PLOS ONE: Prohibitin Déréglementation d'expression dans le cancer gastrique est associée à l'extrémité 3 'Untranslated Région 1630 C > T Polymorphisme et Copy Number Variation

Résumé

PHB est un oncogène et suppresseur de tumeur rapportée dans le cancer gastrique. Ici, nous avons évalué si le PHB
nombre de copies et le polymorphisme rs6917 affectent son expression dans le cancer gastrique. La régulation et la régulation de la PHB
ont été observées dans les tumeurs évaluées. expression réduite a été associée à la dédifférenciation de la tumeur et l'initiation du cancer. L'allèle T du polymorphisme rs6917 était associée à une réduction les niveaux d'ARNm
PHB. En outre, la régulation positive de PHB
semblait être régulée par le gain de copies de gènes supplémentaires. Ainsi, PHB
copie variation du nombre et de l'expression différentielle du polymorphisme rs6917 peut jouer un rôle dans PHB
régulation transcriptionnelle

Citation:. Leal MF, Cirilo PDR, Mazzotti TKF , Calcagno DQ, Wisnieski F, Demachki S, et al. (2014) Prohibitin Expression La déréglementation dans le cancer gastrique est associé à la région non traduite 3 '1630 C > T Polymorphisme et Copy Number Variation. PLoS ONE 9 (5): e98583. doi: 10.1371 /journal.pone.0098583

Editeur: Amanda Ewart Toland, Medical Center Ohio State University, États-Unis d'Amérique

Reçu le 17 Février 2014; Accepté: 5 mai 2014; Publié: 30 mai 2014

Droit d'auteur: © 2014 Leal et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette étude a été soutenue par Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Supérieur (CAPESP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; RC, MACS et RRB) et Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; MFL, CEDE et DQC ) sous forme de subventions et bourses de recherche. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:. RC est un éditeur académique pour PLOS ONE. Les autres auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent pour eux. Cela ne modifie pas l'adhésion des auteurs à PLOS ONE politiques et critères éditoriaux.

Le cancer gastrique Introduction (GC) est le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde [1]. En dépit des progrès significatifs dans l'étude de la GC, les altérations moléculaires impliqués dans la carcinogenèse gastrique restent inconnus.

Chromosome 17 est l'un des chromosomes les plus courants présentant des aberrations numériques en GC (voir la revue [2]). Notre groupe a déjà signalé la présence du chromosome 17 aneuploïdie, les gains et les pertes, en GC chez les individus dans le nord du Brésil [3], [4], [5], [6] et dans toutes les lignées cellulaires du GC établies à partir de néoplasies dans ce population [7], [8]. Par conséquent, ce chromosome peut contenir des gènes importants impliqués dans la carcinogenèse gastrique.

Le prohibitin-1 ( PHB
) Les cartes de gènes au chromosome 17q21 locus. Ce gène code pour une protéine ubiquitaire, évolutivement conservées qui se trouve dans une large gamme d'organismes, y compris des bactéries, des plantes, des levures, des protozoaires et des mammifères [9]. PHB a été initialement pensé pour jouer un rôle central dans l'inhibition de la progression du cycle cellulaire. Plus récemment, le PHB a été caractérisée comme un chaperon impliquée dans la stabilisation des protéines mitochondriales; ainsi, PHB a été impliquée dans plusieurs processus cellulaires, y compris la régulation de la prolifération, l'apoptose et la transcription du gène [10].

PHB semble jouer un rôle dans le développement de différents types de cancer. La surexpression du PHB a été rapporté dans le cancer du col utérin, de l'oesophage, du sein, du poumon, de la vessie, de la thyroïde, de l'ovaire et de la prostate. En revanche, réduit l'expression de PHB a été observé dans les gliomes et les mutations somatiques dans PHB
ont été détectés dans les cancers du sein sporadiques [9]. En outre, une fonction polymorphisme nucléotidique simple (SNP) dans le
gène de PHB, en changeant une cytosine à la thymine en position 1630 dans la région 3 'UTR (rs6917), on obtient un variant qui est dépourvu d'activité anti-proliférative [11] , [12] et par la suite peut augmenter le risque de tumeur maligne. L'allèle T de ce SNP a été associée à un risque accru de cancer du sein [13] et le mélanome [14]. Par conséquent, le rôle de PHB dans la prolifération du cancer et /ou suppression reste controversée.

