PLOS ONE: Let-7 microARN famille est sélectivement sécrété dans le milieu extracellulaire via exosomes dans une cellule du cancer gastrique métastatique Line

Résumé

Contexte

Les exosomes jouent un rôle majeur dans la cellule à communication -cell, ciblant les cellules pour transférer des molécules exosomales y compris les protéines, les ARNm et les microARN (miARN) par une voie d'endocytose-like. miARN sont de petites molécules d'ARN non codante en moyenne de 22 nucléotides de longueur qui régulent de nombreux processus biologiques, y compris la pathogenèse du cancer et médient gène régulation vers le bas en ciblant les ARNm pour induire la dégradation de l'ARN et /ou d'interférer avec la traduction. Des rapports récents impliquent que miARN peuvent être stablement détectés dans la circulation plasma et le sérum depuis miARN sont emballés par exosomes à l'abri de la dégradation de l'ARN. Ainsi, le profilage miARN exosomales sont dans le besoin de clarifier la signalisation intercellulaire et découvrir un marqueur de maladie roman aussi bien.

Méthodologie /Principales constatations

exosomes ont été isolés à partir de lignées de cellules cancéreuses cultivées et leur qualité a été validé des analyses par microscopie électronique à transmission et un transfert de western. Une des lignées cellulaires testées, une lignée cellulaire de cancer gastrique métastatique, AZ-P7a, a montré le rendement le plus élevé d'ARN dans les exosomes libérés et forme distinctive de la morphologie. En outre, les ARN ont été isolés à partir des cellules et des milieux de culture et les profils de ces trois fractions de miARN ont été obtenus en utilisant une analyse de puces à ADN. En comparant les intensités de signaux de données de puces à ADN et la validation suivante en utilisant une analyse par RT-PCR, nous avons constaté que let-7 famille miRNA était abondante à la fois intracellulaire et les fractions extracellulaires de cellules AZ-P7A, tandis que faible métastatique AZ-521, la cellule parentale ligne de AZ-P7a, ainsi que d'autres lignées cellulaires de cancer a montré aucune propension.

Conclusions /importance

l'enrichissement de let-7 famille miRNA dans les fractions extracellulaires, en particulier, dans le exosomes de cellules AZ-P7A peuvent refléter leurs caractéristiques oncogènes, y compris la tumorigenèse et la métastase. Depuis let-7 miARN jouent généralement un rôle de tumeur-suppressive que le ciblage oncogènes tels que RAS
et HMGA2
, nos résultats suggèrent que les cellules AZ-P7A libèrent let-7 miARN via exosomes dans le environnement extracellulaire à maintenir leur oncogenèse

Citation:. Ohshima K, Inoue K, Fujiwara A, Hatakeyama K, Kanto K, Watanabe Y, et al. (2010) Let-7 microARN famille est sélectivement sécrété dans le milieu extracellulaire via exosomes dans la cellule d'un cancer gastrique métastatique Line. PLoS ONE 5 (10): e13247. doi: 10.1371 /journal.pone.0013247

Editeur: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Allemagne

Reçu le 14 Avril 2010; Accepté 10 Septembre 2010; Publié 8 Octobre, 2010

Droit d'auteur: © 2010 Ohshima et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Le travail a été soutenue par une subvention en coopération avec la technologie innovante et de la recherche avancée dans la zone Evolutional (ZONE dE VILLE) du ministère de l'Education, Culture, sports, science et technologie du Japon. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

les cellules sécrètent différents types de petites vésicules membranaires. Les exosomes sont l'un des vésicules ayant un diamètre de 30 à 100 nm et physico-chimiquement distinctes des autres vésicules sécrétées [1]. Inside exosomes, produits de gènes cellulaires, y compris les protéines, les ARNm et les microARN (miARN) sont emballés et ces molécules peuvent être transférées à des cellules réceptrices de livrer leur signalisation moléculaire tel que l'oncogenèse [2] - [4] et la réponse immunitaire [1], [ ,,,0],5]. Les exosomes sont libérés par de nombreux types de cellules [6], qui comprennent des cellules tumorales, des cellules épithéliales et des cellules hématopoïétiques telles que les réticulocytes, lymphocytes T cytotoxiques, les lymphocytes B transformées par le virus d'Epstein-Barr, les mastocytes, les cellules dendritiques et les plaquettes. exosomes sécrétés ont été isolés et caractérisés in vitro
à partir de lignées cellulaires cultivées [7] ainsi que in vivo
dans les liquides organiques [7] y compris le sang [8], l'urine [9], de la salive [10], le liquide amniotique [11], et un épanchement pleural malin [12]. Etant donné que observée dans de nombreux types de cellules qui prolifèrent, il est concevable d'exacerber les cellules tumorales, comme en témoigne la présence accrue dans le plasma et les épanchements pleuraux des patients atteints d'un cancer [8], [12]. Cette présence accrue dans les fluides corporels non-invasives de patients atteints de cancer a accéléré au profil des composants moléculaires dans les exosomes pour découvrir des marqueurs et des biomarqueurs de tumeur cliniquement utiles [3], [7], [13].

