PLoS ONE: prohibitine Expression Deregulering bij maagkanker wordt geassocieerd met de 3 'onvertaalde gebied 1630 C > T polymorfisme en Copy Number Variation

Abstract

PHB is een gerapporteerde oncogen en tumor suppressor bij maagkanker. Hier, evalueerden we of de PHB
aantal kopieën en de rs6917 polymorfisme invloed op de expressie bij maagkanker. Neerwaartse regulatie en up-regulatie van PHB
waargenomen in de onderzochte tumoren. Verminderde expressie was geassocieerd met tumor dedifferentiatie en kanker initiatie. Het T allel van het polymorfisme rs6917 gepaard met een verminderde PHB
mRNA. Bovendien is de up-regulatie van PHB
leek te worden gereguleerd door de winst van extra gen exemplaren. Zo, PHB
aantal kopieën variatie en differentiële expressie van de rs6917 polymorfisme kan een rol spelen bij de PHB
gentranscriptieregulatie

Visum:. Leal MF, Cirilo PDR, Mazzotti TKF , Calcagno DQ, Wisnieski F, Demachki S, et al. (2014) prohibitine Expression Deregulering bij maagkanker wordt geassocieerd met de 3 'onvertaalde gebied 1630 C > T polymorfisme en Copy Number Variation. PLoS ONE 9 (5): e98583. doi: 10.1371 /journal.pone.0098583

Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 17 februari 2014; Aanvaard: 5 mei 2014; Gepubliceerd: 30 mei 2014

Copyright: © 2014 Leal et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd ondersteund door Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPESP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, RC, MACS en RRB) en Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, MFL, PdRC en DQC ), zoals subsidies en gemeenschap awards. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:. RC is een Academische Editor voor PLoS One. De andere auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​voor hen. Dit betekent niet naleving van de auteurs om PLoS ONE redactioneel beleid en de criteria te wijzigen.

Introductie

Maagkanker (GC) is de vierde meest voorkomende vorm van kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen over de hele wereld [1]. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de studie van GC, de moleculaire veranderingen betrokken bij maagkanker onopgehelderd.

Chromosoom 17 is een van de meest voorkomende chromosomen vertonen numerieke afwijkingen in GC (zie overzicht [2]). Onze fractie heeft eerder gemeld de aanwezigheid van chromosoom 17 aneuploidy, zowel winsten en verliezen, in GC bij individuen in Noord-Brazilië [3], [4], [5], [6] en in alle gevestigde uit neoplasie in deze GC cellijnen bevolking [7], [8]. Daarom kan dit chromosoom belangrijke genen die betrokken zijn bij de maag carcinogenese bevatten.

De prohibitine-1 ( PHB
) gen kaarten om het chromosoom 17q21 locus. Dit gen codeert voor een alomtegenwoordige, evolutionair geconserveerd eiwit dat wordt aangetroffen in een breed scala aan organismen, waaronder bacteriën, planten, gist, protozoa en zoogdieren [9]. PHB werd oorspronkelijk gedacht dat een centrale rol bij de remming van celcyclusprogressie spelen. Meer recent is PHB gekenmerkt chaperonne betrokken bij de stabilisatie van mitochondriale eiwitten; aldus is PHB betrokken bij verschillende cellulaire processen, waaronder de regulering van proliferatie, apoptose en gentranscriptie [10].

PHB lijkt een rol te spelen bij de ontwikkeling van verschillende soorten kanker. Overexpressie van PHB is gemeld in kanker van de cervix, slokdarm, borst-, long-, blaas-, schildklier, eierstok en prostaat. Daarentegen verminderde PHB expressie is waargenomen in gliomen en somatische mutaties in PHB Heb waargenomen bij sporadische borstkanker [9]. Bovendien, een functionele enkele nucleotide polymorfisme (SNP) in de PHB
gen, het veranderen van een cytosine voor een thymine op positie 1630 in de 3 'UTR (rs6917), wordt een variant die antiproliferatieve activiteit [11] mist , [12] en vervolgens kan het risico op kwaadaardige groei. Het T allel van deze SNP is geassocieerd met een verhoogd risico op borstkanker [13] en melanoom [14]. Daarom is de rol van PHB in proliferatie en /of bestrijding van kanker blijft controversieel.

