PLoS ONE: Integration af DNA-kopi Number Ændringer og Transkriptionel Expression Analyse i Human Gastric Cancer

Abstrakt

Baggrund

Genomisk instabilitet med hyppige DNA kopi nummer ændringer er en af ​​de vigtigste kendetegn ved carcinogenese . Det kromosomale regioner med hyppig DNA kopital gevinst og tab i human gastrisk cancer stadig dårligt defineret. Det er fortsat uvist, hvor DNA-kopien nummer variationer bidrager til ændringerne af genekspression profiler, især på globalt plan.

vigtigste resultater

Vi analyserede DNA kopital ændringer i 64 humane gastrisk kræft prøver og 8 gastrisk cancer cellelinjer med bakterie- kunstige kromosom (BAC) arrays baseret komparativ genomisk hybridisering (aCGH). Statistisk analyse blev anvendt til at korrelere tidligere offentliggjorte genekspression data opnået fra cDNA microarrays med tilsvarende antal variation data DNA-kopi for at identificere kandidat onkogener og tumorsuppressorgener. Vi fandt, at mavekræft prøver viste tilbagevendende DNA kopital variationer, herunder gevinster ved 5p, 8Q, 20p, 20Q, og tab på 4q, 9P, 18q, 21q. De hyppigste regioner forstærkning var 20q12 (7/72), 20q12-20q13.1 (12/72), 20q13.1-20q13.2 (11/72) og 20q13.2-20q13.3 (6/72) . Den hyppigste slettede regionen var 9p21 (8/72). Korrelere genekspression array-data med aCGH identificeret 321 kandidatlande onkogener, som var overudtrykte og viste hyppig DNA kopital gevinster; og 12 kandidat tumorsuppressorgener som blev nedreguleret og viste hyppige DNA kopital tab i menneskelige gastrisk kræft. Tre netværk af væsentlig udtrykte gener i gastrisk kræft prøver blev identificeret ved opfindsomhed pathway-analyse.

Konklusioner

Denne undersøgelse giver et indblik i DNA kopital variationer og deres bidrag til ændret genekspression profiler under human gastrisk cancerudvikling. Det giver nye kandidat driver onkogener eller tumorsuppressorgener til human mavekræft, nyttige pathway kort for fremtiden forståelse af den molekylære patogenese af denne malignitet, opførelse af nye terapeutiske mål

Henvisning:. Fan B, Dachrut S, Coral H, Yuen ST, Chu KM, Law S, et al. (2012) Integration af DNA-kopi Number Ændringer og Transkriptionel Expression Analysis i Human Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (4): e29824. doi: 10,1371 /journal.pone.0029824

Redaktør: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, Frankrig

Modtaget: September 19, 2011; Accepteret: December 3, 2011; Udgivet 23. april, 2012 |

Copyright: © 2012 Fan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes af de midler, som University of California Cancer Research Koordinere udvalg til XC. BF er støttet af Kina Scholarship Rådet Contract No.2010601079. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de mest almindelige maligne lidelser og den næsthyppigste årsag til kræft dødsfald på verdensplan [1]. Den største type mavekræft er adenocarcinom, som yderligere kan opdeles i intestinal type og diffus art [2]. Intestinal-type læsioner er ofte ulcerativ og forekommer i den distale mave. Diffus-type læsioner er associeret med en dårligere prognose end den intestinale type. Kirurgisk behandling er den eneste terapeutiske modalitet, der har en potentielt helbredende virkning til mavekræft. Prognosen for mavecancerpatienter er meget afhængig af klinisk og patologisk stadium af sygdommen på diagnosetidspunktet. De 5-årige overlevelsesrater efter helbredende kirurgisk resektion fald fra 60-90% i fase I til kun 10-25% for patienter i fase III af sygdommen [3]. De fleste gastrisk kræftpatienter identificeres på et fremskredent stadium, hvilket fører til den dystre prognose.