Le rôle de PHB dans la carcinogenèse gastrique n'a pas été complètement élucidé. Des études antérieures ont décrit l'expression accrue du PHB dans des échantillons de GC [15], [16], [17], [18] et le sérum de patients atteints de GC [19]. Cependant, d'autres études ont rapporté PHB régulation à la baisse dans ce type de cancer [20], [21]. L'enquête sur les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation transcriptionnelle de PHB
peuvent fournir de nouvelles perspectives sur son rôle dans la GC et de l'aide au développement de nouveaux traitements anticancéreux.

Dans cette étude, nous avons d'abord évalué l'expression de l'ARNm et de protéines de PHB en GC et des échantillons appariés de tissus gastriques non néoplasiques. En outre, les associations possibles entre PHB
et les caractéristiques clinico ont été étudiés. Parce que le gène de PHB est situé dans une région chromosomique fréquemment impliqué dans des aberrations numériques en GC [2], nous avons également évalué la PHB
nombre de copies dans des échantillons de tumeurs. En outre, l'expression spécifique d'allèle de PHB
ARNm a été évaluée pour étudier la transcription relative de chaque allèle chez les sujets hétérozygotes avec le polymorphisme rs6917 comme un mécanisme possible impliqué dans PHB
réglementation. À notre connaissance, aucune étude antérieure a évalué PHB
nombre de copies et l'expression spécifique d'allèle dans des échantillons de tumeurs.

Matériel et méthodes

Des échantillons de tissus

quarante-huit paires d'échantillons de CPG et les échantillons gastriques non néoplasiques correspondant tissulaires (> 5 cm du bord de la tumeur) ont été utilisés pour évaluer PHB
expression de l'ARNm et le génotype SNP rs6917. Dans 38 de ces échantillons de GC, le PHB
nombre de copies a également été évaluée. PHB immunoréactivité a été évaluée dans 12 échantillons de GC.

Tous les échantillons gastriques ont été obtenus chez les patients ayant subi une gastrectomie pour GC à João Barros Hôpital de Barreto Université (HUJBB) dans le nord du Brésil. Tous les patients avaient des antécédents négatifs de l'exposition à la chimiothérapie ou la radiothérapie avant la chirurgie, et il n'y avait pas de co-occurrence d'autres cancers diagnostiqués. Consentement éclairé écrit avec l'approbation du comité d'éthique HUJBB a été obtenu.

Partie de chaque échantillon de tumeur disséqués était fixé au formol et inclus en paraffine (FFPE). Les sections de tissu FFPE ont été colorées à l'hématoxyline-éosine pour évaluation histologique ou utilisés pour l'immunohistochimie (IHC) analyse. Des portions supplémentaires de chaque tumeur et des échantillons de tissu non néoplasique par paires ont été congelés rapidement dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à la purification d'acide nucléique.

Tous les échantillons ont été classés selon Laurén [22], et les tumeurs ont été organisées en fonction des critères de stadification TNM [23].

ADN et purification d'ARNm

ADN total et l'ARNm ont été simultanément isolés à partir d'échantillons de tissu gastrique en utilisant un /RNA Kit AllPrep ADN /protéine (Qiagen, Allemagne) selon les instructions du fabricant. Les concentrations et la qualité d'ADN et d'ARN ont été déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop (Kisker, Allemagne), et l'intégrité de l'ARN a été déterminée par électrophorèse sur gel.