De rol van PHB in maagkanker is niet volledig opgehelderd. Sommige eerdere studies hebben beschreven PHB verhoogde expressie in GC monsters [15], [16], [17], [18] en serum van patiënten GC [19]. Nochtans hebben andere studies PHB neerwaartse regulatie die in dit type kanker [20], [21]. Het onderzoek naar de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de transcriptionele regulatie van PHB
kan nieuwe inzichten verschaffen in haar rol in GC en de steun voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen tegen kanker.

In deze studie hebben we eerst geëvalueerd het mRNA en eiwitexpressie van PHB in GC en voldoen niet-neoplastische monsters maagweefsel. Bovendien, de mogelijke associaties tussen PHB Kopen en klinisch-pathologische kenmerken onderzocht. Omdat de PHB
gen is gelokaliseerd in een chromosomaal gebied vaak betrokken bij numerieke afwijkingen in GC [2], evalueerden we ook PHB
kopienummer in de tumormonsters. Bovendien is de allel-specifieke expressie van PHB
mRNA werd beoordeeld om de relatieve transcriptie van elk allel in heterozygote patiënten met de rs6917 polymorfisme als een mogelijk mechanisme betrokken bij de PHB
regelgeving te onderzoeken. Voor zover wij weten, heeft geen eerdere studie evalueerde PHB
aantal kopieën en allel-specifieke expressie in tumor samples.

Materialen en methoden

Tissue Monsters

achtenveertig paren GC monsters en overeenkomstige niet-neoplastische monsters maagweefsel (> 5 cm van de rand van de tumor) werden gebruikt om te evalueren PHB
mRNA expressie en SNP genotype rs6917. In 38 van deze GC monsters, de PHB
kopiëren nummer werd ook beoordeeld. PHB immunoreactiviteit werd geëvalueerd bij 12 GC specimens.

Alle maag werden verkregen van patiënten die gastrectomie ondergingen voor GC in João de Barros Barreto University Hospital (HUJBB) in Noord Brazilië. Alle patiënten hadden negatieve geschiedenis van blootstelling aan chemotherapie of radiotherapie voor de operatie, en er was geen comorbiditeit andere diagnose kanker. Schriftelijke informed consent met goedkeuring van de ethische commissie van HUJBB werd verkregen.

Een deel van elk ontleed tumor monster werd in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE). Delen van FFPE weefsel werden gekleurd met hematoxyline-eosine voor histologisch onderzoek of gebruikt voor immunohistochemie analyse (IHC). Extra porties elke tumor en gepaarde non-neoplastische weefselmonsters werden snel bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot nucleïnezuurzuivering.

Alle monsters werden geclassificeerd volgens de Laurén [22], en de tumoren werden opgevoerd volgens de TNM criteria [23].

DNA en mRNA Purification

Totaal DNA en mRNA werd geïsoleerd uit de maag gelijktijdig weefselmonsters met een AllPrep DNA /RNA /eiwit Kit (Qiagen, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. Het DNA en RNA concentraties en kwaliteit werden bepaald met een spectrofotometer NanoDrop (Kisker, Duitsland), en de RNA integriteit werd bepaald door gelelektroforese.

PHB Uitdrukking

PHB
expressie werd beoordeeld door kwantitatieve reverse transcriptie polymerase ketenreactie (RT-qPCR). Eerste complementaire DNA (cDNA) werd gesynthetiseerd met behulp van een extra grote cDNA Archive kit (Applied Biosystems, Polen) volgens het protocol van de fabrikant. Real-time RT-qPCR analyse werd uitgevoerd met QuantiFast SYBR Green Master Mix (Qiagen, Duitsland) op een 7500 Fast Real-Time PCR machine (Applied Biosystems, USA). De volgende primers (150 nm elk) werden ontworpen voor RT-qPCR versterking: PHB
F5'-GTGTGGTTGGGGAATTCATGTGG-3 'en R5'-CAGGCCAAACTTGCCAATGGAC-3'; ACTB
F5'-AGAAAATCTGGCACCACA-3 'en R5'-AGAGGCGTACAGGGATAG-3'. Alle reacties werden in drievoud uitgevoerd voor zowel het doelwit-gen en de interne controle ( ACTB
). PHB
expressie werd genormaliseerd naar ACTB
expressie. De overvloed aan mRNA expressie werd aangepast door amplificatie-efficiëntie ( PHB
= 99%, ACTB
= 102%) [24]. Een niet-neoplastisch maag weefselmonster werd aangeduid als een calibrator per gekoppelde tumor de relatieve kwantificatie [24] te berekenen (RQ).