Genetiske ændringer er vigtige begivenheder i udviklingen af ​​de fleste tumorer, herunder gastrisk kræft [4]. Undersøgelser tyder på, at tumorudvikling afhænger successiv erhvervelse af kromosomafvigelser fører til gevinster eller tab af en del af tumor celle genomet. Derfor kan karakterisering af genomiske abnormiteter hjælpe belyse den molekylære patogenese af mavekræft samt afsløre de genetiske markører for progression. Array-baserede komparativ genomisk hybridisering (aCGH) er en kraftfuld metode til at identificere sygdomsfremkaldende DNA kopital ændringer på en genom-plan [5]. aCGH er blevet anvendt på en række faste tumorer, herunder mavecancer [6], [7]. Det har vist sig at være nyttig ved identifikation af hidtil ukendte onkogener og tumorsuppressorgener, og at klassificere tumorer baseret på genetiske ændringer. Salg

ekspressionsprofil eksperimenter identificeret et stort antal gener, som udtrykkes differentielt i normal og tumor væv. Men de fleste af disse gener vil sandsynligvis være passager gener, som har begrænset bidrag til tumorigenese. Den største udfordring har været at identificere driver onkogener eller tumorsuppressorgener, der spiller vigtige roller under tumorinitiering og progression, Genomisk DNA kopital variation er en vigtig type genetisk ændring observeret i tumorceller, og det bidrager til tumor evolution ved ændringer af ekspression af gener inden for regionen [8]. DNA-kopier nummer gevinster og tab er ikke tilfældig, men snarere repræsenterer konsekvente genetiske begivenheder under carcinogenese. Identifikation af gener, som er både over-udtrykkes og forstærkes eller under-udtrykt og slettet kan være gavnligt, fordi disse gener kan repræsentere driver genetiske ændringer.

Tidligere undersøgelser har rapporteret DNA kopital ændringer eller udtryk profiler i gastrisk kræft prøver . Undersøgelserne har også identificeret fælles kromosom gevinster og tab, samt hundredvis af gener, der kan skelne tumorer fra normale væv [6], [9]. Imidlertid har få studier undersøgt sammenhængen mellem DNA kopital variationer og transkriptionelle udtryk profiler. I dette manuskript, udførte vi aCGH analyse i et stort antal humane gastriske cancer prøver. Endvidere blev integreret analyse af DNA kopital variationer og tilsvarende genekspression værdier udført for at identificere væsentlige gener, der kan bidrage til mavekræft patofysiologi. I alt 321 kandidat onkogener og 12 kandidat tumorsuppressorgener blev identificeret gennem analysen.

Materialer og metoder

Etik Statement

Brugen af ​​arkivers gastrisk prøve til den nuværende undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité ved University of Hong Kong og de interne bestyrelser University of California anmeldelse, San Francisco.

tumorprøver, cellelinjer og DNA, RNA Forberedelse

Tumor prøver blev indsamlet fra gastrektomi prøver fra Institut for Kirurgi, Queen Mary Hospital, The University of Hong Kong. Otte gastrisk cancer cellelinjer AGS, BGC823, N87, NUGC3, SNU16, SNU5, KATOIII og MNK45 er blevet beskrevet i vores tidligere publikationer [10]. Genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af genomiske DNA oprensningskit (Qiagen, Valencia, CA).

klinisk-patologiske parametre for tumorerne er tidligere blevet publiceret [11]. Tumorer blev klassificeret ved hjælp af Lauren klassificering af tarm, diffus, blandet, og ubestemte typer [2]. Tilstedeværelsen af ​​H. pylori i gastrektomi prøver blev bestemt ved histologisk undersøgelse og suppleret med modificeret Giemsa farvning. Tilstedeværelsen af ​​EBV i cancerceller blev analyseret ved in situ hybridisering for EBER som tidligere beskrevet [12]. Tumoren stadier blev defineret af de generelle regler for mavekræft Undersøgelse af den japanske Research Society for gastrisk kræft [13].

