpen aan RT-PCR analyse voor de expressie van miR-375. Het niveau van RNA U6 werd gebruikt als controle
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s003
(TIF)

• PLoS ONE: De werkzaamheid Evaluatie van Subtotaal en Total Gastrectomies in Robotic Surgery voor maagkanker in vergelijking met die in Open en laparoscopische resectie: een meta-analyse
• PLoS ONE: antitumoreffecten van een Sirtuin Inhibitor, Tenovin-6, tegen maagkanker cellen via Death Receptor 5 Up-Regulation