PHB ist ein Onkogen berichtet und Tumorsuppressor bei Magenkrebs. Hier untersuchten wir, ob die PHB Citation. Leal MF, Cirilo PDR, Mazzotti TKF , Calcagno DQ, Wisnieski F, Demachki S, et al. (2014) Deregulation Prohibitin Expression in Magenkrebs ist im Zusammenhang mit der 3 'untranslatierten Region 1630 C > T Polymorphismus und Copy Number Variation. PLoS ONE 9 (5): e98583. doi: 10.1371 /journal.pone.0098583 Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika Empfangen: 17. Februar 2014; Akzeptiert: 5. Mai 2014; Veröffentlicht: 30. Mai 2014 Copyright: © 2014 Leal et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden Finanzierung:. Diese Studie (CNPq; RC, MACS und RRB) wurde von Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Zimmer (CAPESP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico unterstützt und Fundação de Amparo à Pesquisa Estado de São Paulo (FAPESP tun, MFL, PdRC und DQC ) in Form von Zuschüssen und Gemeinschaft ausgezeichnet. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung Konkurrierende Interessen:. RC ist ein Academic Editor für PLoS ONE. Die anderen Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte für sie existieren. Dabei werden nicht die Einhaltung von PLoS ONE den redaktionellen Richtlinien und Kriterien der Autoren ändern. Magenkrebs (GC) ist die vierthäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle weltweit [1]. Trotz bedeutender Fortschritte bei der Untersuchung von GC, die molekularen in Magen-Krebsentstehung beteiligt Veränderungen bleiben unbekannt. Chromosome 17 ist eine der häufigsten Chromosomen aufweisen numerische Aberrationen in GC (siehe Bewertung [2]). Unsere Gruppe hat zuvor berichtet, das Vorhandensein von Chromosom 17 Aneuploidie, beide Gewinne und Verluste in der GC bei Personen in Nordbrasilien [3], [4], [5], [6] und in allen GC-Zelllinien von Neoplasien in diesem etablierten Bevölkerung [7], [8]. Daher kann dieses Chromosom wichtige Gene enthalten in Magen-Krebsentstehung beteiligt sind. Die prohibitin-1 ( PHB erscheint PHB eine Rolle bei der Entwicklung verschiedener Krebsarten spielen. Überexpression von PHB wurde in Krebs des Gebärmutterhalses, der Speiseröhre, Brust, der Lunge, der Blase, der Schilddrüse, Eierstock und Prostata berichtet. Im Gegensatz dazu reduziert PHB Expression in Gliomen beobachtet und somatische Mutationen in PHB Die Rolle von PHB in Magen-Krebsentstehung ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Einige frühere Studien haben erhöhte Expression PHB in GC-Proben beschrieben [15], [16], [17], [18] und dem Serum von Patienten GC [19]. Allerdings haben andere Studien PHB Down-Regulation in dieser Art von Krebs berichtet [20], [21]. Die Untersuchung der molekularen in der Transkriptionsregulation beteiligt Mechanismen von PHB In dieser Studie haben wir zuerst ausgewertet die mRNA und Protein-Expression von PHB in GC und angepasst nichtneoplastische Magengewebeproben. Darüber hinaus zwischen den möglichen Assoziationen PHB Gewebeproben achtundvierzig Paare von GC-Proben und die entsprechenden nicht-neoplastische Magengewebeproben (> 5 cm von der Kante des Tumors) wurden verwendet Genotyp zu bewerten PHB Alle der Magenproben wurden erhalten von Patienten untersucht, die Gastrektomie an João de Barros Barreto University Hospital (HUJBB) in Nordbrasilien für GC unterzog. Alle Patienten hatten negative Historien der Exposition entweder gegenüber Chemotherapie oder Strahlentherapie vor der Operation, und es war keine Co-Auftreten von anderen Krebserkrankungen diagnostiziert. Eine schriftliche Einverständniserklärung mit Zustimmung der Ethikkommission der HUJBB erhalten. Ein Teil jeder Probe seziert Tumor war in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE). Abschnitte von FFPE Gewebe wurden mit Hämatoxylin-Eosin für histologische Bewertung gefärbt oder für die