Array-baserede CGH

Humane 1.14 arrays blev opnået fra UCSF Cancer center-Array Core (http://cc.ucsf.edu/microarray/). De bestod af 2353 bakterielle kunstige kromosom (BAC) kloner, der er omfattet af det menneskelige genom på 1,5 Mb opløsning. Til hybridisering blev 1 ug tumor-DNA og 1 ug af køn matchede henvisning DNA mærket ved tilfældig priming under anvendelse Cy3-dCTP og Cy5-dCTP, henholdsvis med Bioprime Kit (Invitrogen). Ikke-inkorporerede fluorescerende nucleotider blev fjernet ved anvendelse af en Sephadex G-50-søjle (Amersham, Piscataway, NJ). Prøve og reference-DNA blev blandet med 100 ug Cot-1, udfældet og resuspenderet i hybridiseringsopløsningen. Hybridiseringsopløsningen blev denatureret i 10 min ved 72 ° C og derefter inkuberet i 1 time ved 37 ° C. Hybridisering blev udført i 48-72 timer i et fugtigt kammer på en langsom vuggende tabel. Arrays blev vasket i 10 minutter i 50% formamid og 2 x SSC ved 45 ° C, og 10 min i phosphatbuffer ved stuetemperatur. Slides blev monteret i monteringsløsninger indeholdende 0,3 ug /m DAPI. Tre ensfarvede intensitet billeder (DAPI, Cy3 og Cy5) blev indsamlet for hver array ved hjælp af en afgift koblet enhedens kamera.

Array-baserede CGH dataanalyse

UCSF SPOT software [14] blev anvendt til automatisk segment pletterne baseret på DAPI billeder, udføre lokale baggrund rettelser, og beregne forskellige måleparametre, herunder log2 forhold mellem de samlede integrerede Cy3 og Cy5 intensiteter for hver plet. Rådata fra aCGH findes på GEO (tiltrædelse nummer: GSE33501).

Program SPROC blev brugt til at associere klon identiteter og en kortlægning oplysninger fil med hver plet, så data kan plottes i forhold til placeringen af BAC'erne. Kromosomafvigelser blev klassificeret som en gevinst, når det normaliserede log2 Cy3 /Cy5 forholdet var > 0,225 og som et tab, når forholdet var < -0,225. Antallet blev bestemt som 3 gange den gennemsnitlige SD af normal versus normal aCGH hybridisering. Amplifikationer blev identificeret, når det normaliserede log2 Cy3 /Cy5-forholdet var > 0.8. Ligeledes blev homozygote sletninger identificeres, når det normaliserede log2 Cy3 /Cy5 forholdet var < -0,7. Flere gevinster, tab og amplificeringer blev talt som separate hændelser. Tærsklen på gevinst eller tab af en hel kromosom arm blev defineret som medianen log2 forholdet mellem > 0,225 eller. ≪ -0,225 for alle kloner på kromosomet arm

Statistisk Dataanalyse

prøver blev kategoriseret baseret på de eksperimentelle resultater og sammenlignet med de kliniske data (tabel S1) ved anvendelse signifikant analyse af microarray (SAM) analyse [15]. DNA kopi nummer ændringer, herunder median procentdel af gevinst og tab. Hyppig amplifikation og deletion blev analyseret ved anvendelse af CGH Explorer 3.2 (http://www.ifi.uio.no/forskning/grupper/bioinf/Papers/CGH/). "Analyse af Copy Fejl" (ACE) blev udført ved hjælp af en falsk opdagelse sats (FDR) på 0,0001 og middel følsomhed. Gruppering af alle prøver blev udført i TreeView udgave 1.60.

