PLoS ONE: Пусть-7 микроРНК семья является Избирательно секретируется в внеклеточной среде с помощью экзосомы в клетке Метастатическим рака желудка Line

Абстрактный

Фон
<р> Экзосомы играют главную роль в клетке к -клетка связи, ориентации клеток для передачи молекул exosomal в том числе белков, мРНК, и микроРНК (миРНК) путем эндоцитоза подобный путь. микроРНК небольшие молекулы некодирующей РНК в среднем 22 нуклеотидов в длину, которые регулируют многочисленные биологические процессы, в том числе патогенеза рака и опосредуют ген понижающей регуляции путем пристреливать мРНК, чтобы вызвать деградацию РНК и /или вмешательство с переводом. Последние отчеты предполагают, что микроРНК может быть стабильно обнаружен в циркулирующей плазмы и сыворотки, так как микроРНК упаковываются экзосомы должны быть защищены от деградации РНК. Таким образом, профилирование exosomal микроРНК в необходимости уточнения межклеточной сигнализации и обнаружить новый маркер заболевания, а также.

Методология /Основные выводы
<р> Экзосомы выделяли из культивированных линий раковых клеток и их качество было подтверждено путем анализа просвечивающей электронной микроскопии и вестерн-блоттинга. Одна из клеточных линий тестируемых, метастатической желудка линии раковых клеток, AZ-P7A, показали самую высокую доходность РНК в отпущенных экзосомы и характерной формы в морфологии. Кроме того, РНК выделяли из клеток и питательных сред, а также профили этих трех микроРНК фракций были получены с использованием микрочипов анализа. Путем сравнения интенсивности сигналов данных микрочипов и следующую проверку с помощью анализа RT-PCR, мы обнаружили, что пусть-7 семейство микроРНК изобиловала как внутриклеточным и внеклеточным фракций из клеток AZ-P7A, в то время как низкий метастатическим AZ-521, родительской клетки линия AZ-P7A, а также других линий раковых клеток не показали такой склонности.

Выводы /Значение
<р> обогащение LET-7 семейства микроРНК в внеклеточного фракций, в частности, в экзосомы из клеток AZ-P7A могут отражать их онкогенные характеристики, включая онкогенеза и метастазирования. Так давайте-7 микроРНК обычно играют роль опухолевой супрессии как ориентация онкогены, такие как RAS
и HMGA2
, наши результаты свидетельствуют о том, что AZ-P7A клетки высвобождают LET-7 микроРНК через экзосомы в внеклеточной среде для поддержания их онкогенезу
<р> Образец цитирования:. Ohshima K, Inoue K, Fujiwara A, Хатакэяма K, Канто K, Y Ватанабе и др. (2010) Let-7 микроРНК Семейный селективно секретируется в внеклеточной среде с помощью экзосомы в клеточной линии Метастатическим рака желудка. PLoS ONE 5 (10): e13247. DOI: 10.1371 /journal.pone.0013247
<р> Редактор: Стефан Wölfl, Universität Heidelberg, Germany
<р> Поступило: 14 апреля 2010 года; Принято: 10 сентября 2010 года; Опубликовано 8 октября 2010 года
<р> Copyright: © 2010 Ohshima и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Работа была поддержана грантом в сотрудничестве с инновационными технологиями и перспективных исследований в области эволюционной зоне (CITY AREA) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники Японии. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> Клетки выделяют различные типы небольших мембранных везикул. Экзосомы являются одним из везикул с диаметром 30-100 нм и физико-химически отличается от других секретируемых пузырьках [1]. Внутри экзосомы, клеточный ген продукты, включая белки, мРНК, и микроРНК (миРНК) упакованы и эти молекулы могут быть переданы в клетки-реципиенты, чтобы доставить их молекулярной сигнализации, такие как онкогенеза [2] - [4] и иммунный ответ [1], [ ,,,0],5]. Экзосомы выпускаются многими типами клеток [6], которые включают опухолевые клетки, эпителиальные клетки, и кроветворные клетки, такие как ретикулоцитов, цитотоксические Т-лимфоциты, вирус Эпштейна-Барр-трансформированных В-клеток, мастоцитов, дендритные клетки и тромбоциты. Секретируемые экзосомы были выделены и охарактеризованы в пробирке
из культивируемых клеточных линий [7] вместе с В естественных условиях
в жидкостях организма [7], включая кровь [8], мочи [9], слюна [10], амниотической жидкости [11], и злокачественные плевральный выпот [12]. Так как наблюдается во многих пролиферирующих типов клеток, можно предположить, обострить опухолевых клеток, о чем свидетельствует их увеличение присутствия в плазме крови и плеврального выпота у больных с раком [8], [12]. Это увеличило присутствие в неинвазивных жидкостях организма больных раком ускорилось к профилю молекулярные компоненты в экзосомы для обнаружения клинически полезных опухолевых маркеров и биомаркеров [3], [7], [13].