Immunhistochemie (IHC) Analyse verwendet. Zusätzliche Abschnitte jedes Tumors und gepaart nichtneoplastische Gewebeprobe wurden in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zur Nukleinsäureaufreinigung schockgefroren. Alle Proben wurden klassifiziert nach Laurén [22], und die Tumore wurden nach den TNM Kriterien aufgeführt [23]. DNA und mRNA Purification die Gesamt-DNA und mRNA wurden von Magengewebeproben unter Verwendung eines AllPrep DNA /RNA /Protein-Kit gleichzeitig isoliert (Qiagen, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die DNA- und RNA-Konzentrationen und Qualität wurden ein Nanodrop Spektralphotometer ermittelt (Kisker, Deutschland), und die Integrität der RNA wurde durch Gelelektrophorese bestimmt. PHB Die Paraffinschnitte wurden einer IHC . Tumorgewebeschnitten (3 oder 4 mm dick) wurden in Xylol und rehydriert in einer abgestuften Ethanolreihe entparaffiniert. Epitopdemaskierungslösung wurde in Citratpuffer, pH 6,0, in feuchter Hitze in einem Dampfkochtopf durchgeführt. Als nächstes werden die Gewebeschnitte wurden mit einem primären monoklonalen Maus-Antikörper gegen PHB (; Thermofisher Scientific, USA II-14-10, Verdünnung 1:100) inkubiert. Seiten der Immunreaktivität wurden unter Verwendung eines SuperPicture Polymer-Nachweis-Kit (Invitrogen, USA) sichtbar gemacht. Die Objektträger wurden durch Lichtmikroskopie unter Verwendung eines Nikon Eclipse-E600 Mikroskop (Nikon, USA), ausgestattet mit einer digitalen Nikon DSM1200F Kamera (Nikon, USA) angesehen. Die nicht-gefärbten Region (weißer Bereich) als Hintergrund ausgewählt und eingestellt. Jede Färbung wurde als ein positives Ergebnis zu sein, unabhängig von der Intensität. Negativ-Kontrollen, in denen der primäre Antikörper durch 5% Rinderserumalbumin (BSA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ersetzt wurde, wurden in allen Serien enthalten sind, und Abschnitte des normalen menschlichen Prostatagewebe wurden als positive Kontrollen verwendet. PHB Um Kopienzahl Variationen (CNV), der qPCR Verfahren wurde durchgeführt unter Verwendung von quantitativen TaqMan CNV-Assays (Life Technologies, USA) für die PHB bewerten PHB DNA von nicht-neoplastischen Proben wurde verwendet für PHB. PHB Allel-spezifische Expression zuerst durch Sequenzierung bestimmt. Zwanzig bis 40 ng der DNA oder cDNA wurde als Matrize für die PCR-Amplifikation mit den Primern für PHB Die allelischen Expressionsniveaus unter Verwendung PEAKPICKER Software bestimmt wurden analysiert [25]. Die Software wurde verwendet, um zuerst einen Normierungsschritt durchzuführen, bei dem die SNP-Allels Höhe mit der Höhe der Referenzpeaks in flankierenden Sequenzen verglichen. Wir beschränken diese Normalisierungsschritt innerhalb eines 21-Base-Fenster. Verhältniswerte über 1 wurden auf 1 /(Verhältnis) transformiert alle Werte zu einer 0-1-Skala zu transformieren, und die Werte wurden dann aus einer Referenz-DNA-Probe heterozygot für die rs6917 Polymorphismus auf den Mittelwert der Spitzenintensitätsverhältnisse angepasst. Genomische DNA von heterozygoten (N = 3) und homozygote Proben (N = 3, für Genotyp CC; N = 2, für Genotyp TT) wurde verwendet, um die Analyse zu validieren und den allelischen Verhältnisse von 50:50 und 0:100 zu bestätigen, beziehungsweise. Darüber hinaus cDNA aus Gewebeproben (Tumor- und Nicht-Tumorproben) aus den beiden Probanden homozygot für das kleinere Allel im rs6917 Polymorphismus wurden auch als Kontrollen. Allel-spezifische PHB Für die heterozygot cDNA-Proben, Allel-Verhältnisse. ≪ 0,8 oder >. 1.2 Hinweis auf Allel-spezifischen Ausdruck betrachtet wurden Statistische Analyse für mRNA-Expressionsanalyse, wir beurteilt zunächst die Annahme, dass die Daten einer Normalverteilung hatte die Shapiro-Wilk Normalitätstest mit den entsprechenden Tests für die anschließende statistische Vergleiche zu bestimmen. Die PHB Ergebnisse