PHB eiwitexpressie

De paraffinecoupes werden aan IHC . Tumor weefselcoupes (3 of 4 mm dik) werden van paraffine ontdaan in xyleen en gerehydrateerd in een ethanolreeks. Epitoop werd uitgevoerd in citraatbuffer, pH 6,0, in vochtige warmte in een snelkookpan. Vervolgens werden de weefselcoupes geïncubeerd met een primair monoklonaal antilichaam tegen PHB (II-14-10, verdunning 1:100; ThermoFisher Scientific, USA). Plaatsen van immunoreactiviteit werden gevisualiseerd onder toepassing van een polymeer SuperPicture detectie kit (Invitrogen, USA). De objectglaasjes werden bekeken door lichtmicroscopie met een Nikon Eclipse E600 microscoop (Nikon, USA) uitgerust met een Nikon digitale DSM1200F camera (Nikon, USA). De niet-gekleurde gebied (wit regio) werd geselecteerd en ingesteld als de achtergrond. Elke kleuring werd als een positief resultaat, ongeacht de intensiteit. Negatieve controles, waarbij het primaire antilichaam werd vervangen door 5% runderserumalbumine (BSA) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), werden in alle series en secties normaal humaan prostaatweefsel werden gebruikt als positieve controles.

PHB
copy Number

Om copy number variations evalueren (CNV), de qPCR procedure werd uitgevoerd met behulp van kwantitatieve TaqMan CNV assays (Life Technologies, USA) voor de PHB
gen (Hs00178432_cn) en voor de interne controle RNAse P
(Ƹ3326). Multiplex qPCR reacties werden uitgevoerd in viervoud met gDNA volgens het protocol en fietsen voorwaarden van de fabrikant in een 7500 Fast Real-Time PCR-machine (Life Technologies, USA). Het relatieve kopieaantal van elk monster werd geschat met Copy Caller Software V1.0 (Life Technologies, USA). Commercieel humaan gDNAs (G1471 en G1521, Promega, USA) werden gebruikt voor kalibratie

PHB
Genotypering

DNA van niet-neoplastische monsters werd gebruikt PHB.
genotypering. De proefpersonen werden gegenotypeerd voor de rs6917 polymorfisme met Custom SNP TaqMan probes en primers (Applied Biosystems, Foster City, CA). De volgende primers en MGB probes werden ontworpen voor allelische discriminatie: primers F5'-TTGGTCCCTCTCAGATACCCA-3 'en R5'-CCGTGAGAAGGGCAGTCTCT-3'; FAM-gemerkte probe 5'-CTGCCAAAGACGTGT-3 '; en kleine allel VIC-gelabelde probe 5'-CTGCCAAAGATGTGT-3 '.

PHB
allelspecifieke Expression

Allel-specifieke expressie werd eerst bepaald door sequencing. Twintig tot 40 ng DNA of cDNA werd gebruikt als een matrijs voor PCR amplificatie met de primers die voor PHB
genotypering. Voordat sequencing werden de PCR producten gescheiden onder 2% agarose gelelektroforese en de specifieke band werd geëxtraheerd en gezuiverd. Sequentiebepaling werd uitgevoerd met de voorwaartse primer gebruikt voor PCR amplificatie en een BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA). Sequencing producten werden gescheiden met een ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Enkele monsters werden ten minste tweemaal geanalyseerd, waaronder afzonderlijke RT-PCR en sequencing assays.

