PLoS ONE: Integration von DNA-Kopienzahl Änderungen und Transkriptions-Expressionsanalyse in menschlichen Magen Cancer

Abstrakt

Hintergrund

Genomische Instabilität mit häufigen Kopienzahl Veränderungen DNA ist eines der wichtigsten Kennzeichen der Karzinogenese . Die chromosomalen Regionen mit häufigen DNA-Kopienzahl Gewinn und Verlust in der menschlichen Magenkrebs sind immer noch schlecht definiert. Es bleibt unklar, wie die DNA-Kopienzahl Variationen auf die Veränderungen von Genexpressionsprofilen beiträgt, vor allem auf globaler Ebene.

Wichtigste Ergebnisse

Wir analysierten Anzahl DNA-Kopie Veränderungen in 64 menschlichen Magenkrebsproben und 8 Magenkrebszelllinien Bacterial Artificial Chromosome (BAC) Arrays basieren vergleichende genomische Hybridisierung (aCGH) verwendet wird. Die statistische Analyse wurde bisher veröffentlichten Genexpressionsdaten aus cDNA-Microarrays mit entsprechenden DNA-Kopienzahl-Änderungsdaten erhalten zu korrelieren angewendet Kandidaten Onkogenen und Tumorsuppressor-Gene zu identifizieren. Wir fanden heraus, dass Magenkrebs Proben rezidivierenden DNA-Kopienzahl Variationen zeigten, einschließlich der Gewinne bei 5p, 8Q, 20p, 20q und Verluste bei 4Q, 9p, 18q, 21q. Die häufigsten Regionen der Amplifikation waren 20q12 (7/72), 20q12-20q13.1 (12/72), 20q13.1-20q13.2 (11/72) und 20q13.2-20q13.3 (6/72) . Die häufigste gelöscht Region war 9p21 (8/72). Korrelieren von Genexpressions Array-Daten mit aCGH identifizierten 321 Kandidaten Onkogene, die überexprimiert waren und zeigten häufige Zahl gewinnt DNA-Kopie; und 12 Kandidaten Tumorsuppressor-Gene, die wurden herunterreguliert und zeigte häufig DNA-Kopienzahl Verluste in menschlichen Magenkrebs. Drei Netzwerke von deutlich exprimierten Genen bei Magenkrebs Proben wurden durch Einfallsreichtum Pfadanalyse identifiziert.

Schlussfolgerungen

Diese Studie gibt einen Einblick in die DNA-Kopienzahl Variationen und ihren Beitrag zu einer veränderten Genexpressionsprofile während der menschlichen Magen Entwicklung von Krebs. Es neuartige Kandidaten Treiber Onkogene oder Tumor-Suppressor-Gene, die für die menschliche Magenkrebs, nützliche Weg Karten für die Zukunft Verständnis der molekularen Pathogenese dieser Bösartigkeit bietet, und den Bau neuer therapeutischer Targets

Citation:. Fan B, Dachrut S, Coral H, Yuen ST, Chu KM, Law S, et al. (2012) Integration von DNA-Kopienzahl Änderungen und Transkriptions-Expressionsanalyse in der menschlichen Magenkrebs. PLoS ONE 7 (4): e29824. doi: 10.1371 /journal.pone.0029824

Herausgeber: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, Frankreich

Empfangen: 19. September 2011; Akzeptiert: 3. Dezember 2011; Veröffentlicht: 23. April 2012

Copyright: © 2012 Fan et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wird von der Finanzierung durch University of California Cancer Research Koordinatenausschuss XC unterstützt. BF wird durch China Scholarship Council Vertrag No.2010601079 unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist eine der häufigsten bösartigen Tumoren und die zweithäufigste Ursache von Krebs Todesfälle weltweit [1]. Der Haupttyp von Magenkrebs ist Adenokarzinom, die weiter in intestinalen Typ und diffusen Typ kategorisiert werden können [2]. Darm-Typ Läsionen sind häufig Colitis und im distalen Magen auftreten. Diffuse-Typ Läsionen werden mit einer schlechteren Prognose als die Darmtyp zugeordnet. Die chirurgische Behandlung ist die einzige therapeutische Modalität, die eine potenziell kurative Wirkung auf Magenkrebs hat. Die Prognose von Magenkrebs-Patienten hängt stark von der klinischen und pathologischen Stadium der Krankheit bei der Diagnose. Die 5-Jahres-Überlebensrate nach kurativer chirurgischer Resektion Rückgang von 60 bis 90% im Stadium I nur 10-25% für Patienten im Stadium III der Krankheit [3]. Die meisten Patienten mit Magenkrebs sind im fortgeschrittenen Stadium identifiziert, die auf die düstere Prognose führt.

