PLoS ONE: let-7-MicroRNA Familie selektiv in die extrazelluläre Umgebung über Exosomen in einem metastasierten Magenkrebszellen Line

Abstrakt

Abgesonderte Hintergrund

Exosomen eine wichtige Rolle dabei spielen, von Zelle zu -cell Kommunikation, Zielzellen exosomalen Molekülen, einschließlich Proteinen, mRNAs und microRNAs (miRNAs) durch einen Endozytose-ähnlichen Weg zu übertragen. miRNAs sind kleine nichtkodierende RNA-Moleküle im Durchschnitt 22 Nukleotide lang, die durch Targeting mRNAs zahlreichen biologischen Prozessen, einschließlich Krebs Pathogenese und vermitteln Gen Herunterregulierung regulieren RNA-Abbau zu induzieren und /oder Translation stören. Jüngste Berichte implizieren, dass miRNAs stabil in zirkulierenden Plasma und Serum nachgewiesen werden, da miRNAs durch Exosomen verpackenden werden aus RNA-Abbau geschützt werden. So sind Profilierungs exosomalen miRNAs in der Notwendigkeit interzelluläre Signalübertragung zu klären und eine neue Krankheitsmarker als auch entdecken.

Methodik /wesentlichen Ergebnisse

Exosomen wurden isoliert aus kultivierten Krebszelllinien und ihre Qualität überprüft wurde Analysen durch Transmissionselektronenmikroskopie und western Blotting. Eine der getesteten Zelllinien, einer metastasierenden Magenkrebszelllinie, AZ-P7a, zeigte die höchste RNA-Ausbeute in den frei Exosomen und unverwechselbare Form in der Morphologie. Zusätzlich wurden RNAs aus den Zellen und Kulturmedien isoliert und Profile dieser drei miRNA Fraktionen wurden unter Verwendung von Microarray-Analyse erhalten. Signalintensitäten von Microarray-Daten und die folgende Validierung mittels RT-PCR-Analyse Durch den Vergleich, fanden wir, dass let-7-miRNA-Familie sowohl in der intra- und extrazellulären Fraktionen von AZ-P7a Zellen reichlich vorhanden war, während niedrige metastatische AZ-521, die elterliche Zelle Linie von AZ-P7a sowie andere Linien Zellkarzinom zeigten keine solche Neigung.

Schlussfolgerungen /Bedeutung

die Anreicherung von let-7-miRNA-Familie in den extrazellulären Fraktionen, insbesondere in der Exosomen von AZ-P7a Zellen können ihre onkogene Eigenschaften einschließlich tumorigenesis und Metastasierung zu reflektieren. Da let-7 im Allgemeinen miRNAs einen Tumor-unterdrückende Rolle spielen, als Onkogene wie RAS
und HMGA2
Unsere Ergebnisse legen nahe, dass AZ-P7a Zellen setzen let-7 miRNAs über Exosomen in das Targeting extrazelluläre Umgebung ihre oncogenesis zu halten

Citation. Oshima K, Inoue K, Fujiwara A, Hatakeyama K, K Kanto, Watanabe Y, et al. (2010) Let-7 MicroRNA Familie Selektiv Abgesonderte in die extrazelluläre Umgebung über Exosomen in einem metastasierten Magenkrebs-Zelllinie. PLoS ONE 5 (10): e13247. doi: 10.1371 /journal.pone.0013247

Editor: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Deutschland |

Empfangen: 14. April 2010; Akzeptiert: 10. September 2010; Veröffentlicht: 8. Oktober 2010

© 2010 Oshima et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Die Arbeit wurde durch einen Zuschuss in Zusammenarbeit mit innovativer Technologie und Advanced Research in Evolutionäre Area (Stadtbereich) aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie von Japan unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Die Zellen sezernieren verschiedene Arten von kleinen Membranbläschen. Exosomen sind eine der Vesikel mit 30-100 nm Durchmesser und physikochemisch unterscheidet sich von anderen sekretierten Vesikeln [1]. Innerhalb Exosomen, zelluläre Genprodukte einschließlich Proteine, mRNAs und Mikro-RNAs (miRNAs) sind verpackt und diese Moleküle können an Empfängerzellen übertragen werden, um ihre molekulare Signal zu liefern wie Onkogenese [2] - [4] und immune response [1], [ ,,,0],5]. Exosomen sind von vielen Arten von Zellen freigesetzt [6], die Tumorzellen, Epithelzellen umfassen und hämatopoetischen Zellen, wie beispielsweise Retikulozyten, zytotoxische T-Lymphozyten, Epstein-Barr-Virus-transformierten B-Zellen, Mastzellen, dendritischen Zellen und Blutplättchen. Abgesonderte Exosomen wurden isoliert und charakterisiert in vitro
aus kultivierten Zelllinien [7] zusammen mit in vivo
in Körperflüssigkeiten [7], einschließlich Blut [8], Urin [9], Speichel [10], Fruchtwasser [11] und malignem Pleuraerguss [12]. Da in vielen wuchernde Zelltypen beobachtet, ist es denkbar, Tumorzellen zu verstärken, wie bei Krebs durch ihre verstärkte Präsenz in Plasma und Pleuraergüsse von Patienten nachgewiesen [8], [12]. Diese verstärkte Präsenz in nicht-invasive Körperflüssigkeiten von Krebspatienten hat sich beschleunigt für die Entdeckung klinisch nützliche Tumormarker und Biomarker molekularen Komponenten in den Exosomen zum Profil [3], [7], [13].