Gene Expression PHB

PHB
On a évalué l'expression par transcription inverse réaction en chaîne par polymérase quantitative (RT-qPCR). Tout d'abord, l'ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé en utilisant un kit High-Capacity Archive ADNc (Applied Biosystems, Pologne) selon le protocole du fabricant. En temps réel une analyse par RT-qPCR a été réalisée en utilisant QuantiFast SYBR Green Master Mix (Qiagen, allemand) sur une machine 7500 rapide Real-Time PCR (Applied Biosystems, USA). Les amorces suivantes (150 nM chacune) ont été conçues pour l'amplification par RT-qPCR: PHB
F5'-GTGTGGTTGGGGAATTCATGTGG-3 'et R5'-CAGGCCAAACTTGCCAATGGAC-3'; ACTB
F5'-AGAAAATCTGGCACCACA-3 'et R5'-AGAGGCGTACAGGGATAG-3'. Toutes les réactions ont été réalisées en triple exemplaire à la fois pour le gène cible et le témoin interne (
ACTB). expression de PHB a été normalisée à l'expression
ACTB. L'abondance de l'expression de l'ARNm a été ajustée par amplification efficacité ( PHB
= 99%, ACTB
= 102%) [24]. Un échantillon de tissu gastrique non néoplasique a été désigné comme un calibrateur pour chaque tumeur appariés pour calculer la quantification relative (RQ) [24].

PHB Protein Expression

Les sections de paraffine ont été soumis à IHC . des sections de tissu tumoral (3 ou 4 mm d'épaisseur) ont été déparaffinées dans du xylene et réhydratées dans une série d'éthanol à gradient. Epitope a été réalisée dans un tampon citrate, pH 6,0, dans la chaleur humide dans une cocotte-minute. Ensuite, les coupes de tissu ont été incubées avec un anticorps primaire monoclonal de souris contre le PHB (II-14-10, la dilution 1:100; ThermoFisher Scientific, États-Unis). Sites d'immunoréactivité ont été visualisées en utilisant un kit de détection SuperPicTure Polymer (Invitrogen, USA). Les lames ont été vu par microscopie optique en utilisant un microscope Nikon Eclipse E600 (Nikon, USA) équipé d'un appareil photo numérique Nikon DSM1200F (Nikon, États-Unis). La région non teinté (région blanc) a été sélectionné et défini comme l'arrière-plan. Toute coloration a été considéré comme un résultat positif, quelle que soit l'intensité. Des contrôles négatifs, dans lesquels l'anticorps primaire a été remplacé par 5% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans un tampon phosphate salin (PBS), ont été inclus dans toutes les séries, et des sections de tissu normal de la prostate humain ont été utilisés comme témoins positifs.

Copy Number
PHB

pour évaluer les variations du nombre de copies (CNV), la procédure qPCR a été réalisée à l'aide quantitative TaqMan CNV (Life Technologies, Etats-Unis) pour le PHB
gène (Hs00178432_cn) et pour le contrôle interne RNAse P
(Ƹ3326). Les réactions de qPCR Multiplex ont été réalisées en quadruple avec ADNg selon le protocole et le cyclisme les conditions du fabricant dans une machine en temps réel rapide 7500 PCR (Life Technologies, États-Unis). Le nombre relatif de copies de chaque échantillon a été estimée à l'aide du logiciel de copie de l'appelant V1.0 (Life Technologies, États-Unis). gDNAs commerciaux humaines (G1471 et G1521, Promega, USA) ont été utilisés pour le calibrage

PHB
génotypage

ADN à partir d'échantillons non-néoplasiques a été utilisé pour PHB.
génotypage. Les sujets ont été génotypés pour le polymorphisme de rs6917 utilisant des sondes et amorces personnalisé TaqMan SNP (Applied Biosystems, Foster City, CA). Les amorces suivantes et des sondes MGB ont été conçues pour la discrimination allélique: amorces F5'-TTGGTCCCTCTCAGATACCCA-3 'et R5'-CCGTGAGAAGGGCAGTCTCT-3'; sonde FAM marqué 5'-CTGCCAAAGACGTGT-3 '; et la sonde 5'-CTGCCAAAGATGTGT-3 'allèle mineur VIC marqué.