De allelische expressie niveaus werden bepaald onder toepassing PeakPicker programma [25]. De software werd gebruikt om eerst een normalisatiestap, waarbij het allel hoogte SNP vergeleken met de hoogte van referentie pieken in flankerende sequenties voeren. We beperkt deze normalisatie stap om binnen een 21-base venster. Verhouding waarden boven 1 werden omgevormd tot 1 /(verhouding) om alle waarden vormen naar een 0-1 schaal, en de waarden werden vervolgens ingesteld op het gemiddelde van de piekintensiteit verhoudingen van een DNA-monster heterozygoot voor het polymorfisme rs6917. Genomisch DNA van heterozygote (N = 3) en homozygote monsters (N = 3 voor genotype CC; N = 2, voor genotype TT) gebruikt om de analyse te valideren en de allelische verhoudingen van 50:50 en 0:100 bevestigen respectievelijk. Bovendien werden cDNA uit weefselmonsters (tumorale en niet-tumorale monsters) van de twee onderwerpen homozygoot voor het kleinere allel in de rs6917 polymorfisme ook als controles gebruikt.

allelspecifieke PHB
expressie werd ook geëvalueerd in heterozygote monsters door RT-qPCR, zoals eerder beschreven [26]. Met behulp van een Custom TaqMan SNP genotyperingstest voor PHB
genotypering, gegenereerd we een lineaire regressie curve voor de log10 fluorescentie-intensiteit vs of the log 10 allel ratio op basis van de seriële verdunning van CC- en TT- gegenotypeerd genomische DNA uit controlemonsters (monsters van twee homozygote individuen) in verschillende verhoudingen (CC: TT 08:01, 04:01, 02:01, 01:01, 01:02, 01:04, 01:08) door RT -qPCR (Figuur 1A). De allel verhouding van genexpressie werd geëxtrapoleerd door het snijpunt van de log10 van FAM: VIC intensiteit op de standaard curve. ROX (interne standaard kleurstof) en niet-specifieke FAM en VIC fluorescentie werd genormaliseerd in alle analyses. Alle reacties werden uitgevoerd in duplo

Voor de heterozygote cDNA monsters, allelische verhoudingen. ≪ 0,8 of >. 1.2 werden beschouwd als een indicatie van allel-specifieke expressie

Statistische analyse

voor mRNA analyse hebben we eerst beoordeeld de aanname dat de gegevens hadden een normale verdeling met de Shapiro-Wilk test om de normaliteit geschikte tests voor latere statistische vergelijkingen bepalen. De PHB
mRNA niveaus werden niet normaal verdeeld en werden getransformeerd (z-score) voor analyse. Observaties > 2 of < -2 werden beschouwd als uitschieters en uitgesloten van de analyses. Een gepaarde t-test werd uitgevoerd om het gemiddelde te vergelijken PHB
expressie tussen niet-neoplastische en tumormonsters. De T-test voor onafhankelijke steekproeven en one-way ANOVA gevolgd door de spel-Howell post hoc-test werden gebruikt om de mogelijke associaties tussen evalueren PHB
expressie en clinicopathologische kenmerken immunoreactiviteit eiwit, gen kopienummer en genotype . De Chi-kwadraat test of Fisher's exact test werd gebruikt om de relatie tussen beoordelen PHB
aantal kopieën en immunologische en klinisch-pathologische factoren. Pearson's correlatie werd gebruikt om een ​​mogelijke correlatie tussen sequentie en de TaqMan assay voor allel-specifieke expressie voor analyse. In alle analyses, P
. ≪ 0,05 werd beschouwd als significant

Resultaten

PHB
mRNA expressie in de maag tumoren

PHB
meningsuiting verschilde niet tussen neoplastische en afgestemd non-neoplastische maag monsters (0,173 ± 0.255 vs
0,227 ± 0,297, P
= 0,149). Echter, de mRNA niveaus verlaagd ten minste 1,5-voudig 20 (45,5%) van de monsters en GC verhoogd 9 (20,5%) in vergelijking met gekoppelde niet-neoplastische weefselmonsters maag.