miARN sont classe de petits ARN non codantes qui sont impliqués dans la régulation post-traductionnelle de l'expression génique en inhibant à la fois la stabilité et la traduction des ARNm [14]. Des données récentes ont montré que des mutations miRNA ou misexpression en corrélation avec divers cancers humains et indiquent que certains miARN peuvent fonctionner comme oncogènes ou suppresseurs de tumeur [15], [16]. Pour analyser ARNs, il est toujours à considérer leur stabilité de la dégradation par la RNase. Des résultats récents montrent que les miARN plasmatiques endogènes dans des échantillons de sang sont stablement détectable sous une forme qui est résistant à l'activité de RNase [17], mis en évidence par l'identification des miRNAs dans les fluides corporels tels que le sang [17] - [24], l'urine [25], et de la salive [10], [26].

cellules cancéreuses en culture ont été utilisés pour rechercher des marqueurs tumoraux. En particulier, l'identification des protéines et des peptides sécrétés dans le milieu de la culture a mis au point par approche fondée sur la protéomique-[27], [28]. Quant à la signature moléculaire dans les exosomes, la protéomique ainsi que des analyses de transcriptomique ont été effectués pour révéler la tumorigenèse et identifier les candidats des marqueurs tumoraux [2] - [4], [7], [29]. Ici, pour identifier les miARN liée à la tumorigenèse et la métastase, nous avons effectué une analyse approfondie des miRNA en trois fractions cellulaires, y compris les cellules, les exosomes, et moyen de cellules cultivées. Classement des données de ces miARN intracellulaires et extracellulaires obtenus par l'analyse des microréseaux, nous avons constaté que la famille let-7 miARN est riche dans toutes les fractions de cellules AZ-P7A, une ligne métastatique gastrique des cellules cancéreuses, ce qui produit une morphologie homogène et condensé, et de récupération élevés taux de miARN exosomales. Ces résultats étaient distincts des autres lignées cellulaires, y compris des lignées de cellules de cancer du poumon (SBC-3, NCI-H69, et DMS53), des lignées cellulaires du cancer colorectal (SW480 et SW620), et AZ-521, la lignée cellulaire parentale de AZ-P7a. Considérant que les fonctions let-7 familles miRNA principalement des gènes suppresseurs de tumeur [30] pour cibler oncogènes tels que RAS
et le groupe de mobilité élevée A2 ( HMGA2
) [31], nous proposons que AZ -P7a cellules sécrètent sélectivement let-7 miARN dans le milieu extracellulaire via exosomes pour maintenir leurs propensions tumorigènes et métastatiques.