miRNAs a sind Klasse von nicht-kodierenden RNAs kleine, die sowohl in posttranslationalen Regulation der Genexpression beteiligt sind Stabilität und Translation von mRNAs durch Hemmung [14]. Jüngste Erkenntnisse haben gezeigt, dass Mutationen oder miRNA misexpression mit verschiedenen Krebserkrankungen des Menschen korrelieren und anzuzeigen, dass einige miRNAs als Onkogene oder Tumorsuppressoren funktionieren kann [15], [16]. Zu analysieren RNAs ist es immer ihre Stabilität gegen Abbau durch RNase zu betrachten. Neuere Erkenntnisse zeigen, dass endogene Plasma miRNAs in Blutproben in einer Form stabil nachweisbar sind, die RNase-Aktivität resistent ist [17], nachgewiesen durch Identifizierung von miRNAs in Körperflüssigkeiten wie Blut [17] - [24], Urin [25], und Speichel [10], [26].

kultivierten Krebszellen verwendet wurden, für die Tumormarker zu suchen. Insbesondere identifizieren Proteine ​​und Peptide in das Kulturmedium sekretiert wurde von Proteomics-basierten Ansatz entwickelt [27], [28]. Wie für molekulare Signatur in den Exosomen, haben Proteomik sowie Transkriptomik Analysen durchgeführt worden tumorigenesis zu offenbaren und die Tumormarker-Kandidaten [2] identifizieren - [4], [7], [29]. Hier zu identifizieren miRNA tumorigenesis und Metastasierung bezogen, führten wir umfangreiche miRNA-Analyse in drei Zellfraktionen einschließlich Zellen, Exosomen und Medium aus kultivierten Zellen. Rang Daten dieser intra- und extrazellulären miRNAs durch Microarray-Analyse erhalten wurde, fanden wir, dass let-7-miRNA-Familie in allen Fraktionen, die von AZ-P7a Zellen reich ist, eine metastatische Linie Magenkrebszellen, die eine homogene und Kondensmilch Morphologie erzeugt, und eine hohe Ausbeute Rate von exosomalen miRNAs. Diese Ergebnisse waren eindeutig von anderen Zelllinien, einschließlich Lungenkrebs-Zelllinien (SBC-3, NCI-H69 und DMS53), Darmkrebs-Zelllinien (SW480 und SW620) und AZ-521, die elterliche Zelllinie von AZ-P7a. Bedenkt man, dass let-7-miRNA-Familie Funktionen hauptsächlich als Tumor-Suppressor-Gene [30] Onkogene Ziel wie RAS
und High Mobility Group A2 ( HMGA2
) [31], schlagen wir vor, dass AZ -P7a Zellen selektiv absondern let-7 miRNAs in die extrazelluläre Umgebung über Exosomen ihre tumorigenen und metastatischen Neigungen zu halten.