Genetische Veränderungen sind wichtige Ereignisse in der Entwicklung der meisten Tumoren, einschließlich Magenkrebs [4]. Studien deuten darauf hin, dass Tumorprogression auf dem sukzessiven Erwerb von Chromosomenaberrationen abhängig zu Gewinnen oder Verlusten eines Teils der Tumorzellgenom führt. Daher kann die Charakterisierung der genomischen Anomalien helfen, die molekularen Pathogenese von Magenkrebs sowie offenbaren die genetischen Marker der Progression aufzuklären. Array-basierte komparative genomische Hybridisierung (aCGH) ist eine leistungsfähige Methode verwendet, um pathogene DNA-Kopienzahl Veränderungen auf einer genomweiten Skala [5] zu identifizieren. aCGH wurde zu einer Reihe von festen Tumoren angewandt, einschließlich Magenkrebs [6], [7]. Es wurde in der Identifizierung neuer Onkogene und Tumorsuppressorgene, und zu klassifizieren Tumoren anhand von genetischen Veränderungen.

Expression Profilierungs Experimenten identifizierten eine große Anzahl von Genen als nützlich erwiesen, die in normalen und Tumor differentiell exprimiert werden Gewebe. Die meisten dieser Gene sind jedoch wahrscheinlich Passagier-Gene zu sein, die Beitrag zur tumorigenesis begrenzt haben. Die größte Herausforderung war Fahrer Onkogenen oder Tumorsuppressor-Gene zu identifizieren, die eine wichtige Rolle bei der Tumor Initiierung und Progression, Genomic DNA Kopienzahl Variation spielen eine wichtige Art der genetischen Veränderung in Tumorzellen beobachtet, und es trägt zur Tumorentwicklung durch Veränderungen der Expression von Genen innerhalb der Region [8]. DNA-Kopienzahl Gewinne und Verluste sind nicht zufällig, sondern konsequent genetische Ereignisse während der Karzinogenese repräsentieren. Identifizierung von Genen, die sowohl überexprimiert und verstärkt oder unterdrückten und gelöscht werden kann von Vorteil sein, da diese Gene Treiber genetische Veränderungen darstellen.

Frühere Studien DNA-Kopienzahl Änderungen oder Expressionsprofile in Magenkrebs Proben berichtet . Die Studien haben auch gemeinsame Chromosom Gewinne und Verluste, sowie Hunderte von Genen identifiziert, die Tumoren von normalen Geweben [6], [9] unterscheiden kann. Allerdings haben nur wenige Studien die Assoziation zwischen DNA-Kopienzahl Variationen und Transkriptions-Expressionsprofile untersucht. In diesem Manuskript, führten wir aCGH Analyse in einer großen Anzahl von menschlichen Magenkrebsproben. Darüber hinaus wurde eine integrierte Analyse der DNA-Kopienzahl Variationen und entsprechenden Genexpressionswerte durchgeführt signifikante Gene zu identifizieren, die zu Magenkrebs Pathophysiologie beitragen können. Insgesamt 321 Kandidaten Onkogene und 12 Kandidaten Tumorsuppressor-Gene wurden durch die Analyse identifiziert.

Materialien und Methoden

Ethic Statement

Die Verwendung von Archiv Magen-Probe für die aktuelle Studie wurde von der Ethikkommission der Universität von Hong Kong und die internen Review Boards der University of California, San Francisco genehmigt.

Tumorproben, Zelllinien und DNA, RNA Präparation

Tumorproben wurden aus gastrectomy Proben aus der Abteilung für Chirurgie, Queen Mary Hospital, der University of Hong Kong gesammelt. Acht Magenkrebszelllinien AGS, BGC823, N87, NUGC3, SNU16, SNU5, KatoIII und MNK45 wurden in unseren früheren Veröffentlichungen beschrieben [10]. Genomische DNA wurde mit der Genomic DNA Purification Kit extrahiert (Qiagen, Valencia, CA).

Die klinisch-pathologischen Parametern der Tumoren früher veröffentlicht wurden [11]. Die Tumore wurden unter Verwendung von Lauren-Klassifikation der intestinalen klassifiziert, diffus, gemischt und unbestimmten Typen [2]. Die Anwesenheit von H. pylori in der Gastrektomie Proben wurde durch histologische Untersuchung bestimmt und durch modifizierte Giemsa-Färbung ergänzt. Die Anwesenheit von EBV in Krebszellen wurde durch EBER für in situ-Hybridisierung untersucht, wie zuvor beschrieben [12]. Die Tumorstadien von den allgemeinen Regeln für Magenkrebs-Studie der japanischen Forschungsgesellschaft für Magenkrebs [13] definiert wurden.