R /BioConductor software, herunder CBS-programmet blev anvendt til at beregne sammenhængen mellem kopiantal forandring og genekspression. Ekspressionsprodukterne data for de 6688 cDNA-kloner, der anvendes i det foregående genekspression analyse [11], [16] (GEO accessionsnummer: GSE2701) blev hentet. Kortlægning position for disse cDNA kloner blev tildelt ved hjælp af NCBI genom samling, adgang til via UCSC genom browser database (NCBI bygge 35). Den aCGH data blev segmenteret hjælp cirkulære binære segmentering (CBS) som gennemført i DNA-kopien pakke i R /BioConductor at oversætte eksperimentelle intensitet målinger i områder af lige kopi numre. Manglende værdier for kloner kortlægning inden segmenterede regioner af lige kopiantal blev imputeret ved hjælp af værdien af ​​den tilsvarende segment. Genekspressionen kloner blev kortlagt til BAC klon inden for 1 Mb af genekspression klon, som havde den højeste Pearson korrelation mellem kopital og genekspression. "Udlignet" værdier fra CBS med den oprindeligt observeret log2 ratio for vildskuddet kloner beskrevet ovenfor, og de imputerede værdier for manglende værdier blev behandlet i computing korrelation med genekspression. Korrelation blev kun beregnet for kloner, og en korrelationskoefficient på 0,29 blev anvendt som afskæringsværdi for at identificere kloner, der har positiv sammenhæng mellem kopiantallet og genekspression. s
-værdier for genekspression og kopiere blev opnået nummer korrelationer baseret på permutation. Mærkningen af ​​udtryk data blev tilfældigt blandet og Pearson korrelation mellem genekspression kloner og kopiantal BAC-kloner blev beregnet som tidligere beskrevet. Dette blev gentaget 1000 gange. For hver genekspression klon, blev p-værdien bestemmes som andelen af ​​gange permutationen baseret korrelation var større end eller lig med den observerede korrelation. s
-værdier blev derefter korrigeret for flere tests ved at kontrollere for falske opdage sats (FDR) ved hjælp af Benjamini-Hochberg metoden [17].

Funktionel analyse af de betydelige gener blev udført hjælp Ingenuity Pathway software (Ingenuity Systems, Redwood City, CA).

Resultater

Array-baserede CGH analyse af human mavekræft

for at identificere DNA kopi nummer ændringer i gastrisk kræftformer, vi anvendte BAC aCGH til 64 menneskelige gastrisk cancer vævsprøver og 8 mavekræft cellelinjer. De rå data er tilgængelige i tabel S2. Vi observerede tilbagevendende kromosomale variationer i disse prøver, og regioner med betydelige DNA kopital ændringer blev identificeret. Den resulterende frekvens plot og aberration plot af gevinster og tab er vist i figur 1A og 1B henholdsvis. To repræsentative genom-dækkende forholdet grunde til individuel gastrisk tumor er vist i figur S1. De mest almindelige DNA kopital variationer i dette sæt af humane gastriske tumorer som bestemt af medianen procentdel af gevinst eller tab medtages gevinst på 5p, 8Q, 20p, 20Q, og tab af 4q, 9p, 18q, 21q.

Dernæst analyserede vi DNA kopital variationer i gastrisk tumor prøver med forskellige klinisk-patologiske funktioner, herunder tumor stadium, tumortype, tumorstedet, tumor differentiering, Helicobacter pylori og EBV infektion, såvel som forskellen mellem gastriske tumorprøver og celle linjer, (figur S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8 og tabel S3). Vi fandt specifikke kromosomafvigelser beriget i visse klinisk-patologiske træk. For eksempel blev tab af 19p observeret hyppigere i fase 1 & stadie 2 tumorer (20%) end i fase 3 & trin 4 prøver (3,41%) (Tabel S3). 16P tab blev identificeret i 10% af Helicobacter pylori negative prøver sammenlignet med 0% i de Helicobacter positive prøver, mens 16p forstærkning er blevet observeret i 14,71% af Helicobacter pylori positive prøver, men kun i 3,33% af Helicobacter negative prøver (tabel S3 ). Disse resultater tyder på det mulige bidrag af gener inden for specifikke områder til specifikke tumor fænotyper.

højt niveau amplificeringer og homozygote sletninger er sammenfattet i tabel S4. Den hyppigste forstærkning blev fundet på den lange arm af kromosom 20. I denne region, kunne fire separate fokale amplikoner identificeres: 20q12 (7/72), 20q12-20q13.1 (12/72), 20q13.1-20q13. 2 (11/72) og 20q13.2-20q13.3 (6/72). Den næsthyppigste forstærkning, der forekommer i den lange arm af kromosom 8, havde også fire separate fokale amplikoner: 8q23.1 (3/72), 8q24.1 (7/72), 8q24.12-8q24.2 (6 /72) og 8q24.2 (6/72). Den hyppigste homozygot sletning region blev fundet ved 9p21 (8/72) og ved 18q22 (6/72). Andre højt niveau amplificeringer og homozygote sletninger forekom ved relativt lavere frekvenser. Eksempler på hyppige afvigelser er vist i figur 2. Nogle velkarakteriserede onkogener (f.eks HER2, TOP2A, cyclin, TGFB1, AKT2, MYC
) og tumorsuppressorgener (fx P16, Smad4, SMAD7
) findes at være placeret i disse loci. Interessant, blev et større antal amplificeringer og homozygote sletninger identificeret i cellelinjer end i de primære gastrisk cancer tumor prøver.