Ergebnisse |

Isolierung von Exosomen aus verschiedenen Krebszelllinien

Exosomen sind aus inneren Zellen an die extrazelluläre Umgebung über eine Exozytose artigen Weg hergestellt [1]. Zusätzlich zu Körperflüssigkeiten wie Serum und Plasma aus dem peripheren Blut [7], [8], Exosomen sind in dem Medium von kultivierten Zellen gefunden [7], die Erleichterung Identifizierung exosomalen Moleküle einschließlich Proteine, mRNAs und miRNAs für das Ziel für ihre klinische Anwendung. Profilieren solche exosomalen Moleküle in kultivierten Krebszellen produziert haben dazu geführt, einen neuen Kandidaten-Marker und Antigen für die Krebsdiagnostik und Immuntherapie [7] zu entdecken. In dieser Studie wurde für die Zwecke der exosomalen miRNAs Profilierungs wir zunächst mit verschiedenen Gewebetypen Exosomen aus Kulturmedien von 46 Krebszelllinien isoliert, die für Magen umfassen 8, 16 für die Lunge, 5 für colon, 9 für Pankreas, 3 für Prostata und 5 für die Brust. Nachdem die Zellen für 48 h gezüchtet wurden, Exosomen wurden mit einer Kombination von aufeinanderfolgenden Zentrifugation und Molekulargewicht cut-off Membranen gesammelt, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Ihre Reinheit exosomalen Fraktionen wurde durch Analyse der Transmissionselektronenmikroskopie und Western Blotting beurteilt. Transmissionselektronenmikroskopie zeigte runde vesikulären Membranstrukturen etwa in der Größe von 100 nm im Durchmesser. Unter drei Zelllinien, SBC-3, AZ-521 und AZ-P7a, ist es von Interesse, dass die Morphologie von AZ-P7a Zellen war homogener und kondensiert als andere Zellen (1A). Immun-Elektronenmikroskopie zeigten, dass die extrazelluläre Partikel aus dem Kulturmedium von AZ-P7a Zellen mit einem Antikörper gegen CD63 hatte Immunreaktivität isoliert, eine der exosomalen Membranproteine, bezogen auf den Kapselmembranen (1B). Die Anwesenheit von bekannten exosomalen Proteine, einschließlich CD29 /β1-Integrin, Aip1 /Alix und Tumor Suszeptibilitätsgen 101 (Tsg101) durch Western-Blot-Analyse bestätigt wurde, während ein Protein zu endoplasmatischen Retikulum lokalisiert, Bip /Grp78, war nicht nachweisbar (Abbildung 1C). Dieses Ergebnis zeigt, daß die Kontamination von Material von anderen zellulären Kompartimenten in den exosomalen Fraktionen abgeleitet war minimal. Die Ausbeute an exosomalen Proteine ​​aus AZ-P7a Zellen war 10-mal höher als die von AZ-521-Zellen; ~ 2,5 mg Proteine ​​wurden von 1 x 10 ^{8 AZ-P7a Zellen erhalten.}

Anreicherung von exosomalen RNAs abgeleitet von AZ-P7a Zellen

Nach der Isolierung wurden exosomalen Gesamt-RNAs isoliert aus 46 kultivierten Zelllinien. Interessanterweise waren die RNA-Ausbeuten aus AZ-P7a Zellen viel größer als die von anderen Zellen (2A). Die Verteilung in der Länge zeigte die Anwesenheit großer Mengen von kleinen RNAs in Exosomen (Mittelplatte, 2B). Es sollte beachtet werden, dass es einen signifikanten Unterschied in der Gesamt Exosomen und den exosomalen miRNA Ebenen zwischen Patienten mit Lungenadenokarzinom und Kontrollen [8]. AZ-P7a Zelllinie durch wiederholte Impfung der Eltern AZ-521-Zellen in Mäusen hergestellt wurde, führte zu hohen Peritonealdialyse-metastatischen Potential [32], [33]. Die hohen Ausbeuten von sowohl RNA und Protein zusammen mit den morphologischen Eigenschaften in AZ-P7a Zellen können ihre hohe tumorigenen und metastatischen Propensitäten zurückzuführen somit. Da miRNAs wurden in zellfreien Körperflüssigkeiten nachgewiesen wurde [17] - [20], führten wir auch eine direkte Isolierung von Gesamt-RNAs aus dem Kulturmedium ohne Verfahren zur Exosomen isoliert. Die Mengen an Gesamt-RNAs aus Kulturmedien waren im Allgemeinen höher als diejenigen, die aus Exosomen (2A). RNA Verteilung in Länge zeigten, dass miRNA Fraktionen im Bereich von 10 bis 40 Nucleotid-Länge in RNAs, die aus Kulturmedium (rechte Tafel) sowie Exosomen (Mitte) von AZ-P7a Zellen (2B) festgestellt wurden. Gemäß dem Protokoll des Herstellers für Bioanalyzer, Peaks mit mehr als 40 Nukleotidlänge enthalten andere kleine RNAs einschließlich tRNAs bei 70~90, 5S ribosomale RNA bei 100 und 5,8S ribosomale RNA bei 150, wie in der intrazellulären Fraktion (linke Tafel) beobachtet . Diese Ergebnisse legen nahe, dass miRNAs in dem Kulturmedium außerhalb des exosomalen Fraktion existieren können, obwohl angenommen RNAs werden von RNasen geschützt werden, wie in Exosomen verpackenden. Insbesondere im Vergleich zu adhärenten Zellen war das Inkrement der RNA-Ausbeuten bemerkenswert grßer in schwimmenden Zellen (NCI-H69 und Lu-135) oder Zellen mit Mischungs Populationen von schwimmenden und haftenden Zellen (Colo205), die durch Kontamination reflektiert werden kann, von RNAs vergossen aus lysierten Zellen, die in Kulturmedien kontinuierlich gelassen wurden.