Kopienzahl und der rs6917 Polymorphismus seine Expression in Magenkrebs beeinflussen. Down-Regulation und Hochregulierung von PHB
wurden in den untersuchten Tumoren beobachtet. Reduzierte Expression wurde mit Tumor Entdifferenzierung und Krebs Initiation verbunden. Das T-Allel des rs6917 Polymorphismus wurde mit reduzierten assoziiert PHB
mRNA-Spiegel. Darüber hinaus ist die Hochregulation von PHB
schien durch die Verstärkung zusätzlicher Genkopien geregelt werden. So PHB
Zahlvariation kopieren und die Expression des rs6917 Polymorphismus Differential kann in eine Rolle spielen PHB
Transkriptionsregulation
Einführung
) -Gen Karten zu dem Chromosom 17q21-Locus. Dieses Gen kodiert für ein ubiquitär, evolutionär konservierten Protein, das in einem breiten Spektrum von Organismen, einschließlich Bakterien, Pflanzen, Hefe, Protozoen und Säugetieren [9] zu finden ist. PHB wurde ursprünglich gedacht, um eine zentrale Rolle bei der Hemmung der Zellzyklusprogression zu spielen. In jüngerer Zeit hat PHB in der Stabilisierung von mitochondrialen Proteinen beteiligt als Chaperon charakterisiert worden; Somit hat PHB in verschiedenen zellulären Prozessen in Verbindung gebracht, einschließlich der Regulation der Proliferation, Apoptose und Gentranskription [10].
haben in sporadischen Brustkrebs nachgewiesen worden [9]. Zusätzlich ist eine funktionelle single nucleotide polymorphism (SNP) in der PHB
Gen, ein Cytosin an einer Thymin an Position 1630 in der 3'-UTR (rs6917) ändert, eine Variante erstellt, die antiproliferative Aktivität fehlt [11] [12], und anschließend kann das Risiko für malignes Wachstum erhöhen. Das T Allel dieses SNP wurde mit einem erhöhten Risiko für Brustkrebs [13] und Melanomen [14] verbunden. Daher bleibt die Rolle von PHB in der Krebsproliferation und /oder Unterdrückung umstritten.
bieten können neue Einblicke in seine Rolle bei der GC und unterstützen die Entwicklung neuer Krebstherapien.
und klinisch-pathologischen Eigenschaften untersucht. Da die PHB
Gen in einem chromosomalen Bereich häufig in numerische Aberrationen in GC [2] beteiligt befindet, auch wir bewertet die PHB
Zahl in den Tumorproben kopieren. Darüber hinaus ist die Allel-spezifische Expression von PHB
mRNA beurteilt die relative Transkriptions jedes Allel in heterozygoten Probanden mit dem rs6917 Polymorphismus als möglicher Mechanismus in
Regulierung PHB beteiligt zu untersuchen. Unseres Wissens hat keine vorherige Studie ausgewertet PHB
Kopienzahl und Allel-spezifische Expression in Tumorproben.
Materialien und Methoden
mRNA-Expression und der SNP rs6917. In 38 dieser GC-Proben, die PHB
Kopienzahl wurde ebenfalls bewertet. PHB Immunreaktivität wurde in 12 GC Proben.
PHB Gene Expression
Expression wurde durch quantitative reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) ausgewertet. Zunächst komplementäre DNA (cDNA) wurde unter Verwendung einer High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Polen), synthetisiert gemäß dem Protokoll des Herstellers. Real-time RT-qPCR-Analyse wurde unter Verwendung von QuantiFast SYBR Green Master Mix (Qiagen, Deutschland) auf einem 7500 Fast Real-Time PCR-Maschine (Applied Biosystems, USA) durchgeführt. Die folgenden Primer (150 nM jeweils) wurden für die RT-qPCR-Amplifikation entworfen: PHB
F5'-GTGTGGTTGGGGAATTCATGTGG-3 'und R5'-CAGGCCAAACTTGCCAATGGAC-3'; ACTB
F5'-AGAAAATCTGGCACCACA-3 'und R5'-AGAGGCGTACAGGGATAG-3'. Alle Reaktionen wurden in dreifacher Ausführung für sowohl das Zielgen und der internen Kontrolle ( ACTB
) durchgeführt. PHB
Ausdruck war normiert auf ACTB
Ausdruck. Die Fülle der mRNA-Expression wurde durch Amplifikationseffizienz eingestellt ( PHB
= 99%, ACTB
= 102%) [24]. Eine nicht-neoplastischer Magengewebeprobe wurde als Kalibrator für jedes gekoppelte Tumor bezeichnet die relative Quantifizierung (RQ) [24] zu berechnen.