Bidrag af Genomisk DNA Copy Number Variation til Global genekspression Ændringer i human Gastric Cancer Prøver

i vores tidligere undersøgelse, rapporterede vi genekspressionsprofilen i 90 primære mavekræft prøver sammenlignet med deres 14 metastatiske kolleger og 22 ikke-neoplastisk gastrisk slimhinder, med 6688 cDNA kloner viser betydelig variation på tværs af disse prøver [11], [ ,,,0],16]. Blandt de 90 mavekræft prøver blev 62 prøver indeholdt i den nuværende aCGH undersøgelsen. For at afgøre, om genomisk DNA kopital variationer bidrager til globale genekspression mønster ændringer, vi bestemt sammenhængen mellem genekspression værdier og den tilsvarende DNA-kopi nummer ændrer sig i disse 62 humane mavekræft prøver på et gen ved gen-basis. Af 6688-cDNA i de oprindelige ekspressionsundersøgelser blev 5719 cDNA-kloner med positionsinformation hentes til denne analyse. Af disse 5719 cDNA kloner, 1352 cDNA kloner (23,6% af de samlede cDNA kloner analyseret), som repræsenterer ca. 973 unikke gener, viste statistisk signifikant sammenhæng mellem udtryk værdier og DNA kopi nummer variationer (korrelation > 0,29 og justeret p-værdi mindre end 0,01 med FDR mindre end 3,4%. Se tabel S5 til listen over gener). At belyse, om DNA kopiantal indflydelse genekspression, sammenlignede vi parvise korrelation af genekspression data med enten aCGH værdier af BAC kloner tæt på det sted, hvor hvert gen er placeret på (diagonalt) eller aCGH værdier af BAC kloner placeret på andre områder af genomet. Vi fandt par af regioner langs diagonalen har højere positiv korrelation (median korrelation ~0.12) end ikke-diagonale par (median korrelation ~0.0) (figur S9A). En Heatmap af den parvise korrelation mellem genekspression og kopiere nummer viser også positiv korrelation langs diagonalen (figur S9B).

Samlet set vores data bekræfter, at genomisk DNA kopital variationer bidrager til reguleringen af ​​regionale genekspression profiler i humane gastrisk kræft prøver.

Identifikation af Candidate Oncogene eller tumorsuppressorgener til Mennesker gastric cancer

for at lokalisere kandidat onkogener eller tumorsuppressorgener, vi anvendte to kriterier til listen over 1352 cDNA kloner, som viste statistisk signifikant korrelation mellem genekspression og tilsvarende DNA kopital ændringer. Først, vi søgte efter gener, der viste 5 flere gevinster end tab eller 5 mere tab end gevinster i gastrisk kræft prøver. Dernæst vi matchede genet liste med de 3329 cDNA-kloner, der blev identificeret til at være differentielt udtrykt mellem ikke-tumor gastriske væv og humane mavekræft prøver [11]. Således har vi indsnævret vores liste til 363 kloner, der repræsenterer 333 unikke gener (Tabel S6). Blandt disse gener, blev 321 gener opreguleret i gastrisk cancer prøver og blev ofte opnået eller amplificeret på det genomiske DNA-niveauet. De resterende 12 gener blev nedreguleret i gastrisk cancer prøver og blev ofte slettet på det genomiske DNA-niveauet. Disse to sæt af gener, derfor repræsenterer potentielle kandidatlande onkogener eller tumorsuppressorgener henholdsvis som kan være involveret i mavekræft patogenese og udvikling.