miRNA Profilierung von Microarray-Analyse

miRNA-Profile in den intra- und extrazellulären Fraktionen von Microarray-Analyse für sieben Krebszelllinien, einschließlich AZ- bestimmt wurden 521, AZ-P7a, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 und SW620. Proben von Kulturmedien sowie Exosomen bereitgestellt Hybridisierungssignale (Figur 3), was auf die Existenz von miRNAs in diesen Proben. Bis in die Gegenwart, Microarray-Daten für miRNA unter den Proben zu analysieren, haben keine klaren Verfahren für die Normalisierung der Signalintensität, seit es ist schwierig, eine geeignete interne Standardmaterial [34] zu finden. Somit haben miRNA Microarray-Daten im allgemeinen ohne Normalisierung analysiert, unter der Annahme, daß die Gesamtmengen von Eingangs RNAs unter den Proben konstant sind [34], [35]. In dieser Studie, nachdem Microarray-Daten zwischen zwei Replikaten miRNA durchschnittlich belegten wir miRNAs entsprechend ihrer Signalintensitäten. Wir fanden, dass let-7-miRNA-Familie wie let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7 g, und let-7i wurden in den meisten mit relativ hohen Signale erkannt der intrazellulären Fraktionen aus den sieben Zelllinien (Tabelle 1, Abbildung 3). Jedoch keine oder nur geringe Signalintensitäten für die let-7 miRNAs wurden in den extrazellulären Fraktionen mit Ausnahme sowohl extrazelluläre Fraktionen von AZ-P7a Zellen und Kulturmedium-Fraktion aus NCI-H69-Zellen (Tabelle 1, Abbildung 3) nachgewiesen. Insbesondere sowohl in den extrazellulären Fraktionen aus AZ-P7a Zellen, alle acht let-7-miRNAs erkannt wurden, obwohl der Rang von let-7 g war geringer als bei anderen sieben let-7-miRNAs. Basierend auf den unterschiedlichen Mustern von let-7-miRNA Ebenen unter den drei Zellfraktionen, teilten wir die sieben Zelllinien in drei Gruppen (Abbildung 3) wie folgt; (1) AZ-P7a, Zellen, die let-7-miRNAs in allen drei Fraktionen gefunden wurden, (2) AZ-521 zusammen mit SBC-3, DMS53, SW480 und SW620 Zellen, die let-7-miRNAs allgemein gefunden wurden nur die intrazelluläre Fraktionen, (3) NCI-H69 Zellen, die let-7-miRNAs wurden in den intrazellulären Fraktionen sowie in dem Kulturmedium zu einem gewissen Grad gefunden.

RT-PCR-Analysen der intrazellulären und extrazellulären Buchsta- 7 miRNA Familie

Wir führten dann quantitative RT-PCR für die acht let-7-miRNA-Familie der Microarray-Daten zu validieren. let-7-miRNAs wurden in den intrazellulären und extrazellulären Fraktionen aus AZ-P7a Zellen (4A) und AZ-521-Zellen (4B) leicht erkannt. Die Niveaus der let-7-miRNAs pro Eingang RNAs waren im Allgemeinen höher in den extrazellulären Fraktionen aus AZ-P7a Zellen als von AZ-521-Zellen. Für das Niveau der Ziel miRNAs, die durch RT-PCR zu normalisieren, U6 snRNA wurde als interne Kontrolle verwendet. Wir beobachteten die Anwesenheit von U6 snRNA in allen drei Fraktionen von AZ-P7a Zellen und AZ-521-Zellen (4C) und verglichen dann die Ebenen der let-7-miRNAs zwischen den entsprechenden Fraktionen, die aus diesen beiden Zelllinien. Nach der Normalisierung, einschließlich die Höhe der let-7 miRNAs let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, und let-7i in beiden Fraktionen von Exosomen und Kulturmedien von AZ-521-Zellen wurden abgesenkt, wie von AZ-P7a Zellen mit denen verglichen. Im Gegenteil gab es keinen großen Unterschied in den Niveaus der intrazellulären let-7-miRNAs. Wir verglichen nächstes das Niveau der exosomalen let-7a von AZ-P7a Zellen mit denen von anderen Krebszelllinien, einschließlich SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 und SW620, und stellte fest, dass die let-7a-Ebene nur von SW620 Zellen relativ nahe war (0,7 mal) auf das Niveau von AZ-P7a-Zellen (4E). Es sollte bemerkt werden, dass die intrazelluläre Konzentration von let-7a von SW620 Zellen war etwa 3,5-mal häufiger als die von AZ-P7a Zellen. Basierend auf diesen Ergebnissen haben wir angenommen, Lokalisierung von let-7a in den Fraktionen von Zellen und Exosomen (Abbildung 5), und eine weitere Analyse durchgeführt. durch die U6 Ebenen Normalized, wir relativen Pegel von let-7a verpackt in Exosomen pro den Ebenen der zellulären let-7a (4F) berechnet. Als Ergebnis war die Menge an exosomalen let-7a viel größer in AZ-P7a Zellen als andere sechs Zellen, was darauf hindeutet, dass AZ-P7a Zellen selektiv wurden und aktiv Familie let-7-miRNA sekretiert in die extrazelluläre Umgebung über Exosomen.