Array-basierte CGH

Menschliche 1.14 Arrays wurden von der UCSF Krebs erhalten -Center Array Core (http://cc.ucsf.edu/microarray/). Sie bestanden aus 2.353 künstlichen bakteriellen Chromosom (BAC) Klone, die das menschliche Genom mit 1,5 Mb Auflösung abgedeckt. Zur Hybridisierung wurde 1 ug von Tumor DNA und 1 ug gender angepaßten Referenz DNA wurde durch Random-Priming unter Verwendung von Cy3-dCTP und Cy5-dCTP, jeweils mit dem BioPrime Kit (Invitrogen) markiert. Nicht eingebaute fluoreszierende Nucleotide wurden unter Verwendung einer Sephadex G-50-Säule (Amersham, Piscataway, NJ) entfernt. Probe und Referenz-DNA wurden mit 100 ug Cot-1 vermischt, gefällt und in Hybridisierungslösung suspendiert. Die Hybridisierungslösung wurde bei 72 ° C für 10 min denaturiert und dann für 1 h bei 37 ° C inkubiert. Die Hybridisierung wurde auf einem langsamen Schüttler in einer feuchten Kammer für 48-72 Stunden durchgeführt. Arrays wurden für 10 min in 50% Formamid und 2 × SSC bei 45 ° C und 10 min in Phosphatpuffer bei Raumtemperatur gewaschen. Die Objektträger wurden in Montagelösungen montiert, die 0,3 ug /ml DAPI. Drei einfarbige Intensitätsbilder (DAPI, Cy3 und Cy5) wurden für jedes Array gesammelt, um eine Charge Coupled Device-Kamera.

Array-basierte CGH Datenanalyse

Die UCSF SPOT Software [14] verschiedene Messparameter einschließlich log2-Verhältnisse der gesamten integrierten Cy3 und Cy5 Intensitäten für jeden Punkt, um automatisch Segment die Basis Flecken auf den DAPI Bilder verwendet wurde, führen Sie lokale Hintergrund Korrekturen und berechnen. Die Rohdaten des aCGH sind bei GEO (Zugangsnummer: GSE33501) zur Verfügung.

Programm SPROC wurde verwendet, mit jedem Spot Klon Identitäten und eine Mapping-Informationsdatei zu verknüpfen, so dass die Daten von relativ zur Position aufgetragen werden konnte BACS. Chromosomenaberrationen wurden als Gewinn eingestuft, wenn die normierte log2 Cy3 /Cy5-Verhältnis betrug > 0,225 und als Verlust, wenn das Verhältnis war < -0,225. Die Zahl wurde bestimmt, wie die durchschnittliche SD von normalen gegenüber normalen aCGH Hybridisierung 3-fach. Amplifikationen wurden identifiziert, wenn die normierte log2 Cy3 /Cy5-Verhältnis betrug > 0,8. In ähnlicher Weise wurden homozygote Deletionen identifiziert, wenn die normierte log2 Cy3 /Cy5-Verhältnis betrug < -0.7. Mehrere Gewinne, Verluste und Amplifikationen wurden als separate Ereignisse gezählt. Die Schwelle von Gewinn oder Verlust eines ganzen Chromosoms Arm wurde als Median log2 Verhältnis definiert von > 0,225 oder <. -0,225 Für alle Klone auf dem Chromosom Arm

Statistische Datenanalyse

die Proben wurden auf der Basis der experimentellen Ergebnisse kategorisiert und mit den klinischen Daten (Tabelle S1) unter Verwendung von signifikanten Analyse von Mikroarrays (SAM) Analyse [15]. DNA-Kopienzahl Veränderungen einschließlich mittlere Prozentsatz von Gewinn und Verlust. Häufige Verstärkung und Löschung wurden unter Verwendung von CGH-Explorer 3.2 (http://www.ifi.uio.no/forskning/grupper/bioinf/Papers/CGH/) analysiert. "Analyse der Copy-Fehler" (ACE) wurde unter Verwendung einer falschen Entdeckung Rate (FDR) von 0,0001 und mittlerer Empfindlichkeit durchgeführt. Clustering aller Proben wurde in TreeView Version 1.60 durchgeführt.