DNA Kopier Antal Ændringer med det tilsvarende gen Expression Værdier i udvalgte gen Clusters i human gastric cancer

for yderligere at illustrere, hvordan DNA kopital variationer påvirke genekspression, vi analyserede ekspressionsmønstre for de 333 kandidat onkogener og tumorsuppressorgener i de 62 mavekræft prøver ved hjælp af hierarkiske clustering (figur 3A). Ingen foreninger blev identificeret mellem clustering mønster og kliniske funktioner (figur S10), hvilket tyder på, at disse gener ikke giver yderligere værdier for molekylær klassifikation af menneskets mavekræft. Interessant, blev fundet flere gen-klynger til at være placeret på samme kromosomale regioner, herunder gener placeret på 6p21.3-p21.1, 7q21-q22, 8q21-Q24, 8q24.3, 12q14-Q15, 20q11-q13 og 20q13. 3 (figur 3b-3h). En samlet stærk sammenhæng mellem koordineret opreguleret ekspression af disse gen-klynger og DNA kopi nummer gevinster i de tilsvarende kromosomale regioner blev observeret (figur 3B til 3h). Det tyder på, at DNA-kopi nummer variation er en vigtig bidragyder til udtrykket variation af disse gener inden for klyngen.

Pathway Analyse af Markant udtrykte gener

(IPA) software Ingenuity Pathway Analyse blev ansat at undersøge samspillet mellem kandidatlandene onkogener eller tumorsuppressorgener identificeret ved ekspression array og aCGH. Figur 4 viser de tre vigtigste netværk af interaktion i mavekræft prøver. Netværk 1 blev specifikt forbundet med kræft, nyre- & urologisk sygdom, og cellecyklus. Network 2 blev specifikt forbundet med bindevæv udvikling og funktion, cancer og gastrointestinal sygdom. Netværk 3 blev specifikt forbundet med genetisk sygdom, skelet & muskulære lidelser og inflammatoriske sygdomme (tabel S7). Alle netværk nåede en score på 21 eller højere og indeholdt 11 eller flere gener, der demonstrerede den omfattende relation og interaktion mellem de væsentligt regulerede gener i mavekræft. Top biologiske funktioner af disse gener var relateret til cellecyklus, DNA-replikation, rekombination og reparation, energiproduktion, og nukleinsyre metabolisme (figur S11). Alle disse funktioner er kendt for at være involveret i tumorigenese, giver mulige forbindelser mellem de identificerede kandidat onkogener og tumorsuppressorgener under gastrisk udvikling af kræft.

Diskussion

Gene kopi nummer ændringer er særligt vigtigt, da deregulering begivenheder i cancer progression. I denne undersøgelse har vi analyseret Copy Number Afvigelser (CNAs) ved opstilling CGH. Hyppige gevinster og tab blev identificeret fra undersøgelsen. Endvidere blev kromosomale regioner med høje niveauer af amplificeringer og homozygote deletioner også beskrevet. Derudover korrelation mellem genekspression og DNA CNAs blev undersøgt. Kandidat- onkogener og tumor-suppressor gener blev identificeret ved at udføre integrerede analyser af genom kopital og genekspression. Endelig blev forholdet mellem disse kandidatgener og deres biologiske funktion er beskrevet i 3 netværk ved hjælp af Ingenuity pathway analyse. Dataene understøtter at kombinere aCGH og genekspression array analyse er en kraftfuld metode til at identificere kandidat onkogener eller tumorsuppressorgener i human gastrisk cancer. I overensstemmelse med dette papir, har tidligere undersøgelser anvendt lignende metoder til at identificere føreren genetiske begivenheder i andre tumortyper, såsom leverkræft [18] og brystkræft [19]. Interessant, blev flere kandidat onkogener identificeret end kandidat tumorsuppressorgener i vores undersøgelse. Det kan forklares ved den større mulige størrelsesorden vifte af gevinst i forhold til tab i tumorprøver kombineret med komprimerede nøgletal fra iblandede ikke-tumorceller. Forskellen i gen numre kan også antyde, at ekspressionen af ​​onkogener kan mere dybt reguleret af CNAs end tumorsuppressorgener er.