Diskussion

In der vorliegenden Studie zeigten wir, dass let-7-miRNA-Familie in die extrazelluläre Umgebung über exosomalen Transport ausgeschieden wurde, die Magenkrebs-Zelllinie, AZ-P7a zu einem metastatischen spezifisch war. let-7-miRNA-Familie in der menschlichen besteht aus 10 Sequenzen aus 13 Vorstufen [30]. Im Allgemeinen let-7 miRNAs als Tumorsuppressor wirken, indem sie auf Onkogene wie RAS
und HMGA2
und let-7 miRNAs sind bei vielen Krebsarten von soliden Organen nach unten reguliert [31]. AZ-P7a Zellen besitzen eine Metastasierungsfähigkeit mit Peritonealdialyse Verbreitung in Nacktmäusen [32], [33]. Daher schlagen wir vor, dass die exosomalen Freisetzung von let-7 miRNAs in die extrazelluläre Umgebung führt zu einer Abnahme der anti-tumorigenen Wirkung in den Zellen, die ihre oncogenesis und Invasivität zu halten führen. Auf der anderen Seite, let-7 miRNAs weniger häufig eine onkogene Funktion spielen, aufgrund von Hypomethylierung der Expression zu erhöhen an der let-7-Locus [36] oder Caspase-3-mRNA-Targeting [37]. In diesem Fall kann die exosomalen Freisetzung von let-7 miRNAs verursachen Transformation in den Zielzellen durch ihre onkogenen Eigenschaften zu übertragen.

Bei Patienten mit Lungenkrebs, erhöhen die Gesamtniveaus Exosomen und ihrer miRNAs im Vergleich zu Kontrollen [8 ]. Es hat sich gezeigt, dass Tumor Exosomen bei Krebserkrankungen durch spontane T-Zell-Apoptose [38] Immunevasionsmechanismus induzieren - [40]. In dieser Studie haben wir homogene Morphologie und Anreicherung von RNAs in Exosomen aus metastatischen AZ-P7a Zellen gezeigt. Dies kann durch ihre tumorigenicity widerspiegeln.

miRNAs sind sehr stabil im Blutplasma und Serum, da von RNasen geschützt [17]. So macht es miRNA Ebenen für die klinische Diagnostik als Tumormarker und Biomarker getestet. Wie kommt es dazu? Chin et al. haben zwei Hypothesen für die Quelle von miRNAs vorgeschlagen Blutproben auf zirkulierende; es kann zu einem Ergebnis von Tumor Zelltod und Lyse oder Freisetzung von Tumorzellen in die extrazelluläre Mikroumgebung der Blutgefäße [19] liegen. Im Gegensatz zu adhärenten Zellen beobachteten wir, dass die Mengen an Gesamt-RNAs in Kulturmedien waren relativ höher als in Exosomen für Zellen mit Floating-Eigenschaft wie NCI-H69, Lu-135 und Colo205. Dieser Zuwachs resultiert wahrscheinlich in der Kontamination von RNAs aus toten Zellen in Kulturmedien.

Für die Entdeckung von neuen Bluttumormarker und Biomarkern, omics Ansätze Proteomik und Transkriptomik einschließlich durchgeführt werden entweder durch die direkte Analyse von Blutproben oder Anwendung Profilierung in Gewebeproben. Es gibt widersprüchliche Berichte, ob ob die Profile von miRNA und mRNAs in Blut sind parallel mit dem Profil des Tumors. Die Unterschrift des exosomalen miRNAs spiegelt wider, dass der Ursprung von Tumorzellen bei Patienten mit Adenokarzinom der Lunge [8] und Brustkrebs [41]. Auf der anderen Seite, Skog et al. dass die Microarray-Analyse für die mRNA von Glioblastomzellen und den entsprechenden Exosomen ergab mRNAs ausschließlich detektiert in Mikrovesikel, spekulieren, dass mRNAs sind lokalisiert auf einen bestimmten Bereich des Zytoplasmas [3] abgeleitet gezeigt haben. Zusätzlich Tanaka et al. haben gezeigt, dass das Niveau der miR-92a im Blutplasma von akuter Leukämie-Patienten verringert, während seine starke Expression in den Gewebeproben [24] gefunden wurde. Unsere Ergebnisse auf selektiven Anreicherung von let-7-miRNA-Familie in AZ-P7a Zellen abgeleiteten Exosomen fit mit letzteren Fall. Es sei denn, Zielmoleküle miRNAs abgeleitet von zirkulierenden Tumorzellen sind, schlägt sie eine sorgfältige Untersuchung benötigt werden miRNA Profile in Gewebeproben zum Nachweis in Serum- oder Plasmaproben verwendet werden.