Résultats

Isolation des exosomes provenant de lignées cellulaires différentes de cancer

les exosomes sont produites à partir de cellules internes à l'environnement extracellulaire par l'intermédiaire d'une voie d'exocytose-like [1]. En plus des fluides corporels tels que le sérum ou le plasma à partir du sang périphérique [7], [8], les exosomes sont présents dans le milieu de cellules cultivées [7], ce qui facilite l'identification des molécules exosomales, y compris des protéines, des ARNm et des miARN pour le but pour leur utilisation clinique. Le profilage de telles molécules exosomales produites dans les cellules cancéreuses en culture ont conduit à la découverte d'un nouveau marqueur et d'antigène candidat pour le diagnostic d'un cancer et une immunothérapie [7]. Dans cette étude, en vue de profiler miARN exosomales, nous avons d'abord isolé des exosomes à partir de milieux de culture de lignées cellulaires 46 cancéreuses avec différents types de tissus, dont 8 pour l'estomac, 16 du poumon, de 5 pour côlon, 9 pour le pancréas, le 3 pour la prostate et 5 pour la poitrine. Après que les cellules ont été cultivées pendant 48 h, les exosomes ont été recueillies par une combinaison de centrifugation successives et le poids moléculaire des membranes de coupure tel que décrit dans Matériels et Méthodes. Leur pureté des fractions exosomales a été évaluée par des analyses de microscopie électronique à transmission et un transfert de Western. La microscopie électronique à transmission montre des structures de membranes vésiculaires en forme de tour approximativement à la taille de 100 nm de diamètre. Parmi les trois lignées cellulaires, SBC-3, Z-521 et Z-P7a, il est intéressant de noter que la morphologie des cellules AZ-P7A était plus homogène et condensé à d'autres cellules (figure 1A). La microscopie immuno-électronique a montré que les particules extra-cellulaires isolés à partir du milieu de culture de cellules AZ-P7A ont immunoréactivité avec un anticorps dirigé contre CD63, l'une des protéines de la membrane exosomal, sur les membranes capsulaires (figure 1B). La présence de protéines exosomales connues, y compris CD29 /β1 intégrine, AIP1 /Alix et tumeur gène de susceptibilité 101 (Tsg101) a été confirmée par une analyse par transfert de Western, tandis qu'une protéine localisée dans le réticulum endoplasmique, Bip /Grp78, était indétectable (figure 1C). Ce résultat indique que la contamination des matières provenant d'autres compartiments cellulaires dans les fractions exosomales était minime. Le rendement des protéines à partir de cellules exosomales AZ-P7A était 10 fois plus élevé que celui de A à Z-521 cellules; ~2.5 Protéines mg ont été obtenus à partir de 1 × 10 ^{8 cellules AZ-P7A.}

Enrichissement des ARNs exosomales dérivées de cellules AZ-P7A

Après isolement, ARN totaux ont été isolés de exosomales 46 lignées cellulaires cultivées. Fait intéressant, les rendements d'ARN à partir de cellules AZ-P7A étaient beaucoup plus grandes que celles des autres cellules (figure 2A). La répartition en longueur a montré la présence de grandes quantités de petits ARN dans les exosomes (panneau central, la figure 2B). Il convient de noter qu'il existe une différence significative dans les exosomes total et le taux exosomales miRNA entre les patients atteints d'un adénocarcinome pulmonaire et des commandes [8]. lignée cellulaire AZ-P7a a été établie par inoculation répétée des cellules parentales AZ-521 chez des souris, a donné lieu à un potentiel péritonéale métastatique élevée [32], [33]. Ainsi, les rendements élevés de l'ARN et des protéines ainsi que les caractéristiques morphologiques dans les cellules AZ-P7A peuvent être attribués à leurs propensions tumorigènes et métastatiques élevées. Depuis miARN ont été détectés dans les fluides corporels exempts de cellules [17] - [20], nous avons également effectué l'isolement direct des ARN totaux de milieu de culture sans procédure pour isoler les exosomes. Les quantités d'ARN totaux provenant des milieux de culture sont généralement supérieures à celles des exosomes (figure 2A). la distribution de l'ARN de longueur a montré que les fractions de miARN ont été détectées dans la plage de 10 à 40 Longueur de nucléotides dans les ARN préparés à partir du milieu de culture (à droite) ainsi que les exosomes (panneau central) à partir des cellules AZ-P7A (figure 2B). D'après le protocole du fabricant pour Bioanalyseur, des pics ayant plus de 40 la longueur de nucléotides contiennent d'autres petits ARN, y compris ARNt à 70~90, 5S ribosomal RNA à 100 et 5.8S ARN ribosomal à 150, comme observé dans la fraction intracellulaire (panneau de gauche) . Ces résultats suggèrent que les miARN peuvent exister dans le milieu de culture en dehors de la fraction exosomal bien que les ARN sont soupçonnés d'être protégés contre les RNases comme étant emballés dans des exosomes. En particulier, par rapport aux cellules adhérentes, l'augmentation des rendements en ARN était remarquablement plus élevé dans les cellules (NCI-H69 et Lu-135) ou des cellules flottantes avec des populations de mélange de flottement et les cellules adhérentes (Colo205), ce qui peut se traduire par une contamination de l'ARN versé à partir de cellules lysées, qui ont été laissés en continu dans un milieu de culture.