PHB
allèle spécifique expression Expression

allèle spécifique a été déterminée par séquençage. Vingt à 40 ng d'ADN ou d'ADNc a été utilisé comme matrice pour l'amplification par PCR avec les amorces utilisées pour PHB
génotypage. Avant le séquençage, les produits de PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 2%, et la bande spécifique a été extrait et purifié. Le séquençage a été réalisée en utilisant l'amorce sens utilisée pour l'amplification PCR et un kit BigDye Terminator Cycle Sequencing v3.1 (Applied Biosystems, USA). les produits de séquençage ont été séparés en utilisant un analyseur génétique ABI 3500 (Applied Biosystems, USA). Certains des échantillons ont été analysés au moins deux fois, y compris la RT-PCR et des analyses distinctes de séquençage.

allélique niveaux d'expression ont été déterminés en utilisant le logiciel PeakPicker [25]. Le logiciel a été utilisé pour effectuer d'abord une étape de normalisation dans laquelle la hauteur de l'allèle SNP a été comparée à la hauteur des pics de référence dans les séquences adjacentes. Nous avons limité cette étape de normalisation à l'intérieur d'une fenêtre de 21 base. Les valeurs de rapport supérieur à 1 ont été transformées en 1 /(rapport) pour transformer toutes les valeurs à l'échelle de 0 à 1, et les valeurs ont ensuite été ajustés à la moyenne des rapports d'intensité crête à partir d'un échantillon hétérozygote d'ADN de référence pour le polymorphisme rs6917. L'ADN génomique de hétérozygote (N = 3) et des échantillons homozygotes (N = 3, pour CC génotype; N = 2, pour le génotype TT) a été utilisé pour valider l'analyse et de confirmer les ratios alléliques de 50:50 et 0:100, respectivement. En outre, l'ADNc à partir d'échantillons de tissus (tumoraux et non tumoraux spécimens) des deux sujets homozygotes pour l'allèle mineur dans le polymorphisme de rs6917 ont également été utilisés comme témoins.

allèle spécifique PHB
l'expression a également été évaluée dans des échantillons hétérozygotes par RT-PCR quantitative, comme décrit précédemment [26]. En utilisant un essai de génotypage de SNP pour TaqMan personnalisée PHB
génotypage, on a généré une courbe de régression linéaire pour l'intensité de fluorescence log10 vs
le rapport log10 allélique sur la base de la dilution en série de CC- et TT- ADN génomiques génotypés à partir d'échantillons de contrôle (échantillons provenant de deux individus homozygotes) dans plusieurs rapports (CC: TT 08h01, 04h01, 02h01, 01h01, 01h02, 01h04, 01h08) par RT -qPCR (figure 1A). Le rapport allélique de l'expression génique a été extrapolé par l'interception de la log10 du FAM: intensité VIC sur la courbe standard. ROX (Colorant interne de référence) et FAM non spécifique et VIC fluorescence a été normalisée dans toutes les analyses. Toutes les réactions ont été réalisées en double

Pour les échantillons d'ADNc hétérozygotes, ratios alléliques. ≪ 0,8 ou >. 1.2 ont été considérés comme étant représentatifs de l'expression spécifique de l'allèle

Analyse statistique

pour l'analyse de l'expression de l'ARNm, nous avons d'abord évalué l'hypothèse que les données ont une distribution normale à l'aide du test de normalité de Shapiro-Wilk pour déterminer les tests appropriés pour les comparaisons statistiques ultérieures. Le Les taux d'ARNm de PHB ont pas normalement distribuées et ont été transformés (z-score) pour l'analyse. Observations > +2 ou < -2 ont été considérés comme des valeurs aberrantes et exclues des analyses. Un test t apparié a été effectuée pour comparer la moyenne expression de PHB entre les échantillons non-néoplasiques et tumorales. Le T-test pour les échantillons indépendants et une ANOVA suivie par le test post-hoc Jeux-Howell ont été utilisés pour évaluer les associations possibles entre expression PHB et les caractéristiques clinico, protéine immunoréactivité, le nombre de copies du gène et le génotype . Le test du chi carré ou le test exact de Fisher a été utilisé pour évaluer la relation entre PHB
nombre de copies et l'immunoréactivité et les facteurs clinicopathologiques. La corrélation de Pearson a été utilisé pour évaluer une corrélation possible entre le séquençage et l'analyse TaqMan pour l'analyse de l'expression spécifique d'allèle. Dans toutes les analyses, P
<. 0,05 a été considérée comme significative

Résultats

PHB
ARNm expression dans gastrique Tumeurs

expression de PHB ne différaient pas entre les échantillons gastriques non néoplasiques néoplasiques et appariés (0,173 ± 0,255 vs
0,227 ± 0,297, P
= 0,149). Cependant, les niveaux d'ARNm ont été réduites d'au moins 1,5 fois dans 20 (45,5%) des échantillons de GC et augmenté en 9 (20,5%) par rapport aux paires d'échantillons de tissus gastriques non néoplasiques.