Da Exosomen in hämatopoetische Zellen sowie Epithelzellen produziert werden , Blut zirkulierenden enthält Exosomen aus beiden Arten von Zellen abgeleitet. Im allgemeinen exosomalen Profile von Proteinen, mRNAs und miRNAs in Serum und Plasma, Exosomen, die von Tumoren epithelialen Eigenschaften werden getrennt von den aus hämatopoetischen Zellen [8], [13] zu untersuchen. Dies wird unter Verwendung von Affinitätsreinigung mit Antikörpern gegen Moleküle durchgeführt wie EpCAM, die auf der Oberfläche von Epithelzellen exprimieren. Unsere Ergebnisse, dass es ähnliche Mengen von let-7-miRNA Familie zwischen Exosomen und Kulturmedien von AZ-P7a Zellen deuten darauf hin, dass diese miRNA Ebenen Exosomen aus klinischen Proben, wie Serum und Plasma ohne Isolierung gemessen werden kann.

Abschließend zeigte diese Studie, dass let-7-miRNA Familie Magenkrebs-Zelllinie, AZ-P7a Zellen in Exosomen von einem metastatischen reich ist. Da let-7-miRNAs in Proliferationsprozess beteiligt sind [31], können ihre exosomalen Sekretion eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung und Metastasierung spielen.

Materialien und Methoden

Zellkultur

menschliche Magenkrebs-Zelllinien (AZ-521, MKN45, KatoIII und NUGC-3), menschlichen Lungenkrebszelllinien (SBC-3, Lu-65, Lu-135 und KNS-62), und der menschlichen Pankreas-Krebszellen ( Anzug-2) wurden von der japanischen Sammlung von Forschungs Bioresources erworben. Menschlicher Magen Krebszellen (SNU-1), menschlichen Lungenkrebszelllinien (DMS-53, DMS114, NCI-H69, A549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SK-MES-1, und HCC827), menschliches Mesotheliomzellen (Msto-H211), menschliche Darmkrebs-Zelllinien (SW480, SW620, Colo205, LoVo und HCT116, menschlichen Pankreas-Krebszelllinien (BxPC-3, AsPC-1, Panc-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45 und Capan-2), Linien menschliche Prostatakrebszelle (PC-3, SU145 und LNCaP) und menschlichen Brustkrebszelllinien (T-47D, MCF7, SK-BR-3, BT -474 und MDA-MB-231) wurden von der American Type Culture Collection. MKN28 (menschliche Magenkrebszellen) und PSN-1 (menschlichen Pankreas-Krebszellen) wurden von Immuno-Biological Laboratories und European Collection of Cell Culture Artikel erworben bzw. . Menschliche Zelllinien Magenkrebs, AZ-P7a [32], [33] und MKN45P [42] waren Geschenk von Drs. Yutaka Yonemura und Yoshio Endo. In AZ-521 und AZ-P7a Zellen wurden keine RT-PCR-Produkte beobachtet 14 Retroviren einschließlich HPV16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, HIV1, HIV2, und ADV Typ 1 (Daten nicht gezeigt), die durch diese Retroviren in beiden Zelllinien ohne Infektion . Zellen wurden in RPMI-1640-Medium (Sigma-Aldrich) supplementiert mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (Invitrogen), 100 U /ml Penicillin und 0,1 mg /ml Streptomycin.

Produktion und Isolation beibehalten von Exosomen

adhärenten Zellen wurden im Bereich von 3 x 10 an geeigneten Anzahl von Zellen auf 150 mm-Schalen ausgesät ^{6: 1 x 10 7 Zellen pro Schale, während schwebenden Zellen in 75 beimpft cm 2-Kolben bei 2~2.5 × 10 7 Zellen pro Kolben. Zellen wurden in komplettem RPMI-1640-Medium mit 25 ml und 50 ml für Geschirr und Kolben, jeweils für 24 h bei 37 ° C und 5% CO _{2, zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, und inkubiert 48 h in Phenolrot-freiem RPMI-1640-Medium (Sigma-Aldrich) 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum enthält, die zuvor aufgebraucht Mikrovesikel kontaminierenden über Nacht Zentrifugation bei 100.000 × g. Exosomen wurden aus den gesamten Zellen isoliert im Bereich von 6 × 10 7 bis 3 × 10 8 Zellen wie zuvor beschrieben [29]. In Kürze, Kulturmedium wurde bei 800 × g für 5 min und zusätzliche 2.000 × g für 10 min gesammelt und zentrifugiert, um Zellen zu entfernen angehoben. Der Überstand wurde auf eine 0,1 &mgr; m Poren Polyethersulfon-Membranfilter (Corning) filtriert, um Zellbruchstücke und große Vesikel zu entfernen, gefolgt von einer Konzentration durch eine 100.000 MG Rückhaltemembran (Centriplus-70, Millipore). Das Volumen der Überstand wurde auf etwa 30 ml von etwa 250-500 ml reduziert. Der Überstand wurde dann bei 100.000 × g für 1 h bei 4 ° C unter Verwendung 70Ti Rotor (Beckman Coulter) ultrazentrifugiert. Die resultierenden Pellets wurden in 6 ml PBS und ultrazentrifugiert bei 100.000 × g für 1 h bei 4 ° C unter Verwendung 100Ti Rotor (Beckman Coulter) resuspendiert.}}