Tabel 1 shows de associaties tussen de PHB
meningsuiting en het clinicopathologische kenmerken, evenals het eiwit immuunreactiviteit, rs6917 genotype en gen aantal kopieën. Slecht gedifferentieerde tumoren presenteerde verminderd PHB
expressie in vergelijking met matig gedifferentieerde tumoren ( P
= 0.029; tabel 1). Echter, beide slecht gedifferentieerde GC (0.025 ± 0.022 vs
0,239 ± 0,303; P Restaurant < 0,001, ANOVA gevolgd door de Games-Howell post-hoc test) en matig gedifferentieerde GC (0,057 ± 0,051 vs
0,239 ± 0,303; P Restaurant < 0,001, ANOVA gevolgd door de Games-Howell post-hoc test) gepresenteerd verminderd PHB
expressie in vergelijking met niet- neoplastisch maag weefselmonsters

minder PHB
expressie werd geassocieerd met een lagere invasie ( P
= 0,002; tabel 1). en een afwezigheid van lymfeklier metastase ( P
= 0,040; tabel 1). Bovendien gepresenteerd vroege GC verlaagde PHB
expressie vergeleken met geavanceerde GC ( P
= 0,002; Tabel 1). Bovendien kunnen alleen vroege GC gepresenteerd een significante vermindering PHB
mRNA-niveaus in vergelijking met de niet-neoplastische monsters (0,044 ± 0,027
versus 0,239 ± 0,303, P
< 0,001, ANOVA gevolgd door de spel-Howell post hoc test).

PHB immunoreactiviteit in maagtumoren

Protein immunokleuring werd in alle tumormonsters geëvalueerd door IHC (Tabel 2) waargenomen. In alle gevallen werd PHB immunoreactiviteit gedetecteerd in neoplastische en niet-neoplastische cellen, inclusief intestinale metaplasie en ontstekingscellen (Figuur 2A-H). PHB werd voornamelijk tot expressie in het cytoplasma. De kleurintensiteit en het percentage immunoreactieve cellen varieerde tussen de onderzochte gevallen (Tabel 2). Monsters presenteren. ≪ 80% van de tumorcellen met PHB immunoreactiviteit vertoonden verminderde mRNA expressie ( P
= 0,036, tabel 1)

PHB
Copy Number in Gastric Tumoren

PHB
werd versterkt in 13 van de 38 (34,2%) tumoren, waaronder 2 monsters met 4 exemplaren. Geen tumor presenteerde een PHB
verwijdering. Interessant, 3 monsters die uitschieter waarden gepresenteerd voor de PHB
mRNA expressie presenteerde ook genamplificatie. Daarom, als uitschieter waarden in de analyse werden opgenomen, PHB
expressie was hoger in monsters met genamplificatie dan bij mensen zonder genamplificatie (mediaan ± interkwartielafstand: 0,344 ± 0,335 vs
0,047 ± 0,07; P
= 0,003, niet-parametrische Mann-Whitney-test; figuur 3). PHB
winst werd geassocieerd met late-onset GC ten opzichte van early-onset GC ( P
= 0,022; tabel 2). Geen verband tussen PHB
aantal kopieën en eiwit immunologische of andere klinisch-pathologische kenmerken werd gevonden (tabel 3).

PHB
allelspecifieke Expression

we hebben ook onderzocht of de aanwezigheid van het kleinere allel in rs6917 geassocieerd met het genexpressieprofiel deregulering GC patiënten. In onze steekproef, 11 van de 48 patiënten (22,9%) waren heterozygoot en 2 patiënten (4,17%) waren homozygoot voor de minor allel in de rs6917 polymorfisme. Alle monsters van het T allel gepresenteerd 2 exemplaren van de PHB
gen. De aanwezigheid van het T-allel in de rs6917 polymorfisme geassocieerd met verminderde PHB
expressie in GC ( P
< 0,001, Tabel 1, Figuur 1B) en in niet-neoplastische monsters (gemiddelde ± SD. 0,302 ± 0,325 vs
0.045 ± 0.043; P Restaurant < 0,001; Figuur 1B)