Le tableau 1 montre les associations entre l'expression PHB et des caractéristiques clinico-pathologiques, ainsi que le nombre de protéines immunoréactivité rs6917 génotype et copie du gène. tumeurs mal différenciées ont présenté des réduits expression de PHB par rapport aux tumeurs modérément différenciés ( P
= 0,029; tableau 1). Toutefois, les deux GC peu différencié (0,025 ± 0,022 vs
0,239 ± 0,303; P
< 0,001, ANOVA suivie par le test post-hoc Jeux-Howell) et modérément différencié GC (0,057 ± 0,051 vs
0,239 ± 0,303; P
< 0,001, ANOVA suivie par les Jeux-Howell test post-hoc) a présenté réduite expression de PHB par rapport aux non des échantillons de tissus gastriques néoplasiques

Réduction l'expression de PHB a été associée à une invasion plus faible ( P
= 0,002; Tableau 1). et une absence de métastase ganglionnaire ( P = 0,040
; Tableau 1). En outre, GC précoce présenté réduite expression de PHB par rapport à GC avancé ( P
= 0,002; tableau 1). En outre, seulement au début GC présenté une réduction significative de la PHB
niveaux d'ARNm par rapport aux échantillons non néoplasiques (0,044 ± 0,027 vs
0,239 ± 0,303, P
< 0,001, ANOVA suivi du test post-hoc Jeux-Howell).

PHB immunoréactivité dans gastrique tumeurs

Protein immunocoloration a été observée dans tous les échantillons de tumeur évalués par IHC (tableau 2). Dans tous les cas, le PHB immunoréactivité a été détectée dans des cellules néoplasiques et non-néoplasiques, y compris la métaplasie intestinale et des cellules inflammatoires (figure 2A-H). PHB était principalement exprimé dans le cytoplasme. L'intensité de la coloration et le pourcentage de cellules immunoréactives variaient parmi les cas étudiés (tableau 2). Les échantillons présentant <. 80% des cellules tumorales avec PHB immunoréactivité a montré réduit l'expression d'ARNm ( P
= 0,036, tableau 1)

Copie Nombre de PHB dans gastrique Tumeurs

PHB
a été amplifié dans 13 des 38 (34,2%) des tumeurs, y compris 2 échantillons avec 4 copies. Aucune tumeur a présenté un PHB
suppression. Fait intéressant, 3 échantillons qui présentaient des valeurs aberrantes pour PHB
expression de l'ARNm a également présenté une amplification génique. Par conséquent, lorsque les valeurs aberrantes ont été inclus dans l'analyse, L'expression PHB était plus élevé dans les échantillons avec l'amplification du gène que chez ceux sans amplification génique (médiane ± intervalle interquartile: 0,344 ± 0,335 vs
0,047 ± 0,07; P
= 0,003, test non paramétrique de Mann-Whitney; Figure 3). gain de PHB a été associée à GC apparition tardive par rapport GC apparition précoce ( P
= 0,022; tableau 2). Aucune association entre PHB
nombre de copies et de protéines immunoréactivité ou d'autres caractéristiques clinico a été trouvé (tableau 3).

PHB
Expression allèle spécifique

nous avons également cherché à savoir si la présence de l'allèle minoritaire dans rs6917 est associée à la dérégulation de l'expression génique chez les patients atteints de GC. Dans notre échantillon, 11 des 48 patients (22,9%) étaient hétérozygotes et 2 patients (4,17%) étaient homozygotes pour l'allèle mineur dans le polymorphisme rs6917. Tous les échantillons avec l'allèle T a présenté 2 copies de la gène PHB
. La présence de l'allèle T du polymorphisme est associé à rs6917 réduit L'expression PHB CG ( P
< 0,001; Tableau 1, figure 1B) et dans des échantillons non néoplasiques (moyenne ± SD:. 0,302 ± 0,325 vs
0,045 ± 0,043; P
< 0,001; Figure 1B)