miARN profilage par analyse microréseau

miRNA dans les profils intracellulaires et extracellulaires, les fractions ont été déterminées par analyse de puces à ADN pour sept lignées cellulaires de cancer, y compris AZ- 521, AZ-P7a, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 et SW620. Les échantillons provenant de milieux de culture ainsi que des exosomes fournis des signaux d'hybridation (figure 3), ce qui indique l'existence de miARN dans ces échantillons. Jusqu'à présent, l'analyse des données de puces à ADN pour miRNA entre échantillons, pas de méthodes claires ont été prises pour la normalisation de l'intensité du signal, car il est difficile de trouver un matériau standard interne approprié [34]. Ainsi, les données de biopuces miARN sont en général analysées sans normalisation, en supposant que le montant total des ARNs d'entrée sont constants parmi les échantillons [34], [35]. Dans cette étude, après une moyenne de données de biopuces miARN entre deux répétitions, nous avons classé miARN selon leurs intensités de signal. Nous avons constaté que let-7 famille miRNA tels que let-7a, laissez-7b, laissez-7c, laissez-7d, laissez-7E, laissez-7f, laissez-7g, et laissez-7i ont été détectés avec des signaux relativement élevés tout au long de la plus des fractions intracellulaires des sept lignées cellulaires (tableau 1, figure 3). Cependant, aucune ou peu d'intensité de signal pour les miARN let-7 ont été détectés dans les fractions extracellulaires, à l'exception des deux fractions extracellulaires provenant de cellules AZ-P7A et la culture fraction moyenne à partir de cellules NCI-H69 (tableau 1, figure 3). En particulier, dans les deux fractions extracellulaires de cellules AZ-P7A, tous les huit let-7 miARN ont été détectés bien que le rang de let-7g était inférieure à sept autres let-7 miARN. Sur la base des modèles distincts de let-7 niveaux miRNA entre les trois fractions cellulaires, nous avons divisé les lignées cellulaires sept en trois groupes (figure 3) comme suit: (1) Z-P7a, les cellules qui let-7 miARN ont été trouvés dans tous les trois fractions (2), AZ-521 avec SBC-3, DMS53, SW480 et SW620, les cellules qui let-7 miARN sont généralement trouvés dans seules les fractions intracellulaires (3), NCI-H69, les cellules qui miARN let-7 ont été trouvés dans les fractions intracellulaires, ainsi que dans le milieu de culture dans une certaine mesure.

RT-PCR de l'analyse intracellulaire et extracellulaire let- 7 miRNA famille

Nous avons ensuite effectué RT-PCR quantitative pour le let-7 famille miRNA huit pour valider les données de puces à ADN. laissez-7 miARN ont été facilement détectés dans les fractions intracellulaires et extracellulaires de cellules AZ-P7A (Figure 4A) et AZ-521 cellules (figure 4B). Les niveaux de let-7 miARN par ARNs d'entrée étaient généralement plus élevés dans les fractions extracellulaires de cellules AZ-P7A que de AZ-521 cellules. Pour normaliser les niveaux de miARN cibles obtenus par RT-PCR, U6 snARN a généralement été utilisé comme témoin interne. Nous avons observé la présence de U6 snRNA dans toutes les trois fractions de cellules AZ-P7A et AZ-521 cellules (Figure 4C), puis comparé les niveaux de let-7 miARN entre les fractions correspondant à ces deux lignées cellulaires. Après normalisation, les niveaux de let-7 miARN y compris let-7a, laissez-7b, laissez-7c, laissez-7d, laissez-7E, et laissez-7i dans les deux fractions de exosomes et des milieux de culture de AZ-521 cellules ont été réduit par rapport à ceux provenant de cellules AZ-P7A. Au contraire, il n'y avait pas de grande différence dans les niveaux du intracellulaire miARN let-7. Nous avons ensuite comparé le niveau de exosomal let-7a à partir de cellules AZ-P7A avec celles d'autres lignées de cellules de cancer, y compris SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 et SW620, et a constaté que le niveau 7a laisser uniquement à partir de cellules SW620 était relativement proche (0,7 fois) au niveau des cellules AZ-P7A (Figure 4E). Il faut remarquer que le niveau intracellulaire de let-7a à partir de cellules SW620 a été d'environ 3,5 fois plus abondants que ceux provenant de cellules AZ-P7A. Sur la base de ces résultats, nous avons supposé la localisation de let-7a dans les fractions de cellules et exosomes (figure 5), et mené une analyse plus approfondie. Normalisé par les niveaux U6, nous avons calculé les niveaux relatifs de 7a laissez-emballés dans des exosomes par les niveaux de cellulaire let-7a (figure 4F). Par conséquent, la quantité de exosomal let-7a était beaucoup plus importante dans les cellules AZ-P7A de six autres cellules, ce qui suggère que les cellules AZ-P7A ont été sélectivement et activement sécrétés let-7 famille miARN dans l'environnement extracellulaire par l'intermédiaire d'exosomes.