Een paar van de heterozygote samples (tumor en niet-tumor) werd niet gebruikt voor de analyse van allel-specifieke expressie. Een correlatie tussen de allelische verhouding tussen de rs6917 polymorfisme bepaald door sequentiebepaling en de TaqMan assay werd gedetecteerd ( P
= 0,003, r = 0,627). Door sequentiebepaling, ongeveer 50% van de gevallen gepresenteerd differentiële allelische expressie (Figuur 1C). De TaqMan assay bleek dat de T en C allelen gepresenteerd allelische differentiële expressie in de meeste patiënten (figuur 1D). De mate van verschil in expressie tussen de twee allelen varieerde tussen individuen. De T naar C allel expressie verhouding was gelijk in de meeste paren tumor en non-tumorweefsel. Slechts één patiënt vertoonde een hogere C /T verhouding in zowel tumor en non-neoplastische monsters in beide assays. In de meeste gevallen werd een lagere C /T-verhouding gesignaleerd ongeacht de toegepaste methodologie (figuren 1C en 1D). Geen verband tussen differentiële allelische expressie en beginleeftijd of een andere clinicopathologische variabele werd gedetecteerd.

Discussie

PHB lijkt essentieel in de cellulaire homeostase te zijn. Recente studies hebben gesuggereerd dat PHB kan optreden als pro-tumorigene en tumorigene anti-factor in verschillende celtypes (zie [10]). In deze studie, het eiwit en mRNA expressieprofielen van PHB gepresenteerd een heterogeen patroon onder tumormonsters. Hoewel we geen significant verschil tussen GC en afgestemd non-neoplastische monsters vond namen wij waar dat het mRNA werd verminderd 1,5-voudig 45,5% GC monsters en meer in 20,5% van de tumoren. De verminderde mRNA expressie was gedeeltelijk te wijten aan een verminderde frequentie van tumorcellen presenteren PHB immunoreactiviteit, waardoor de heterogeniteit onder tumorcel klonen benadrukt.

Liu et al. [21] beschreven verminderde mRNA expressie in vier maagtumoren vergelijking met hun overeenkomstige normale weefsels, die deels onze resultaten bevestigt. Het ondersteunen van een anti-tumorigene rol PHB blokken binnenkomst in de S-fase [27]. Bovendien, het wildtype rs6917 PHB
3'UTR alleen kan celcyclus [11], [28] en tumorgroei [12] inhiberen evenals vermindering cel mobiliteit [29]. Verder PHB speelt een rol bij het handhaven van normale mitochondriale functie en morfologie [30]. Er is gesuggereerd dat het verlies van mitochondriale PHB expressie (cytoplasmatische lokalisatie, zoals waargenomen in onze voorbeelden) kunnen leiden tot versnelde proteolyse van membraaneiwitten en afbreuk functie van de mitochondriale ademhalingsketen [10]. Onze vorige proteomics studie toonde aan dat verschillende eiwitten die betrokken zijn bij de energiestofwisseling trajecten (mitochondriale dysfunctie, pyruvaat metabolisme, oxidatieve fosforylering, citraat cirkel, glycolyse /gluconeogenese) werden gedereguleerd [31] en stelde voor dat prominente mitochondriële functies kunnen worden gewijzigd, het verschuiven van de productie van energie in GC cellen en suggereert dat de Warburg effect [32].