Une paire d'échantillons hétérozygotes (tumeur et non-tumorale) n'a pas été utilisé pour l'analyse de l'expression spécifique d'allèle. Une corrélation entre le rapport allélique du polymorphisme rs6917 déterminée par le séquençage et l'analyse TaqMan a été détectée ( P
= 0,003; r = 0,627). Par séquençage, environ 50% des cas présenté l'expression allélique différentielle (figure 1C). Cependant, le test TaqMan a montré que les allèles T et C ont présenté l'expression différentielle allélique dans la plupart des patients (figure 1D). Le degré de différence dans l'expression entre les deux allèles varient selon les individus. Le rapport T à C expression allélique était similaire dans la plupart des paires d'échantillons de tumeur et non tumorales. Un seul patient a présenté un plus haut rapport C /T à la fois la tumeur et les échantillons non néoplasiques dans les deux essais. Dans la plupart des cas, un ratio inférieur C /T a été détectée indépendamment de la méthodologie appliquée (figures 1C et 1D). Aucune association entre l'expression allélique différentielle et l'âge d'apparition ou toute autre variable clinicopathologique a été détectée.

Discussion

PHB semble être essentiel dans l'homéostasie cellulaire. Des études récentes ont suggéré que le PHB peut agir comme un facteur pro-tumorigène et anti-tumorigène dans plusieurs types de cellules (voir la revue [10]). Dans la présente étude, les profils d'expression de protéines et d'ARNm de PHB présenté un modèle hétérogène entre les échantillons de tumeurs. Bien que nous ne trouvons une différence significative entre les GC et les échantillons non appariés néoplasiques, nous avons observé que le taux d'ARNm a été réduit de 1,5 fois à 45,5% des échantillons de GC et a augmenté dans 20,5% des tumeurs. L'expression de l'ARNm réduite est due en partie à une fréquence réduite des cellules tumorales présentant PHB immunoréactivité, qui met en évidence l'hétérogénéité des clones de cellules tumorales.

Liu et al. [21] ont décrit l'expression d'ARNm réduite dans quatre tumeurs gastriques par rapport à leurs tissus normaux correspondants, ce qui corrobore en partie nos résultats. Soutenir un rôle anti-tumorigène, PHB bloque l'entrée en phase S [27]. En outre, les rs6917 de type sauvage PHB
3'UTR seul est capable d'inhiber la progression du cycle cellulaire [11], [28] et la croissance tumorale [12] ainsi que de réduire la mobilité cellulaire [29]. En outre, le PHB joue un rôle dans le maintien de la fonction mitochondriale et de la morphologie normale [30]. Il a été suggéré que la perte d'expression du PHB mitochondrial (localisation cytoplasmique, comme on l'observe dans nos échantillons) pourrait conduire à une protéolyse accélérée des protéines de la membrane et la fonction de la chaîne respiratoire mitochondriale [10] nuire. Notre étude protéomique précédente a montré que plusieurs protéines impliquées dans les voies du métabolisme énergétique (dysfonction mitochondriale, le métabolisme du pyruvate, la phosphorylation oxydative, cercle citrate, glycolyse /néoglucogenèse) ont été déréglementés [31] et a suggéré que les fonctions mitochondriales importants peuvent être modifiés, déplacement de la production d'énergie dans GC cellules et suggérant l'effet Warburg [32].