R /Bioconductor Software, einschließlich der CBS-Programm wurde verwendet, um die Korrelation zwischen der Kopienzahl ändern und die Genexpression zu berechnen. Die Expressionsdaten der 6688-cDNA-Klone in der vorherigen Genexpressionsanalyse verwendet [11], [16] (GEO-Zugangsnummer: GSE2701) wurde wiedergewonnen. Mapping Position für diese cDNA-Klone wurden die NCBI Genomassemblierung einzusetzendes, durch das Genom Browser-Datenbank UCSC zugegriffen (NCBI bauen 35). Die aCGH Daten wurden segmentiert, wie in der DNA-Kopie-Paket implementiert Kreis binäre Segmentierung (CBS) R /Bioconductor experimentellen Intensitätsmessungen in Bereiche gleicher Kopienzahlen zu übersetzen. Fehlende Werte für Klone Mapping innerhalb segmentierten Bereiche gleicher Kopienzahlen wurden mit dem Wert des entsprechenden Segment zugerechnet. Die Genexpressions Klone wurden innerhalb von 1 Mb der Genexpression Klon mit dem BAC-Klon zugeordnet, die die höchste Pearson Korrelation zwischen der Kopienzahl und die Genexpression hat. "Geglättete" Werte von CBS mit dem ursprünglich beobachteten log2-Verhältnis für die Ausreißer Klone oben beschrieben, und die kalkulatorische Werte für fehlende Werte wurden zur Berechnung der Korrelation mit der Genexpression betrachtet. Korrelation nur Klone berechnet, und ein Korrelationskoeffizient von 0,29 wurde als der cut-off verwendet, um Klone zu identifizieren, die positive Korrelation zwischen der Kopienzahl und der Genexpression. p
-Werten für die Genexpression und Nummer des Exemplars Korrelationen basierend auf Permutation erhalten wurden. Die Etiketten von Expressionsdaten wurden zufällig gemischt und die Pearson-Korrelation zwischen Genexpression Klone und Kopienzahl BAC-Klone wurden wie zuvor beschrieben berechnet. Dies wurde 1000 mal wiederholt. Für jedes Gen Expressionsklon wurde der p-Wert als der Anteil der Zeiten der basierend Korrelations Permutation war größer als die oder gleich der beobachteten Korrelation bestimmt. Die p
-Werten wurden dann für mehrere Prüfungen korrigiert, indem die Steuerung für die falschen Rate entdecken (FDR) mit dem Benjamini-Hochberg-Methode [17].

Funktionelle Analyse der wesentlichen Gene wurde durchgeführt, mit Ingenuity Pathway-Software (Ingenuity Systems, Redwood City, CA).

Ergebnisse |

Array-basierte CGH Analyse der menschlichen Magenkrebs

Um DNA-Kopienzahl Veränderungen im Magen-Identifizierung Krebs, wandten wir BAC aCGH zu 64 menschlichen Magenkrebsgewebeproben und 8 Magenkrebs-Zelllinien. Die Rohdaten sind in Tabelle S2 zur Verfügung. Wir beobachteten rezidivierenden chromosomalen Veränderungen in diesen Proben und Regionen mit einer signifikanten DNA-Kopienzahl Änderungen identifiziert wurden. Die resultierende Frequenzdarstellung und Verirrung Plot der Gewinne und Verluste sind in 1A und 1B gezeigt. Zwei repräsentative genomweite Verhältnis Plots für einzelne Magentumor sind in Abbildung S1 gezeigt. Die am häufigsten verwendeten DNA-Kopienzahl Variationen in diesem Satz von menschlichen Magentumoren, wie durch die mittlere Prozentsatz von Gewinn oder Verlust bestimmt wurden Gewinne von 5p, 8Q, 20p, 20q und Verluste von 4Q, 9p, 18q, 21q.

als nächstes analysierten wir Kopienzahl Variationen DNA bei Magenkrebs Proben mit unterschiedlichen klinisch-pathologischen Merkmale einschließlich Tumorstadium, Tumortyp, Tumorstelle, Tumor-Differenzierung, Helicobacter pylori und EBV-Infektion, sowie den Unterschied zwischen Magentumorproben und Zell Linien (Abbildung S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8 und Tabelle S3). Wir haben spezifische Chromosomenaberrationen in bestimmten klinisch-pathologischen Merkmale angereichert. Zum Beispiel, Verlust von 19p mehr wurde häufig in der Stufe 1 &beobachtet; Stufe 2 Tumoren (20%) als in der Stufe 3 & Stufe 4 Proben (3,41%) (Tabelle S3). 16p Verlust wurde in 10% der Helicobacter pylori negativen Proben im Vergleich zu 0% in den Helicobacter-positiven Proben identifiziert, während 16p Verstärkung in 14,71% der Helicobacter pylori-positiven Proben beobachtet wurde, aber nur in 3,33% der Helicobacter negativen Proben (Tabelle S3 ). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, den möglichen Beitrag von Genen in bestimmten Regionen auf bestimmte Tumorphänotypen.

High-Level-Amplifikationen und homozygote Deletionen sind in Tabelle S4 zusammengefasst. 20q12 (7/72), 20q12-20q13.1 (12/72), 20q13.1-20q13: Die häufigste Verstärkung am langen Arm von Chromosom 20. In diesem Bereich sind vier getrennte Brenn Amplikons identifiziere konnte gefunden wurde. 2 (11/72) und 20q13.2-20q13.3 (6/72). Die zweithäufigste Verstärkung, in dem langen Arm von Chromosom 8 auftritt, hatte auch vier separate Brenn Amplikons: 8q23.1 (3/72), 8q24.1 (7/72), 8q24.12-8q24.2 (6 /72) und 8q24.2 (6/72). Die häufigste homozygote Deletion Region wurde bei 9p21 (8/72) und bei 18q22 (6/72) gefunden. Andere High-Level-Amplifikationen und homozygote Deletionen traten bei relativ niedrigen Frequenzen. Beispiele für häufige Aberrationen sind in Abbildung 2 Einige gut charakterisierten Onkogenen (zB HER2, TOP2A, CyclinE, TGFB1, AKT2, MYC
) und Tumor-Suppressor-Gene gezeigt (zB P16, SMAD4, SMAD7
) gefunden in dieser Loci befinden. Interessanterweise wurden in den Zelllinien identifiziert eine höhere Anzahl von Amplifikationen und homozygote Deletionen als in den primären Magenkrebs Tumorproben.