I aCGH analyse, hyppige gevinster og amplificeringer blev påvist i gastrisk cancer prøver. Notatet er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [20], [21], 20Q var den hyppigste site af gevinst påvist i mavekræft prøver. Amplifikation ved 20Q er også rapporteret i adskillige andre cancerformer, såsom brystcancer [22] og pancreascancer [23]. I vores undersøgelse blev højt niveau amplifikationer findes på 20q12-q13.3 gastrisk kræft. Adskillige gener er placeret på dette sted, såsom AIB1
BCAS1
. AIB1
(20q12), et steroid receptor co-aktivator først fundet forstærket i bryst- og ovariecancer er involveret i gastrisk kræft celledeling gennem interaktion med nukleare receptorer [24]. BCAS1
(20q13.2), brystkarcinom forstærket sekvens 1, forstærkes i en række forskellige tumortyper og er forbundet med mere aggressive tumor fænotyper. Opreguleret udtryk for BCAS1
er signifikant korreleret med det høje forstærkning af 20q13 i adenokarcinomer i mave-esophageal krydset [25]. 8Q var den næsthyppigste site af gevinst, som det blev påvist i 26,39% af prøverne. Amplifikation ved 8Q er blevet identificeret i mange cancere, såsom brystcancer og pancreascancer [23], [26]. I vores undersøgelse blev højt niveau amplifikationer findes på 8q24.1-q24.2 gastrisk kræft. Adskillige gener er placeret i dette locus. MYC
er den mest repræsentative en. Det er en af ​​de mest undersøgte onkogener, som bidrager til malignitet af mange forskellige aggressive og udifferentierede humane cancere [27]. Den patologiske virkning af MYC
er blevet tilskrevet dens evne til at kontrollere multiplecellular processer såsom cellevækst, differentiering, apoptose, DNA beskadigelse respons, genomisk ustabilitet, angiogenese, og tumorindtrængen [28].

En anden vigtig højt niveau forstærkning blev fundet ved 17q12-Q21. De repræsentative gener placeret på dette locus er ERBB2
. Overekspression og /eller forstærkning er blevet observeret i mange former for kræft, herunder gastrisk kræft [29], [30], [31]. Sammenhæng mellem ERBB2
forstærkning og overekspression bemærkes ved at sammenligne aCGH og udtryk array-data i vores mavekræft datasæt (figur S12). Overekspression og amplificeringer blev identificeret i kun et lille antal (-6 af 72) af gastrisk kræft prøver. Dette kan forklare, hvorfor ERBB2 ikke blev valgt i korreleret kandidat onkogen liste, da det ikke passere kriterierne som en af ​​de differentielt udtrykte gener. Ikke desto mindre resultat antyder klart, at amplifikation af 17q12-q21 kan være et afgørende mekanisme for høje niveauer af ERBB2 ekspression i en undergruppe af humane gastriske cancer prøver. Mavekræft patienter med 17q12-Q21 forstærkning kan have gavn af behandling med Herceptin, et humaniseret antistof, der er designet til at målrette og blokere funktionen af ​​ERBB2.

I overensstemmelse med den undersøgelse, som Gorringe KL, et al
, amplifikationer på 6p21 og 5p13 blev også identificeret i vores vifte CGH resultater [7]. Det er spændende at bemærke, at et uforholdsmæssigt højere antal højt niveau amplificeringer og homozygote sletninger blev identificeret i gastrisk cancer cellelinjer sammenlignet med vævsprøver. Observationen indikerer, at disse amplifikationer eller deletioner kan tilvejebringe vækst fordele under in vitro
cellekultur, og derfor er beriget i cellelinier. Resultaterne understreger vigtigheden af ​​disse højt niveau amplificeringer og homozygote sletninger i regulering celledeling eller overlevelse. De cellelinjer med disse amplifikationer eller sletninger levere fremragende ressourcer til at hjælpe yderligere studere de funktionelle roller generne inden for disse områder i løbet af gastrisk udvikling af kræft.