à notre connaissance, peu d'études ont évalué l'association possible entre PHB
niveaux d'ARNm et le polymorphisme rs6917. Dans une étude, Tang et al. n'a pas observé une association significative entre le polymorphisme de rs6917 et d'expression de l'ARNm dans des lignées cellulaires lymphoblastoïdes inclus dans la base de données HapMap [33]. Cependant, ces auteurs ont rapporté que l'allèle T a été associée à un risque accru de cancer du sein. Dans la présente étude, nous avons démontré que la présence de l'allèle T du polymorphisme de rs6917 était associée à une réduction de expression de PHB dans les cellules gastriques non néoplasiques et néoplasiques. Polymorphisme rs6917 est situé dans la région 3'UTR et est présent seulement dans isoforme 1 de PHB, qui a été détectée dans la présente étude par séquençage de l'ADNc et une analyse TaqMan. La 3'UTR contient plusieurs cis
- et -elements trans, et ces structures ont une large influence sur la traduction de l'ARNm, la stabilité et la localisation subcellulaire [34], [35], [36 ]. La variante T crée un site de liaison potentiel pour les microARN a-miR-1292 et a-886-5p (http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi-bin/snpinfo/mirna.cgi?2_rs6917), qui peut modifier l'expression du gène soit par la dégradation des ARNm ou la traduction. D'autres microARN ont déjà été associés à la régulation de la PHB
expression dans GC. Liu et al. [21] ont rapporté que PHB
est réglementée par miR-27a, qui est souvent régulé à la hausse dans la GC. Les auteurs suggèrent que la régulation négative de PHB
par ce microARN peut expliquer pourquoi la suppression de miR-27a peut inhiber la croissance des cellules GC. En outre, le 3'UTR de PHB
code pour un ARN antisens (Gene ENSG00000250186; HAVANA http://www.sanger.ac.uk/). La présence de l'allèle rare dans l'ARN anti-sens peut modifier la structure secondaire et diminuer la kcal /mol par rapport à la séquence en utilisant l'échelle de type CLC RNA Workbench 4.0 du logiciel (données non présentées). Par conséquent, le polymorphisme rs6917 peut conduire à PHB
régulation à la baisse par la création de nouveaux sites cibles de microARN ou par le biais de sa régulation par l'ARN antisens dans les cellules gastriques, contribuant ainsi à la carcinogenèse gastrique.

Dans notre les échantillons, la plupart des patients ont présenté des hétérozygotes augmentation de l'expression de l'allèle T par rapport à l'allèle C. La différence dans les niveaux d'ARNm relatifs des deux allèles pourrait être le résultat de différences dans la transcription ou la stabilité de l'ARNm, et ils montrent que ce polymorphisme présente un cis
effet dans les cellules gastriques. À notre connaissance, cette étude est la première à évaluer le PHB différentiel expression spécifique d'allèle dans des échantillons de tumeurs. Des études antérieures ont démontré qu'une la variante de PHB avec l'allèle T en position 1630 dans la région 3'UTR manque de capacités de suppression de la croissance antiprolifératifs et tumorales in vitro et dans des modèles animaux [29]. Par conséquent, la présence de l'allèle T, en particulier quand il présente élevée expression par rapport à l'allèle C, peut induire un effet «éponge» pour les régulateurs post-transcriptionnel tels que miARN et de contribuer à la prolifération des cellules gastriques, prédisposant les individus hétérozygotes à GC.

l'effet possible de PHB
régulation à la baisse - en raison du polymorphisme de rs6917, par exemple - sur le risque de GC est en accord avec les associations entre réduites PHB
ARNm et inférieure l'invasion, l'absence de métastases des ganglions lymphatiques et GC stade précoce. À notre connaissance, aucune étude antérieure dans la littérature a évalué l'association possible entre l'expression et GC de PHB facteurs pronostiques. Ces résultats suggèrent que PHB
régulation vers le bas peut être nécessaire pour l'initiation de la tumeur.

Cependant, les études protéomiques précédentes ont rapporté surexpression de PHB dans les tumeurs gastriques [15], [16], [17] . En outre, Kang et al. [18] ont rapporté la surexpression de la protéine de PHB et de l'ARNm en GC (par rapport à des tissus gastriques normaux adjacents) chez les personnes asiatiques. Dans notre échantillon, 20,5% des tumeurs ont également présenté augmenté PHB
expression. PHB semble jouer un rôle dans la prolifération cellulaire, l'adhérence et de la migration et, par conséquent, dans la progression de la transformation maligne par RAS-RAF de signalisation [37]. Nous émettons l'hypothèse que l'augmentation de PHB
niveau de l'ARNm est nécessaire pour la progression de la GC. L'évaluation des échantillons humains ne permet que l'enquête sur un seul point du temps (au moment de la réparation chirurgicale); ainsi, nous sommes incapables d'évaluer la régulation dynamique de l'expression génique. Cependant, L'expression de PHB est très probablement liée au contexte cellulaire et le fond moléculaire des cellules gastriques.