Beitrag von genomischer DNA Copy Number Variation zur globalen Veränderungen der Genexpression in menschlichen Magenkrebsproben

in unserer früheren Studie berichteten wir über die Genexpressionsprofil in 90 Einzelproben Magenkrebs im Vergleich zu ihren 14 metastasierendem Pendants und 22 nicht-neoplastische Magenschleimhäuten, mit 6688-cDNA-Klone signifikante Unterschiede zwischen diesen Proben [11] zeigt, [ ,,,0],16]. Unter den 90 Magenkrebsproben, 62 Proben wurden in der aktuellen aCGH Studie eingeschlossen. Um herauszufinden, ob Kopienzahl genomischer DNA Variationen zur globalen Genexpressionsmuster Veränderungen beitragen, um zu bestimmen, haben wir festgestellt, die die Korrelation zwischen Genexpression Werte und die entsprechende Anzahl DNA-Kopie ändert sich in diesen 62 menschlichen Magenkrebs Proben auf einem Gen für Gen-Basis. Von den 6688 cDNA in den ursprünglichen Expressionsstudien, 5719 cDNA-Klone mit Positionsinformationen wurden für diese Analyse abgerufen werden. Von diesen 5719-cDNA-Klone, 1352 cDNA-Klone (23,6% der gesamten cDNA-Klone analysiert), was etwa 973 einzigartige Gene zeigte statistisch signifikante Korrelation zwischen Expressionswerte und Anzahl Variationen DNA-Kopie (Korrelation > 0,29 und eingestellt p-Wert von weniger als 0,01 mit FDR weniger als 3,4%. Siehe Tabelle S5 für die Liste von Genen). Zur Veranschaulichung, ob DNA-Kopienzahlen Einfluss Genexpression verglichen wir die paarweise Korrelation von Genexpressionsdaten mit entweder aCGH Werte von BAC-Klone nahe dem Ort, an dem jedes Gen an (diagonal) befindet, oder aCGH Werte von BAC-Klone in anderen gelegen Regionen des Genoms. Wir fanden Paare von Regionen entlang der Diagonalen haben höhere positive Korrelation (Median Korrelation ~0.12) als die nicht-diagonalen Paare (Median Korrelation ~0.0) (Abbildung S9A). Eine Heatmap der paarweise Korrelation zwischen Genexpression und Nummer des Exemplars zeigt auch die positive Korrelation entlang der Diagonalen (Abbildung S9B).

Insgesamt sind unsere Daten bestätigen, dass genomische DNA-Kopienzahl Variationen der Regulation der regionalen Genexpression beitragen Profile in menschlichen Magenkrebsproben.

Identifizierung von Kandidaten Oncogene oder Tumor-Suppressor-Gene für menschliche Magenkarzinome

um Kandidat Onkogene oder Tumor-Suppressor-Gene identifizieren, wir zwei Kriterien in die Liste der 1352 cDNA angewendet Klone, die statistisch signifikante Korrelation zwischen Genexpression und entsprechende DNA-Kopienzahl Veränderungen zeigten. Zuerst suchten wir nach Genen, die 5 zeigten mehr Gewinne als Verluste oder 5 mehr Verluste als Gewinne bei Magenkrebs Proben. Als nächstes abgestimmt wir das Gen Liste mit den 3329-cDNA-Klone, die zwischen Nicht-Tumor-Magen-Gewebe und menschlichen Magenkrebsproben [11] unterschiedlich exprimiert werden, wurden identifiziert. Somit verengt wir unsere Liste auf 363 Klone, was 333 einzigartige Gene (Tabelle S6). Unter diesen Genen wurden 321 Gene hochreguliert bei Magenkrebs Proben und wurden häufig gewonnen oder in der genomischen DNA-Ebene verstärkt. Die restlichen 12 Gene wurden herunterreguliert bei Magenkrebs Proben und wurden häufig in der genomischen DNA-Ebene gelöscht. Diese beiden Satz von Genen, daher stellen potentielle Kandidaten Onkogene oder Tumor-Suppressor-Gene verbunden, die bei Magenkrebs Pathogenese und Entwicklung beteiligt sein können.