Voor zover ons bekend, enkele studies hebben de mogelijke associatie tussen geëvalueerd PHB
mRNA niveaus en de rs6917 polymorfisme. In één studie, Tang et al. geen significant verband tussen de rs6917 polymorfisme en mRNA expressie in lymfoblastoïde cellijnen niet waarnemen in de HapMap databank [33]. Echter, deze auteurs gemeld dat het T allel is geassocieerd met een verhoogd risico op borstkanker. In deze studie hebben we aangetoond dat de aanwezigheid van het T-allel in de rs6917 polymorfisme geassocieerd met verminderde PHB
expressie in niet-neoplastische en neoplastische cellen maag. Het polymorfisme rs6917 ligt in het 3'UTR en alleen aanwezig in isovorm 1 van PHB, die werd gedetecteerd in het onderhavige onderzoek van cDNA sequentie en een TaqMan assay. De 3'UTR bevat meerdere cis
- en trans
-elementen, en deze structuren hebben een brede invloed op de mRNA translatie, stabiliteit en subcellulaire lokalisatie [34] [35], [36, ]. De T-variant zorgt voor een mogelijke bindingsplaats voor de microRNAs heeft-miR-1292 en heeft-886-5p (http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi-bin/snpinfo/mirna.cgi?2_rs6917), die al wijzigen genexpressie door ofwel mRNA verval of vertaling. Andere microRNAs waren eerder in verband met de regulering van de PHB
expressie in GC. Liu et al. [21] hebben gemeld dat PHB
wordt geregeld door miR-27a, dat is algemeen up-gereguleerd in GC. De auteurs gesuggereerd dat de down-regulatie van PHB
deze microRNA kan verklaren waarom de onderdrukking van miR-27a groei GC cellen kunnen remmen. Bovendien, de 3'UTR van PHB
codeert voor een antisense RNA (Gene ENSG00000250186; HAVANA http://www.sanger.ac.uk/). De aanwezigheid van het zeldzame allel in het antisense RNA kan de secundaire structuur wijzigen en de kcal /mol verlagen vergeleken met de brede-type sequentie middels CLC RNA Workbench 4,0 software (gegevens niet getoond). Daarom kan de rs6917 polymorfisme leiden tot PHB
neerwaartse regulatie door het creëren van nieuwe microRNA doelwit sites of via de regulering door de antisense-RNA in de maag cellen, wat bijdraagt ​​tot de maag carcinogenese.

In onze monsters meeste heterozygote patiënten hadden verhoogde expressie van het T-allel in vergelijking met de C-allel. Het verschil in de relatieve mRNA-niveaus van de twee allelen kan het gevolg zijn van verschillen in transcriptie of mRNA stabiliteit en ze tonen dat dit polymorfisme bevat een cis
werking in de maag cellen. Voor zover wij weten is dit de eerste studie naar de PHB differentiële
allel-specifieke expressie in tumor samples te evalueren. Eerdere studies hebben aangetoond dat een PHB
variant van het T allel op positie 1630 in de 3'UTR mist antiproliferatieve en tumorgroei onderdrukking vaardigheden in vitro en in diermodellen [29]. Daarom is de aanwezigheid van het T-allel, met name bij de presentatie verhoogde expressie ten opzichte van de C-allel, kan een "sponseffect" voor post-transcriptionele regulatoren zoals miRNAs veroorzaken en bijdragen tot maag celproliferatie, predisponerende heterozygoten van GC.

het mogelijke effect van de PHB
down-regulering - als gevolg van de rs6917 polymorfisme, bijvoorbeeld - op GC risico is in overeenstemming met de associaties tussen verminderde PHB
mRNA en lagere invasie, gebrek aan lymfeknoop metastase en beginnende GC. Voor zover wij weten, heeft geen eerdere studie in de literatuur de mogelijke associatie tussen PHB
meningsuiting en GC prognostische factoren geëvalueerd. Deze bevindingen suggereren dat PHB
down-verordening kan worden verlangd voor tumorinitiatie.

Echter, vorige proteomics studies PHB opregulatie in de maag tumoren [15], [16], [17] . Bovendien, Kang et al. [18] hebben de overexpressie van PHB eiwitten en mRNA in GC (in vergelijking met aangrenzende normale maag weefsels) in de Aziatische personen gemeld. In onze steekproef, 20,5% van de tumoren presenteerde ook toegenomen PHB
expressie. PHB lijkt een rol te spelen bij celproliferatie, adhesie en migratie en derhalve in de progressie van maligne transformatie door middel van RAS-RAF signalering [37]. Onze hypothese is dat een toename van PHB
mRNA-niveau is vereist voor GC progressie. De evaluatie van menselijke monsters laat alleen het onderzoek één tijdstip (bij de chirurgische behandeling); dus we zijn niet in staat om de dynamische regulatie van genexpressie te evalueren. Echter, PHB
expressie is waarschijnlijk gerelateerd aan de cellulaire context en moleculaire achtergrond van maag-cellen.