PHB Protein Expression
Copy Number
Gen (Hs00178432_cn) und für die interne Kontrolle RNAse P
(Ƹ3326). Multiplex qPCR Reaktionen wurden in vierfacher Ausfertigung mit gDNA erfolgt nach dem Protokoll des Herstellers und Zyklusbedingungen in einem 7500 Fast Real-Time PCR-Maschine (Life Technologies, USA). Die relative Kopienzahl jeder Probe wurde mit Copy Caller Software V1.0 (Life Technologies, USA) geschätzt. Kommerzielle menschliche gDNAs (G1471 und G1521, Promega, USA) wurden für die Kalibrierung verwendet
Genotyping
Genotypisierung. Die Probanden wurden für die rs6917 Polymorphismus mit benutzerdefinierten TaqMan SNP Sonden und Primer (Applied Biosystems, Foster City, CA) genotypisiert. Die folgenden Primer und MGB-Sonden wurden für Allelunterscheidung entworfen: Primer F5'-TTGGTCCCTCTCAGATACCCA-3 'und R5'-CCGTGAGAAGGGCAGTCTCT-3'; FAM-markierten Sonde 5'-CTGCCAAAGACGTGT-3 '; und kleinere Allel VIC-markierten Sonde 5'-CTGCCAAAGATGTGT-3 '.
Allel-spezifische Expression
Genotypisierung verwendet. Vor der Sequenzierung wurden die PCR-Produkte unter Verwendung von 2% Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt, und die spezifische Bande wurde extrahiert und gereinigt. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung des Vorwärts-Primer für die PCR-Amplifikation und eine BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1 (Applied Biosystems, USA) verwendet, durchgeführt. Sequenzierungsprodukte wurden mit einem ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) getrennt. Einige der Proben wurden mindestens zweimal, darunter verschiedene RT-PCRs und Sequenzierungsassays.
verwendet Expression wurde auch in heterozygoten Proben durch RT-qPCR bewertet, wie zuvor beschrieben [26]. Verwenden eines benutzerdefinierten TaqMan SNP Genotyping Assay für PHB
Genotypisierung erzeugten wir eine lineare Regressionskurve für die log10 Fluoreszenzintensität vs
der log10 allelische Verhältnis basierend auf der seriellen Verdünnung von CC- und TT- genotypisierter genomische DNA aus Kontrollproben (Proben von zwei homozygote Individuen) in mehreren Verhältnissen (CC: TT 08.01, 04.01, 02.01, 01.01 Uhr, 01.02 Uhr, 01.04 Uhr, 01.08 Uhr) von RT -qPCR (1A). VIC Intensität auf der Standardkurve: Der allelische Verhältnis der Genexpression wurde durch den Schnittpunkt der log10 von FAM hochgerechnet. ROX (interner Referenzfarbstoff) und unspezifischer FAM und VIC-Fluoreszenz wurde in allen Analysen normalisiert. Alle Reaktionen doppelt durchgeführt wurden
mRNA-Spiegel wurden nicht normal verteilt und wurden (z-Score) für die Analyse transformiert. Beobachtungen > 2 oder < -2 wurden als Ausreißer und aus den Analysen ausgeschlossen. Ein gepaarter t-Test wurde durchgeführt, der Mittelwert PHB
Ausdruck zwischen nichtneoplastische und Tumorproben zu vergleichen. Der T-Test für unabhängige Stichproben und one-way ANOVA, gefolgt von der Games-Howell Post-hoc-Tests wurden verwendet, um die möglichen Assoziationen zwischen auszuwerten PHB
Expression und klinisch-pathologischen Eigenschaften, Protein Immunreaktivität, Genkopienzahl und Genotyp . Der Chi-Quadrat-Test oder der exakte Test nach Fisher wurde verwendet, um die Beziehung zwischen zu beurteilen PHB
Kopienzahl und Immunreaktivität und klinisch-pathologischen Faktoren. Pearson-Korrelation verwendet, um eine mögliche Korrelation zwischen Sequenzierung und dem TaqMan-Assay für Allel-spezifische Expressionsanalyse zu bewerten. In allen Analysen, P
. ≪ 0,05 wurde als signifikant angesehen
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