Discussion

Dans la présente étude, nous a révélé que la famille let-7 miRNA a été sécrété dans le milieu extracellulaire par transport exosomal, qui était spécifique à une lignée cellulaire de cancer gastrique métastatique, AZ-P7a. let-7 miRNA famille humaine se compose de 10 séquences de 13 précurseurs [30]. En général, laissez-7 miARN agissent comme un suppresseur de tumeur par des oncogènes ciblant comme RAS
et HMGA2
et laissez-7 miARN sont downregulated dans de nombreux cancers d'organes solides [31]. cellules AZ-P7A possèdent une capacité métastatique avec la diffusion péritonéale chez la souris nude [32], [33]. Ainsi, nous proposons que la libération de exosomal de let-7 miARN dans les résultats de l'environnement extracellulaire dans la diminution de l'effet anti-tumorigène dans les cellules, qui conduisent à maintenir leur oncogenèse et l'invasivité. D'un autre côté, laissez-7 miARN jouent moins souvent une fonction oncogénique, due à l'augmentation de l'expression par hypométhylation au locus let-7 [36] ou le ciblage de la caspase-3 ARNm [37]. Dans ce cas, la libération de exosomal de let-7 miARN peut provoquer la transformation dans les cellules cibles en transférant leurs propriétés oncogéniques.

Chez les patients atteints d'un cancer du poumon, les niveaux totaux de exosomes et leurs miARN augmentation par rapport aux contrôles [8 ]. Il a été démontré que les exosomes tumorales induisent mécanisme d'échappement immunitaire dans les cancers de l'apoptose des cellules T spontanée [38] - [40]. Dans cette étude, nous avons montré une morphologie homogène et l'enrichissement des ARNs dans exosomes de cellules AZ-P7A métastatiques. Cela peut se traduire par leur tumorigénicité.

miARN sont très stables dans le plasma sanguin et le sérum depuis protégé de RNases [17]. Ainsi, il rend les niveaux de miARN testés pour le diagnostic clinique des marqueurs tumoraux et des biomarqueurs. Comment se fait-il? Chin et al. ont proposé deux hypothèses pour la source de miARN sur circulation des échantillons de sang; elle peut être due à un résultat de la mort des cellules tumorales et la lyse ou la libération par les cellules tumorales dans le microenvironnement extracellulaire des vaisseaux sanguins [19]. Au contraire des cellules adhérentes, nous avons observé que les montants des ARN totaux dans les milieux de culture ont été relativement plus élevé que dans les exosomes pour les cellules qui ont des biens flottants tels que NCI-H69, Lu-135, et Colo205. Cette augmentation a probablement entraîné la contamination des ARN à partir de cellules mortes dans les milieux de culture.

Pour la découverte de marqueurs et de biomarqueurs de tumeur de sang nouvelles, omique approches, y compris la protéomique et la transcriptomique sont menées soit par l'analyse directe des échantillons de sang ou de l'application du profilage dans des échantillons de tissus. Il y a des rapports contradictoires si si les profils de miARN et ARNm dans la circulation sanguine sont parallèles avec le profil de la tumeur. La signature des miARN exosomales reflète le fait que des cellules tumorales provenant des patients atteints d'un adénocarcinome pulmonaire [8] et le cancer du sein [41]. D'autre part, Skog et al. ont montré que l'analyse de puces à ADN pour l'ARNm provenant de cellules de glioblastome et les exosomes ont révélé des ARNm détectés exclusivement dans les microvésicules correspondants, spéculent que les ARNm sont localisées dans une région spécifique du cytoplasme [3]. En outre, Tanaka et al. ont démontré que le niveau de miR-92a a diminué dans le plasma sanguin de patients atteints de leucémie aiguë tandis que sa forte expression a été trouvée dans les échantillons de tissus [24]. Nos résultats sur l'enrichissement sélectif de let-7 famille miARN dans AZ-P7A exosomes ajustement avec ce dernier cas des cellules dérivées. A moins que les molécules cibles sont des miARN dérivées de cellules tumorales circulantes, on suggère examen minutieux sont nécessaires pour utiliser des profils de miARN dans des échantillons de tissu pour la détection dans des échantillons de sérum ou de plasma.