Tidligere undersøgelser har givet indsigt i betydningen af ​​specifikke kopi nummer ændringer i udvikling af epiteliale tumorer, der viser, at disse ændringer kan føre til ændret ekspression af kritiske onkogener eller tumorsuppressorer [21], [31], [32]. Vores undersøgelse bekræfter således disse tidligere rapporter og beviser til støtte for denne CNA udgør en vigtig faktor i reguleringen af ​​unormale op eller ned-ekspressionen af ​​disse gener under mavekræft carcinogenese. Men de fleste af de gener identificeret fra vores undersøgelser er stadig forventes at være passager gener, hvis udtryk er meget gen-dosisafhængig, og har begrænset funktionelle roller under tumorigenese. Da disse CNVs er ikke tilfældig og den vigtigste konsekvens af CNVs i tumorer celler er sandsynligvis den de-regulering af ekspressionen af ​​gener er vigtige for tumorigenese, driver onkogener og tumorsuppressorgener sandsynligvis vil blive inkluderet i det store antal gener, vi har identificeret. Det er klart, kræves yderligere funktionel analyse for at identificere disse driver onkogener og tumorsuppressorgen blandt vores genelist. For at nå dette mål, kan man anvende en siRNA baseret skærm til tavshed udtryk for kandidat onkogener i gastrisk cancer cellelinjer. Lignende undersøgelser er blevet udført under anvendelse af brystcancercellelinier. Sådanne funktionelle skærme vise sig at være afgørende for at indsnævre de sande driver onkogener. For eksempel Thollet A et al
viste, at siRNA-medieret dæmpning af ZNF217 udtryk i MCF7 brystkræftceller førte til nedsat celledeling og øget følsomhed over for paclitaxel [33].

Samlet set vores undersøgelser giver en liste over kandidatgener, der skal undersøges nærmere funktionelt. Ikke desto mindre genelist allerede giver nogle interessante gener som kandidat onkogener hvis onkogent potentiale er blevet påvist ved andre tumorer. Generne omfatter NOTCH1
[34], [35], [36], BMI1
[37], [38], [39], [40], [41], EFNA1
[42], [43], NCOA2
[44], BYSL
[45], [46], og RAD21
[47 ]. For eksempel har Notch1, et medlem af Notch familie receptor blevet angivet som et onkogen i flere tumortyper. Høj ekspression af NOTCH1
blev observeret i human brystcancer og colorektal cancer, som begge er korreleret med dårligt resultat af kræftpatienter [34]. Aktiveret NOTCH1
induceret lungeadenomer hos mus og samarbejdede med Myc i dannelsen af ​​lunge adenocarcinom [35]. Nylige undersøgelser viste, at Notch1 receptor intracellulære domæne (N1IC), den aktiverede form af Notch1 receptor, var forbundet med gastrisk cancer progression gennem cyclooxygenase-2 [36]. Derfor kan Notch signalvej være et nyt mål for behandling af gastrisk cancer. Et andet eksempel er Bmi1. BMI1
, B-cellespecifik Moloney leukæmivirus insertionssted 1, er et medlem af en Polycomb gruppe af transkriptionelle repressorer og blev oprindeligt identificeret som et onkogen forbundet med c-myc i udviklingen af ​​murine lymfom [ ,,,0],37]. Yderligere arbejde har vist, at BMI1 havde været forbundet med tumor udvikling og progression. For eksempel har BMI1 alene blevet vist at inducere malign transformation af HaCaT celler [38]. Opregulering af BMI1 kan fremme celleproliferation og forhindre apoptose [39]. Desuden er BMI1 relateret til proliferation, overlevelse og dårlig prognose i pancreascancer [40]. For nylig blev høj ekspression af BMI1 observeret både i gastrisk cancer-cellelinjer og gastriske tumorer. Overekspression af BMI1 viste sig at være korreleret med avanceret klinisk udvikling og lymfeknude metastaser i mavecancerpatienter [41].

• PLoS ONE: Risikovurdering af gastrisk kræft forårsaget af Helicobacter pylori hjælp CagA Sequence Markers
• PLoS ONE: E-cadherin destabilisering Regnskab for Patogenicitet af missense mutationer i Arvelig Diffuse Gastric Cancer