DNA-Kopienzahl Änderungen mit der entsprechenden Gene Expression Werte in ausgewählten Gen-Clustern in der menschlichen Magenkarzinome

Zur weiteren Veranschaulichung, wie Anzahl DNA-Kopie Variationen der Genexpression beeinflussen, analysierten wir die Expressionsmuster der 333 Kandidaten Onkogene und Tumorsuppressorgene in den 62 Magenkrebs-Proben unter Verwendung von hierarchischen Clustering (3A). Keine Assoziationen wurden zwischen dem Clustermuster und klinischen Merkmalen (Abbildung S10), was darauf hindeutet, dass diese Gene zusätzliche Werte für die molekulare Klassifizierung der menschlichen Magenkrebs bieten nicht identifiziert. Interessanterweise wurden mehrere Gencluster gefunden bei den gleichen chromosomalen Regionen befinden, einschließlich der Gene bei 6p21.3-p21.1 befindet, 7q21-q22, 8q21-q24, 8q24.3, 12q14-q15, 20q11-q13 und 20q13. 3 (3B bis 3H). Eine Gesamt starke Korrelation zwischen koordinierten upregulated Expression dieser Gencluster und DNA-Kopienzahl Gewinne in den entsprechenden chromosomalen Regionen beobachtet (3B bis 3H). Er schlägt vor, einen wichtigen Beitrag DNA-Kopienzahlvariation auf die Expression Variation dieser Gene innerhalb des Clusters ist.

Pathway-Analyse von Signifikant exprimierte Gene

Die Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Software eingesetzt wurde die Wechselwirkungen zwischen den Kandidaten-Onkogenen oder Tumorsuppressor-Gene durch die Expression Array und aCGH identifiziert zu untersuchen. Figur 4 zeigt die drei höchstwertigen Netzwerke von Interaktion in Magenkrebs Proben. Netzwerk 1 wurde speziell mit Krebs, Nieren &verbunden sind; urologischen Erkrankungen und Zellzyklus. Netzwerk 2 wurde speziell mit Bindegewebe Entwicklung und Funktion, Krebs und Magen-Darm-Erkrankungen. Netzwerk 3 wurde speziell mit einer genetischen Störung, Skelett- &verbunden sind; Muskelerkrankungen und Entzündungserkrankungen (Tabelle S7). Alle Netze erreichte eine Punktzahl von 21 oder höher und enthalten 11 oder mehr Gene, die die umfassende Beziehung und Interaktion zwischen den signifikant regulierten Genen bei Magenkrebs gezeigt. Top biologische Funktionen dieser Gene wurden in Zellzyklus, die DNA-Replikation verwandt, Rekombination und Reparatur, Energieerzeugung, und Nukleinsäurestoffwechsel (Abbildung S11). Alle diese Funktionen sind dafür bekannt, in tumorigenesis beteiligt zu werden, vorausgesetzt, mögliche Verbindungen zwischen den identifizierten Kandidaten-Onkogene und Tumorsuppressorgene bei Magenkrebs Entwicklung.

Diskussion

Genkopienzahl Veränderungen sind besonders wichtig, da deregulieren Ereignisse in der Krebsprogression. In dieser Studie analysierten wir Copy Number Abberationen (CNAs) von Array-CGH. Häufige Gewinne und Verluste wurden aus der Studie identifiziert. Weiterhin wurden chromosomale Regionen mit hoher Amplifikationen und Deletionen homozygot ebenfalls beschrieben. Zusätzlich wurden Korrelation zwischen Genexpression und DNA-CNAs sucht. Candidate Onkogenen und Tumorsuppressor-Gene wurden durch die Durchführung integrierte Analysen der Genomkopienzahl und der Genexpression identifiziert. Schließlich Beziehungen zwischen diesen Kandidaten-Gene und ihre biologische Funktion wurden in 3-Netzwerken unter Verwendung der Ingenuity Pathway-Analyse beschrieben. Die Daten unterstützen, dass aCGH und Genexpressionsanalyse Array kombiniert eine leistungsfähige Methode ist Kandidat Onkogene oder Tumor-Suppressor-Gene in menschlichen Magenkrebs zu identifizieren. In Übereinstimmung mit diesem Papier frühere Studien haben ähnliche Ansätze angewendet Fahrer genetische Ereignisse in anderen Tumortypen, wie Leberkrebs, [18] und Brustkrebs [19] identifiziert. Interessanterweise wurden als Gene Kandidat Tumorsuppressor in unserer Studie identifizierten Onkogene mehr Kandidaten. Es könnte durch die größere mögliche Größenordnung Verstärkungsbereich im Vergleich zu einem Verlust in Tumorproben kombiniert mit Druckverhältnissen von vermischten nicht-Tumorzellen erläutert. Der Unterschied in der Gen-Zahlen können auch vorschlagen, daß die Expression von Onkogenen tiefer von CNAs geregelt werden kann, als Tumor-Suppressor-Gene sind.