Kang et al. [18] ont rapporté que la protéine de PHB et de l'expression de l'ARNm diffèrent entre modérément et mal GC différenciée et que les tumeurs que faiblement différenciées présente PHB surexpression par rapport aux échantillons non néoplasiques. Dans notre exemple, ces tumeurs ont été classées en fonction du degré de différenciation. Cependant, nous avons observé que les deux tumeurs peu et moyennement différenciées ont présenté des réduits expression de PHB par rapport aux échantillons non-néoplasiques et que les les niveaux d'ARNm
PHB étaient plus faibles dans les tumeurs peu différenciées. Par conséquent, dans nos échantillons, expression de PHB semble diminuer avec dédifférenciation tumorale. D'autres recherches sont nécessaires pour une meilleure compréhension du rôle de PHB dans le processus de différenciation dans les cellules gastriques normales et néoplasiques.

Dans cette étude, nous avons constaté que 34,2% des tumeurs a gagné des copies de PHB
. Des altérations dans le chromosome 17 ont été associés à la progression tumorale et un potentiel malin GC primaire [38], [39]. À notre connaissance, cette étude est la première à utiliser une technique précise et robuste pour évaluer la PHB
nombre de copies dans des échantillons de GC. Nous avons observé une association entre PHB
copier les niveaux d'ARNm nombre et, révélant un effet de cis-dose de CNV sur les niveaux d'expression des gènes. Par conséquent, nos résultats suggèrent que la CNV est un élément important dans la conduite en aval PHB
transcription dans certaines tumeurs gastriques. Ce mécanisme génétique, principalement observé dans GC apparition tardive, peut contribuer pour le rôle PHB
comme oncogène. Cette constatation mettent également en évidence que plusieurs mécanismes peuvent conduire à PHB
déréglementation dans les cellules du GC.

L'augmentation de la PHB
nombre de copies a été associée à GC d'apparition tardive. différences clinicopathologiques entre l'apparition précoce et GC apparition tardive ont été décrits [40], [41], [42], mais on sait peu sur les changements génétiques associés à l'âge de début de la GC [2]. Buffart et al. [43] précédemment démontré que les jeunes et les anciens patients appartiennent à des groupes ayant des profils génomiques. L'amplification de la PHB
locus met en évidence l'hétérogénéité des GC.

La principale limite de cette étude est sa taille relativement petite de l'échantillon. Par conséquent, une analyse statistique a présenté réduit la puissance pour détecter des différences significatives entre les groupes probablement en raison de la grande hétérogénéité entre les échantillons. Par conséquent, les résultats faussement négatifs ont pu se produire. D'autres évaluations sont encore nécessaires pour évaluer le rôle de PHB
dans la carcinogenèse gastrique et sa régulation transcriptionnelle.

En conclusion, à la fois la régulation à la baisse et la régulation de PHB
peut être observé en GC. La réduction de la L'expression de PHB semble être impliqué dans le processus de dédifférenciation de la tumeur et l'initiation du cancer. L'allèle T dans le PHB
rs6917 polymorphisme peut contribuer à la réduction observée dans les niveaux d'ARNm
PHB et donc contribuer au risque de GC. Cependant, PHB
régulation à la hausse semble être régulée par le nombre de copies du gène. L'expression différentielle du polymorphisme rs6917 dans des échantillons gastriques a été signalé pour la première fois, et cette variation peut jouer un rôle dans la régulation de PHB
expression. La fonction pléiotropique de PHB
met en évidence la nécessité de nouvelles enquêtes en GC, car son activité dans les cellules gastriques est susceptible d'être strictement réglementé afin d'éviter des conséquences négatives possibles de diminution ou augmentation de l'expression.

Remerciements

les auteurs sont reconnaissants à Sueli Nonogaki de Adolfo Lutz (São Paulo, SP, Brésil) pour le soutien technique dans les analyses immunohistochimie.

• PLOS ONE: MUC5AC amont complexes Région Répétitive Longueur polymorphismes sont associés à Susceptibilité et Stade clinique de Cancer
• PLOS ONE: Normale Fibroblastes induire une perte E-cadhérine et l'augmentation des ganglions lymphatiques métastatiques gastrique Cancer