Kang et al. [18] hebben gemeld dat PHB eiwit en mRNA expressie verschillen matig en slecht gedifferentieerde GC en dat alleen slecht gedifferentieerde tumoren onderhavige PHB overexpressie in vergelijking met niet-neoplastische monsters. In ons voorbeeld, werden enkele tumoren geclassificeerd volgens de mate van differentiatie. Echter, we hebben geconstateerd dat zowel slecht en matig gedifferentieerde tumoren presenteerde verminderd PHB
expressie in vergelijking met niet-neoplastische monsters en dat de PHB
mRNA niveaus lager in de slecht gedifferentieerde tumoren waren. Daarom is in onze monsters, PHB
expressie bleek af te nemen met een tumor dedifferentiatie. Verder onderzoek is nodig voor een beter begrip van de rol van PHB in de differentiatie proces in normale en neoplastische maag cellen.

In deze studie hebben we vastgesteld dat 34,2% van de tumoren kreeg kopieën van PHB
. Veranderingen in chromosoom 17 zijn geassocieerd met tumorprogressie en maligne potentieel primaire GC [38], [39]. Voor zover wij weten is dit de eerste studie die een nauwkeurige en robuuste techniek om de PHB
kopienummer GC monsters te evalueren. We zagen een verband tussen de PHB
aantal kopieën en mRNA-niveaus, het onthullen van een cis-dosis effect van CNV op genexpressie niveaus. Daarom is onze resultaten suggereren dat CNV is een belangrijk element in het besturen van downstream PHB
transcriptie in sommige maag tumoren. Deze genetische mechanisme, vooral waargenomen in late-onset GC, kan een bijdrage leveren voor de PHB
rol als oncogen. Deze bevinding ook benadrukken dat een aantal mechanismen kunnen leiden tot PHB
deregulering in GC cellen.

De stijging van de PHB
kopiëren nummer werd geassocieerd met late-onset GC. Clinicopathologische verschillen tussen early-onset en late-onset GC zijn beschreven [40], [41], [42], maar er is weinig bekend over de genetische veranderingen in verband met de leeftijd bij het begin van GC [2]. Buffart et al. [43] eerder aangetoond dat jonge en oude patiënten behoren tot groepen met verschillende genomische profielen. De versterking van de PHB
locus benadrukt de heterogeniteit van GC.

De belangrijkste beperking van deze studie is de relatief kleine steekproef. Daarom presenteerden statistische analyse gereduceerd vermogen om significante verschillen tussen groepen waarschijnlijk detecteren vanwege de grote heterogeniteit tussen monsters. Derhalve kunnen vals-negatieve resultaten zijn opgetreden. Verdere evaluaties zijn nog steeds nodig om de rol van de evaluatie PHB
in de maag carcinogenese en de transcriptie regulatie.

Tot slot, zowel de down-regulatie en up-regulatie van PHB
kan worden waargenomen in GC. De vermindering van de PHB
expressie lijkt te worden betrokken bij de tumor dedifferentiatie proces en kanker initiatie. Het T-allel in de PHB
rs6917 polymorfisme kan bijdragen aan de verlaging waargenomen PHB
mRNA en derhalve bijdragen aan GC risico. Echter, PHB
up-regeling lijkt te worden gereguleerd door gen aantal kopieën. Differentiële expressie van het polymorfisme rs6917 gastrische monsters werd gerapporteerd voor de eerste keer, en deze variatie kan een rol spelen in de regulatie van PHB
expressie spelen. De pleiotrope functie van PHB
benadrukt de noodzaak van verder onderzoek op GC omdat de activiteit in maag cellen waarschijnlijk strak gereguleerd om eventuele negatieve gevolgen van verminderde of verhoogde expressie vermijden.

Acknowledgments

de auteurs zijn dankbaar Sueli Nonogaki van Adolfo Lutz (São Paulo, SP, Brazilië) voor de technische ondersteuning in de immunohistochemie analyses.

• PLoS ONE: MUC5AC Upstream Complex Repetitive Regio polymorfismen zijn geassocieerd met gevoeligheid en de klinische fase van Gastric Cancer
• PLoS ONE: normale fibroblasten Laten E-cadherine Verlies en verhoog lymfekliermetastasen in Gastric Cancer