Etant donné que les exosomes sont produites dans les cellules hématopoïétiques ainsi que des cellules épithéliales , le sang circulant contient exosomes dérivés de deux types de cellules. D'une manière générale, pour étudier les profils exosomales des protéines, des ARNm et des miARN dans le sérum et le plasma, les exosomes issues de tumeurs ayant des caractéristiques épithéliales sont séparées de celles des cellules hématopoïétiques [8], [13]. Ceci est réalisé en utilisant une purification par affinité avec des anticorps contre des molécules telles que EpCAM exprimant sur la surface des cellules épithéliales. Nos résultats qu'il y avait des niveaux similaires de let-7 famille miRNA entre exosomes et milieux de culture de cellules AZ-P7A suggèrent que ces niveaux de miARN peuvent être mesurées sans isoler les exosomes à partir d'échantillons cliniques tels que le sérum et le plasma.

conclusion, cette étude a démontré que let-7 famille miARN est riche en exosomes à partir d'une lignée cellulaire de cancer gastrique métastatique, les cellules AZ-P7A. Depuis let-7 miARN sont impliqués dans le processus de prolifération [31], leur sécrétion de exosomal peut jouer un rôle important dans la tumorigenèse et la métastase.

Matériel et méthodes

culture
Cell

des lignées cellulaires de cancer de l'estomac humain (AZ-521, MKN45, KATOIII et NUGC-3) des cellules cancéreuses pancréatiques humaines, les lignées cellulaires de cancer du poumon humain (SBC-3, Lu-65, Lu-135, et KNS-62), et ( Suit-2) ont été achetés chez Collection japonaise de bioressources recherche. cellules de l'estomac humain du cancer (SNU-1), des lignées de cellules de cancer de poumon humain (DMS-53, DMS114, NCI-H69, A549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SK-MES-1, et HCC827), des cellules humaines de mésothéliome (MSTO-H211), des lignées humaines colorectales de cellules cancéreuses (SW480, SW620, Colo205, LoVo, et HCT116, des lignées cellulaires du cancer du pancréas humain (BxPC-3, AsPC-1, PANC-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45 et Capan-2), des lignes de la prostate humaine de cellules cancéreuses (PC-3, SU145, et LNCaP) et des lignées cellulaires de cancer du sein humain (T-47D, MCF7, SK-BR-3, BT -474, et MDA-MB-231) ont été achetés chez American type Culture Collection. MKN28 (cellules cancéreuses de l'estomac humain) et PSN-1 (cellules cancéreuses pancréatiques humaines) ont été achetés auprès de laboratoires Immuno-Biological et Collection européenne de la culture cellulaire, respectivement . lignées cellulaires de cancer de l'estomac humaines, AZ-P7a [32], [33] et MKN45P [42] étaient don de MM. Yutaka Yonemura et Yoshio Endo. Dans les cellules AZ-521 et AZ-P7A, aucun produit de RT-PCR ont été observés 14 retrovirus y compris HPV16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, VIH1, VIH2, et le type ADV 1 (données non présentées), à l'exclusion infection par ces rétrovirus dans les deux lignées cellulaires . Les cellules ont été maintenues dans un milieu RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) complémenté avec du sérum inactivé à la chaleur 10% de fœtus bovin (Invitrogen), 100 U /ml de pénicilline et 0,1 mg /ml de streptomycine.

Production et isolement des exosomes

Les cellules adhérentes ont été ensemencées à 150 mm-plats au nombre approprié de cellules allant de 3 x 10 ^{6 à 1 × 10 7 cellules par boîte, tandis que les cellules flottantes ont été inoculées dans 75 cm 2-ballon à 2~2.5 × 10 7 cellules par flacon. Les cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 de 25 ml et 50 ml pour la vaisselle et des fioles, respectivement, pendant 24 h à 37 ° C et 5% de CO _{2, lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), et mises à incuber 48 heures dans du phénol milieu RPMI-1640 exempt de rouge (Sigma-Aldrich) contenant 10% de sérum bovin fœtal inactivé à la chaleur qui a été préalablement appauvri contaminantes microvésicules par centrifugation pendant une nuit à 100 000 x g. Exosomes ont été isolés à partir des cellules totales allant de 6 × 10 7-3 x 10 8 cellules comme décrit précédemment [29]. En bref, le milieu de culture a été recueilli et centrifugé à 800 xg pendant 5 min et plus 2000 x g pendant 10 min pour éliminer les cellules levées. Le surnageant a été soumis à une filtration sur un filtre à membrane de polyéthersulfone de 0,1 pm de pores (Corning) pour éliminer les débris cellulaires et de grandes vésicules, puis on concentre par 100 000 Mw de coupure membrane (Centriplus-70, Millipore). Le volume de surnageant a été réduit d'environ 250-500 ml à environ 30 ml. Le surnageant a ensuite été soumis à une ultracentrifugation à 100 000 x g pendant 1 h à 4 ° C en utilisant un rotor 70Ti (Beekman Coulter). Les granulés obtenus ont été remises en suspension dans 6 ml de PBS et ultracentrifugés à 100.000 x g pendant 1 h à 4 ° C en utilisant 100Ti rotor (Beckman Coulter).}}