In der aCGH Analyse häufige Gewinne und Amplifikationen in Magenkrebs Proben nachgewiesen wurden. Bemerkenswert ist, im Einklang mit früheren Studien [20], [21], war 20q die häufigste Stelle der Gewinn bei Magenkrebs Proben nachgewiesen. Verstärkung bei 20q wurde auch in verschiedenen anderen Krebsarten, wie Brustkrebs [22] und Bauchspeicheldrüsenkrebs [23] berichtet. In unserer Studie wurden hohe Verstärkungen bei 20q12-q13.3 bei Magenkrebs gefunden. Mehrere Gene sind an diesem Locus, wie AIB1
und BCAS1
entfernt. AIB1
(20q12), ein Steroid-Rezeptor Co-Aktivator zuerst in Brust- und Eierstockkrebs verstärkt gefunden wird, wird bei Magenkrebs-Zellproliferation durch die Interaktion mit nuklearen Rezeptoren [24] beteiligt. BCAS1
(20q13.2), Brustkarzinom amplifizierte Sequenz 1 wird in einer Vielzahl von Tumorarten verstärkt und mit aggressiveren Tumor Phänotypen assoziiert. Up regulierte Expression von BCAS1
signifikant mit der hohen Verstärkung von 20q13 in Adenokarzinomen des gastroösophagealen Kreuzung [25] korreliert. 8Q war die zweithäufigste Ort der Verstärkung, wie es in 26,39% der Proben nachgewiesen wurde. Verstärkung bei 8Q in vielen Krebsarten, wie Brustkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs [23], [26] identifiziert wurde. In unserer Studie wurden hohe Verstärkungen bei 8q24.1-q24.2 bei Magenkrebs gefunden. Mehrere Gene sind an diesem Locus entfernt. MYC Was ist der repräsentativste. Es ist eines der am meisten untersuchten Onkogenen, was zur Malignität von vielen verschiedenen aggressive und undifferenzierte Krebserkrankungen des Menschen beiträgt [27]. Die pathologische Wirkung von MYC
hat seiner Fähigkeit zugeschrieben worden multiplecellular Prozesse zu steuern, wie beispielsweise Zellwachstum, Differenzierung, Apoptose, DNA Schadensantwort, genomische Instabilität, Angiogenese und Tumorinvasions [28].

Ein weiterer wichtiger hohe Verstärkung wurde bei 17q12-q21 gefunden. Die repräsentativen Gene an diesem Locus ist ERBB2-
. Überexpression und /oder Amplifikation in vielen Arten von Krebs beobachtet worden, einschließlich Magenkrebs [29], [30], [31]. Die Korrelation zwischen ERBB2-
Amplifikation und Überexpression durch Vergleich aCGH und Expression Array-Daten in unserem Magen-Krebs-Datensatz (Abbildung S12) festgestellt wird. Überexpression und Amplifikationen wurden in nur einer kleinen Anzahl (~ 6 von 72) von Magenkrebs Proben identifiziert. Dies mag erklären, warum ErbB2 nicht in der korrelierten Kandidaten Onkogen-Liste ausgewählt wurde, da sie nicht die Kriterien als eine der differentiell exprimierten Gene bestanden hat. Dennoch schlägt das Ergebnis deutlich, dass Amplifikation von 17q12-q21 einen Schlüsselmechanismus für hohe Niveaus von ErbB2-Expression in einer Untergruppe von menschlichen Magenkrebsproben darstellen. Magenkrebspatienten mit 17q12-q21 Amplifikation kann von einer Behandlung mit Herceptin profitieren, ein humanisierter Antikörper, entwickelt, um die Funktion von ErbB2 zu zielen und zu blockieren.

Im Einklang mit der Studie von Gorringe KL et al
, Amplifikationen in 6p21 und 5p13 auch in unserem Array CGH Ergebnisse [7] identifiziert wurden. Es ist faszinierend zu beachten, dass eine unverhältnismäßig höhere Anzahl von High-Level-Amplifikationen und homozygote Deletionen wurden bei Magenkrebs-Zelllinien im Vergleich zu Gewebeproben identifiziert. Die Beobachtung zeigt, dass diese Amplifikationen oder Deletionen können während des Wachstums Vorteile bieten in vitro
Zellkultur, und sind daher in Zelllinien angereichert. Die Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung dieser High-Level-Amplifikationen und homozygote Deletionen bei der Regulierung der Zellproliferation oder das Überleben. Die Zelllinien mit diesen Amplifikationen oder Deletionen bieten exzellente Ressourcen weiter die funktionelle Rolle der Gene in diesen Regionen bei Magenkrebs Entwicklung studieren, um zu helfen.