Transmissionselektronenmikroskopie

Die pelletierten Exosomen gemischt mit gleichen Mengen frisch hergestellten 2% Glutaraldehyd in PBS, inkubiert über Nacht bei 4 ° C mit 1% Osmiumtetroxid in PBS bei 4 ° C für 2 h und dehydratisiert in einer abgestuften Reihe von Ethanol nachfixiert. Folgende Dehydratisierung wurden die Proben für Propylenoxid überführt und in Epoxidharz Quetol 812 (Nisshin EM) eingebettet. Ultradünne Schnitte wurden mit Ultracut UCT (LEICA) geschnitten, gefärbt mit Uranylacetat und Bleizitrat und beobachtet mit dem JEM-1230-Elektronenmikroskop (JEOL). Immunoelektronenmikroskopie mikroskopische Analyse wurde nach dem Verfahren von Xiao et al beschrieben durchgeführt. [43] mit geringfügigen Änderungen. Kurz gesagt, wurden Exosomen gemischt und mit Maus anti-human CD63 monoklonalem Antikörper inkubiert (Katalog Nr. Sc-51662, Santa Cruz) für 1 h bei Raumtemperatur. Die Probe wurde der Membranoberfläche eines Kupfernetz fiel auf 1 h bei Raumtemperatur inkubiert (collodion /Kohlenstoff 400 mesh, Nisshin EM-beschichtet). Nach Waschung mit PBS, Immunogold-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG (Katalog Nr. EM.GMHL15, BBInternational) um 1:20 verdünnt wurde, auf die Membran getropft. Das Kupfergeflecht wurde 30 min in den Tröpfchen mit seiner Membranoberfläche nach unten zeigt bei Raumtemperatur flotiert. Nach dem Waschen mit PBS wurde Uranylacetat Tropfen auf die Kupferoberfläche mesh gegeben und bei Raumtemperatur für 30 s gefärbt. Exosomen mit schwarzem kolloidalen Goldpartikel auf den Kapselmembranen wurden als positiv unter dem Transmissionselektronenmikroskop markiert.

Western blot analysis

Zellen und exosomalen Fraktionen wurden gewaschen, in einem Lysepuffer [7,5 M Harnstoff (Sigma-Aldrich), 2,5 M Thioharnstoff (Sigma-Aldrich), 12,5% Glycerin (Wako), 50 mM Tris, 2,5% n-Octyl-beta-D-glucosid (Sigma-Aldrich), 6,25 mM Tris (2- carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (Sigma-Aldrich), 1,25 mM Proteaseinhibitor (Katalog-Nr. P2714, Sigma-Aldrich)] und inkubiert für 1 h bei 4 ° C, um den Rotator RT-50 (TAITEC verwenden). Nach Zentrifugation bei 14000 × g für 60 min bei 4 ° C wurde der Überstand gesammelt und die Proteinkonzentration durch Bradford-Protein-Assay-Kit (Bio-Rad) bestimmt wurde. Ein Teil der Proteine ​​(10 ug) wurden durch Kochen in Laemmli-Probenpuffer denaturiert, auf 10% SDS-Polyacrylamid-Gelen laufen und auf Immobilon-P PVDF-Membranen (0,45 um Porengrße, Millipore). Die Blots wurden für 1 h mit 5% fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Saline Tween 20 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl und 0,01% Tween 20) enthält, blockiert. Nach dem Blockieren wurden die Membranen mit jedem primären Antikörper oder Antiserum, einschließlich Kaninchen-anti-Tsg101-Serum (Katalog-Nr. T5951, Sigma-Aldrich), Ziege-anti-Aip1 /Alix Serum (Katalog Nr. Sc-49268, Santa Cruz), Maus monoklonaler anti-CD29 /β1-Integrin (Katalog Nr. sc-610.468, BD Biosciences) und monoklonalen Maus-anti-Bip /Grp78 (Katalog-Nr. 610.979, BD Biosciences) bei einer Verdünnung von 1:200 1 h bei Raumtemperatur. Die Blots wurden dann mit dem entsprechenden anti-IgG Sekundärantikörper, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (Jackson Laboratories) in einer Verdünnung von 1:2,000 für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Spezifische Proteine ​​wurden unter Verwendung des ECL-Systems (GE Healthcare) und die FUJILeuchtBild Analyzer LAS3000 (Fuji Film) sichtbar gemacht. Das Molekulargewicht Protein wurde mit der Precision Plus Protein Standards (Bio-Rad Laboratories).