microscopie électronique en transmission

Les exosomes sédimentées ont été mélangés avec des quantités égales de fraîchement préparé glutaraldéhyde à 2% dans du PBS, incubées pendant une nuit à 4 ° C, post-fixes avec 1% de tétroxyde d'osmium dans du PBS à 4 ° C pendant 2 h, déshydraté dans une série graduée d'éthanol. À la suite de la déshydratation, les échantillons ont été transférés à l'oxyde de propylene et inclus dans de la résine époxy Quetol 812 (Nisshin EM). Des coupes ultrafines ont été coupés avec Ultracut UCT (LEICA), colorées avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb, et observés au microscope électronique JEM-1230 (JEOL). Immuno-analyse microscopique a été réalisée selon la méthode décrite par Xiao et al. [43] avec des modifications mineures. En bref, les exosomes ont été mélangés et incubés avec la souris anti-humain anticorps CD63 monoclonal (catalogue no. Sc-51662, Santa Cruz) pendant 1 h à température ambiante. L'échantillon a été déposé sur la surface de la membrane d'une maille de cuivre (collodion /carbone revêtu de 400 mesh, Nisshin EM) et on fait incuber pendant 1 h à température ambiante. Après lavage avec du PBS, immunomarquage de chèvre conjugué IgG anti-souris (catalogue no. EM.GMHL15, BBInternational) dilué à 1:20 a été déposé sur la membrane. Le treillis de cuivre a été flotté dans les gouttelettes de la surface de la membrane fait face vers le bas à la température ambiante pendant 30 min. Après le lavage avec du PBS, les gouttes d'acétate d'uranyle a été mis sur la surface du treillis de cuivre et colorées à la température ambiante pendant 30 secondes. Exosomes avec noir colloïdales de particules d'or sur les membranes capsulaires ont été marquées comme positives au microscope électronique à transmission.

Analyse par Western blot

Cellules et fractions exosomales ont été lavées, remises en suspension dans un tampon de lyse [7,5 M urée (Sigma-Aldrich), 2,5 M thiourée (Sigma-Aldrich), 12,5% de glycerol (Wako), 50 mM de Tris, 2,5% de n-octyl-bêta-D-glucoside (Sigma-Aldrich), du Tris 6,25 mM (2- carboxyéthyl) phosphine chlorhydrate (Sigma-Aldrich), l'inhibiteur de la protéase 1,25 mM (réf. P2714, Sigma-Aldrich)], et on a incubé pendant 1 h à 4 ° C en utilisant la RT-rotateur 50 (TAITEC). Après centrifugation à 14 000 xg pendant 60 min à 4 ° C, le surnageant a été recueilli et la concentration en protéine a été déterminée par la Protein Assay Kit de Bradford (Bio-Rad). Une partie des protéines (10 pg) ont été dénaturés par ebullition dans un tampon d'échantillon Laemmli fonctionner sur 10% de gels de SDS-polyacrylamide et transféré sur des membranes de PVDF Immobilon-P (0,45 um de taille des pores, Millipore). Les transferts ont été bloqués pendant 1 heure avec 5% de lait sec non gras dans du tampon Tris salin contenant du Tween 20 (10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM et 0,01% de Tween 20). Après avoir bloqué les membranes ont été incubées avec l'anticorps primaire ou un antisérum comprenant sérum de lapin anti-Tsg101 (réf. T5951, Sigma-Aldrich), sérum de chèvre anti AIP1 /Alix (réf. Sc-49268, Santa Cruz), anticorps monoclonal de souris l'anti-CD29 /β1 intégrine (réf. sc-610468, BD Biosciences) et anticorps monoclonal de souris anti-Bip /Grp78 (réf. 610979, BD Biosciences) à une dilution de 1:200 pendant 1 h à température ambiante. Les blots ont ensuite été incubées avec l'anticorps secondaire anti-IgG correspondant conjugué à la peroxydase de raifort (Jackson Laboratories) à une dilution de 1:2,000 pendant 1 h à température ambiante. protéines spécifiques ont été visualisées en utilisant le système ECL (GE Healthcare) et le FUJIFILM luminescentes Image Analyzer LAS3000 (Fuji Film). Le poids moléculaire de la protéine a été déduite en utilisant la protéine Precision Plus Standards (Bio-Rad Laboratories).