Frühere Studien Einblicke in die Bedeutung spezifischer Kopienzahl Veränderungen in der zur Verfügung gestellt haben Entwicklung von epithelialen Tumoren, die zeigen, dass diese Veränderungen auf die veränderte Expression von kritischen Onkogenen oder Tumorsuppressoren führen kann [21], [31], [32]. Unsere Studie bestätigt daher diese früheren Berichte und liefert den Beweis zu unterstützen, dass CNA die anormale bei der Regulierung nach oben oder unten-Expression dieser Gene bei Magenkrebs Karzinogenese einen wichtigen Faktor darstellt. Jedoch sind die meisten der Gene aus unseren Studien identifizierten immer noch wahrscheinlich Passagier Gene, deren Expression sind hoch Gen-Dosis abhängig und haben begrenzte funktionelle Rollen während tumorigenesis sein. Da diese CNVs nicht zufällig sind und die erste Folge von CNV in Tumorzellen geeignet ist, de-Regulation der Expression von Genen wichtig für Tumorigenese, Treiber Onkogene und Tumorsuppressorgene werden wahrscheinlich in der großen Anzahl von Genen enthalten zu sein, daß wir haben festgestellt. Offensichtlich weitere funktionelle Analyse ist erforderlich, um diese Treiber Onkogenen und Tumorsuppressor-Gen unter unseren genelist zu identifizieren. Um dieses Ziel zu erreichen, kann man eine siRNA basierten Bildschirm anwenden, die Expression von Onkogenen Kandidat bei Magenkrebs-Zelllinien zum Schweigen zu bringen. Ähnliche Studien wurden unter Verwendung von Brustkrebs-Zelllinien durchgeführt. Solche funktionellen Bildschirme beweisen kritisch zu verengen die wahren Treiber Onkogene zu sein. Zum Beispiel Thollet A et al
zeigte, dass Silencing ZNF217 expression-siRNA-vermittelten in MCF7 Brustkrebszellen führte zu einer verringerten Zellproliferation und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Paclitaxel [33].

Insgesamt unsere Studien liefern eine Liste von Kandidatengenen, die weiter funktionell untersucht werden müssen. Dennoch stellt die genelist bereits einige interessante Gene als Kandidaten-Onkogene, deren onkogene Potential hat in anderen Tumorarten nachgewiesen. Die Gene sind NOTCH1
[34], [35], [36], BMI1
[37], [38], [39], [40], [41], EFNA1
[42], [43], NCOA2
[44], BYSL
[45], [46], und Rad21
[47 ]. Zum Beispiel Notch1, ein Mitglied der Notch-Familie-Rezeptor wurde als ein Onkogen in verschiedenen Tumorarten angegeben. Hohe Expression von NOTCH1
wurde in menschlichem Brustkrebs und Darmkrebs beobachtet, die beide mit einer schlechten Prognose von Krebspatienten korreliert sind [34]. Aktiviert NOTCH1
induzierte Lungenadenome bei Mäusen und arbeitete mit Myc bei der Erzeugung von Lungenadenokarzinom [35]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Notch1 Rezeptor intrazelluläre Domäne (N1IC), die aktivierte Form von Notch1 Rezeptor, mit Magenkrebs Progression durch Cyclooxygenase-2 [36] verbunden war. Daher kann Notch-Signalwegs ein neues Ziel für die Behandlung von Magenkrebs. Ein zweites Beispiel ist Bmi1. BMI1
, B-Zell-spezifischen Moloney murine leukemia virus Insertionsstelle 1 ist ein Mitglied einer Gruppe von polycomb transkriptionalen Repressoren und wurde ursprünglich als ein Onkogen in Verbindung mit c-myc in der Entwicklung von murinen Lymphom [identifizierten ,,,0],37]. Zusätzliche Arbeit hat gezeigt, dass BMI1 hatte mit der Tumorentstehung und Progression in Verbindung gebracht worden. Beispielsweise allein BMI1 wurde gezeigt, maligne Transformation von HaCaT-Zellen zu induzieren [38]. Hochregulierung von BMI1 kann die Zellproliferation zu fördern und zu verhindern, Apoptose [39]. Darüber hinaus wird BMI1 zur Proliferation, Überleben und einer schlechten Prognose bei Bauchspeicheldrüsenkrebs im Zusammenhang mit [40]. Vor kurzem wurde eine hohe Expression von BMI1 beobachtet sowohl bei Magenkrebs-Zelllinien und Tumoren des Magens. Die Überexpression von BMI1 wurde gefunden, mit der fortgeschrittenen klinischen Stadium und Lymphknoten-Metastasen in Magenkrebs-Patienten korreliert zu sein [41].

• PLoS ONE: Risikobewertung von Magenkrebs verursacht durch Helicobacter pylori CagA Sequence Markern
• PLoS ONE: E-Cadherin Destabilization Accounts für die Pathogenität von Missense-Mutationen bei hereditärer Diffuse Magenkrebs