RNA Isolation

Für die RNA-Isolierung aus dem Kulturmedium wurden die Zellen wie oben beschrieben. 48 h nach gewachsen Kulturmedium wurde für 5 min und weitere 2.000 × g für 10 min bei 800 × g gesammelt und zentrifugiert. Der Überstand wurde auf einem 0,22 um Poren Polyethersulfon-Membranfilter (Corning) filtriert, gefolgt von Konzentration mit einem 5.000 Mw Cut-off-Membran (Centricon Plus-70-, Millipore). Das Endvolumen des Überstandes wurde etwa 10-20 ml aus dem ursprünglichen Volumen von 250-500 ml. Der Überstand wurde mit einem gleichen Volumen QIAzol Lysis Reagent (Qiagen) gemischt und anschließend das Verfahren zur RNA-Isolierung weiter unten beschrieben. Gesamt-RNA wurde aus Zellen, Exosomen, oder Kulturmedien mit Hilfe der miRNeasy Mini Kit (Qiagen) gemß den Herstelleranweisungen isoliert. Zu entfernen genomische DNA, 40 &mgr; g zellulärer Gesamt-RNA wurden mit 40 Einheiten von RNase-Free RQ1 DNase (Promega) für 30 min in Gegenwart von 40 Einheiten RNasin Plus-RNase-Inhibitor (Promega) bei 37 ° C inkubiert. Für Gesamt-RNA aus Exosomen und Kulturmedien, sind alle Mengen Rohprodukte wurden in dem gleichen Verfahren, außer der Verwendung von 5 U DNase behandelt. RNA wurde gereinigt, um die RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die RNA-Proben wurden mit einem Nanodrop Spektralphotometer (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert und bewertet die Agilent Small RNA Kit und die Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).

Microarray-Analyse

Für miRNA Profiling, 100 ng und 20 ng von zellulären und extrazellulären gesamt-RNAs wurden jeweils fluoreszenzmarkierte die miRNA komplette Markierungsreagens und Hyb Kit (Agilent Technologies) gemäß Herstellerprotokoll (Agilent miRNA-Microarrays Version 2.2). Die umfassende miRNA-Analyse wurde mit der Menschen miRNA Microarray Kit (8 × 15 K) Ver.3.0 (Agilent) durchgeführt. Die Hybridisierungssignale wurden mit der DNA-Microarray-Scanner (Agilent Technologies) nachgewiesen. Die gescannten Bilder wurden unter Verwendung der Agilent Feature Extraction Software und Daten analysiert Analyse wurde die Genespring GX-Software (Agilent Technologies) verwenden. Die Daten in diesem Manuskript besprochen haben in NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) und sind über GEO Serie Zugangsnummer GSE21350 hinterlegt worden: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE21350).

reversen Transkription (RT) und quantitative RT-PCR für die miRNA-Analyse

quantitative miRNA-Spiegel wurden mit dem Applied Biosystems 7900 HT Sequence Detection System real-time RT-PCR ermittelt (Applied Biosystems), TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) für den menschlichen let-7a (Test ID 000377), let-7b (Test ID 002619), let-7c (Test ID 000379), let-7d (Test ID 002283 ), let-7e (Test ID 002406), let-7f (Test ID 000382), let-7 g (Test ID 002282), let-7i (Test ID 002221) und U6 snRNA (Test ID 001973) als endogene Kontrolle . Zehn ng Gesamt-RNA wurden einer reversen Transkription mit TaqMan ® Universal-PCR Master Mix Nr AmpErase (Applied Biosystems) und den jeweiligen TaqMan ® Reagenzien für die Zielgene. RT-PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 20 &mgr; l Reaktionsmischung nach dem Hersteller-Protokoll durchgeführt. Die Amplifikation wurde wie folgt durchgeführt: 95 ° C für 10 min, 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 60 s. Die Proben wurden in dreifacher Ausfertigung als biologische Replikation oder vierfacher Ausfertigung als technische Replikation analysiert. Die miRNA-Spiegel wurden aus dem Zyklus Schwellenwert (Ct), dem Vergleichs Ct Methode und Normalisierung durch die Höhe der U6 snRNA in jeder Probe definiert. Falten, erhöht oder verringert in jeder miRNA Ebene von Zelllinien wurden unter Bezugnahme auf die Ebene der AZ-P7a Zelllinie getestet bestimmt.

Acknowledgments

Wir danken den Mitgliedern des Shizuoka Cancer Center Research Institute für die vielen hilfreichen Anregungen. Wir danken auch Drs. Yutaka Yonemura und Yoshio Endo für Geschenk von AZ-P7a und MKN45P Zelllinien.

• PLoS ONE: Ein Gene Expression Unterschrift des Acquired Chemoresistenz zu Cisplatin und Fluorouracil Kombinationschemotherapie bei Patienten mit Magenkrebs
• PLoS ONE: Hypoxie-induzierbaren Faktor 1α Bestimmt Magenkrebs Chemosensitivity über Modulation von p53 und NF-kappaB