Isolement de l'ARN

Pour l'isolement d'ARN à partir du milieu de culture, les cellules ont été ensemencées comme décrit ci-dessus. 48 h après cultivées, le milieu de culture a été recueilli et centrifugé à 800 xg pendant 5 min et 2000 x g pendant plus de 10 min. Le surnageant a été soumis à une filtration sur un filtre à membrane de polyéthersulfone de 0,22 um de pores (Corning), suivie d'une concentration de 5000 Mw coupure membrane (Centricon Plus-70, Millipore). Le volume final de surnageant a été d'environ 10 à 20 ml du volume initial de 250-500 ml. Le surnageant a été mélangé avec un volume égal de réactif de lyse QIAzol (Qiagen) et a suivi la procédure d'isolement d'ARN décrits ci-dessous. L'ARN total a été isolé à partir de cellules, ou des exosomes, des milieux de culture en utilisant le kit miRNeasy Mini (Qiagen) conformément aux instructions du fabricant. Pour éliminer l'ADN génomique, de 40 pg d'ARN cellulaire total ont été incubés avec 40 unités de DNase RQ1 Rnase-Free (Promega) à 37 ° C pendant 30 min en présence de 40 unités de RNasine plus Inhibiteur de RNase (Promega). Pour l'ARN total des exosomes et des milieux de culture, tous les montants des produits bruts ont été traités de la même procédure, sauf l'utilisation de 5 U DNase. L'ARN a été purifié en utilisant le kit de nettoyage RNeasy MinElute (Qiagen) selon les instructions du fabricant. Les échantillons d'ARN ont été quantifiées avec un spectrophotomètre NanoDrop (Thermo Fisher Scientific) et évalués en utilisant le kit ARN Petit Agilent et Agilent 2100 Bioanalyseur (Agilent Technologies).

Analyse Microarray

Pour miRNA profilage, 100 ng et 20 ng d'ARN cellulaire total et extracellulaire, respectivement, ont été marquées par fluorescence en utilisant le miARN complet réactif de marquage et le kit Hyb (Agilent Technologies) selon le protocole de fabrication (Agilent miRNA microréseaux version 2.2). L'analyse complète de miARN a été réalisée en utilisant le Human miRNA Microarray Kit (8 × 15 K) Ver.3.0 (Agilent). Les signaux d'hybridation ont été détectés avec le Microarray Scanner ADN (Agilent Technologies). Les images numérisées ont été analysées en utilisant le logiciel et les données d'extraction d'entité d'analyse Agilent a été réalisée en utilisant le logiciel GeneSpring GX (Agilent Technologies). Les données présentées dans ce manuscrit ont été déposés dans Gene Expression de NCBI Omnibus (GEO) et sont accessibles par GEO série numéro d'accession GSE21350: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE21350).

transcription inverse (RT) et RT-PCR quantitative pour miRNA analyse

niveaux quantitatif miARN ont été déterminées à l'aide en temps réel RT-PCR avec Applied Biosystems 7900 Sequence Detection System HT (Applied Biosystems), TaqMan® Gene expression Assay (Applied Biosystems) pour l'homme let-7a (test ID 000377), laissez-7b (test ID 002619), laissez-7c (test ID 000379), laissez-7d (test ID 002283 ), laissez-7E (test ID 002406), laissez-7f (test ID 000382), laissez-7g (test ID 002282), laissez-7i (test ID 002221), et U6 snRNA (test ID 001973) comme un contrôle endogène . Dix ng d'ARN total ont été soumis à une transcription inverse avec TaqMan® Universal PCR Master Mix Non AmpErase (Applied Biosystems) et les réactifs TaqMan® respectifs de gènes cibles. La RT-PCR a été effectuée dans un volume total de 20 ul du mélange réactionnel selon le protocole du fabricant. L'amplification a été réalisée comme suit: 95 ° C pendant 10 min, 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s et 60 ° C pendant 60 s. Les échantillons ont été analysés en triple comme répliquée biologique ou quadruple que répliquer technique. Les niveaux de miARN ont été définis à partir du seuil de cycle (Ct), la méthode comparative Ct, et la normalisation du niveau d'ARNsn U6 dans chaque échantillon. Pliez augmente ou diminue dans chaque niveau miRNA des lignées cellulaires testées ont été déterminées par référence au niveau de la lignée cellulaire AZ-P7a.

Remerciements

Nous remercions les membres de l'Institut de recherche Cancer Center Shizuoka pour leurs nombreuses suggestions utiles. Nous remercions également les Drs. Yutaka Yonemura et Yoshio Endo pour le cadeau de lignées cellulaires AZ-P7A et MKN45P.

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