микроРНК являются класс некодирующих малых РНК, которые участвуют в посттрансляционной регуляции экспрессии генов путем ингибирования стабильность и трансляцию мРНК [14]. Последние данные показали, что микроРНК мутации или неправильная экспрессия коррелирует с различными злокачественных опухолей человека и свидетельствуют о том, что некоторые микроРНК могут функционировать в качестве онкогенов или супрессоров опухолей [15], [16]. Для анализа РНК, всегда учитывать их устойчивость от деградации РНКазы. Последние данные показывают, что эндогенные плазмы микроРНК в образцах крови стабильно обнаруживаются в форме, устойчивой к воздействию активностью РНКазы [17], что подтверждается идентификации микроРНК в жидкостях организма, таких как кровь [17] - [24], мочи [25], и слюна [10], [26].
<р> культивированный раковые клетки были использованы для поиска опухолевых маркеров. В частности, идентифицирующие белки и пептиды, секретируемые в культуральную среду была разработана на основе протеомики подхода [27], [28]. Что касается молекулярной подписи в экзосомы, протеомики, а также анализы транскриптомика были выполнены, чтобы выявить и идентифицировать туморогенез кандидатов маркер опухоли [2] - [4], [7], [29]. Здесь, чтобы идентифицировать микроРНК, связанные с онкогенеза и метастазирования, мы провели обширный анализ микроРНК в трех клеточных фракций, включая клетки, экзосомы и среды из культивируемых клеток. Ранжирование данных этих внутриклеточных и внеклеточных микроРНК, полученных с помощью анализа микрочипов, мы обнаружили, что семья пусть-7 микроРНК богат во всех фракций из клеток AZ-P7A, метастатической желудка линии раковых клеток, которая производит однородную и сгущенное морфологии, и высокое извлечение скорость exosomal микроРНК. Эти результаты отличались от других клеточных линий, включая клеточные рак легких линий (SBC-3, NCI-H69, и DMS53), ободочной и прямой линий раковых клеток (SW480 и SW620), и AZ-521, в родительской линии клеток AZ-P7A. Учитывая, что LET-7 семейных функций микроРНК в основном как гены-супрессоры опухолей [30] целевой онкогены, такие как RAS
и высокая мобильность группы A2 ( HMGA2
) [31], мы полагаем, что AZ -P7a клетки селективно секретируют пусть-7 микроРНК в межклеточную среду через экзосомы для поддержания туморогенного и метастатических наклонности.

Результаты

Выделение экзосомы из линий различных раковых клеток
<р> Экзосомы производятся из внутренних клеток во внеклеточную среду посредством экзоцитоза типа пути [1]. В дополнение к жидкостей организма, таких как сыворотка и плазма из периферической крови [7], [8], экзосомы встречаются в среде культивируемых клеток [7], что облегчает идентификацию молекул exosomal, включая белки, РНК, и микроРНК для цели, для их клиническое применение. Профилирование такие молекулы exosomal, произведенные в культивируемых клетках рака привели обнаружить новый кандидат маркер и антигена для диагностики рака и иммунотерапии [7]. В данном исследовании с целью профилирование exosomal микроРНК, мы впервые выделили экзосомы из культуральной среды клеточных линий 46 рака с различными типами тканей, которые включают 8 для желудка, 16 для легкого, 5 для толстой кишки, 9 для поджелудочной железы, 3 для простаты и 5 для груди. После того, как клетки выращивали в течение 48 ч, экзосомы были собраны с помощью комбинации последовательного центрифугирования и молекулярной массой отрезные мембран, как описано в материалах и методах. Их чистота exosomal фракций оценивали с помощью анализа просвечивающей электронной микроскопии и вестерн-блоттинга. Просвечивающей электронной микроскопии показали, круглой формы везикулярные мембранные структуры приблизительно в размере 100 нм в диаметре. Среди трех клеточных линий, SBC-3, AZ-521 и AZ-P7A, представляет интерес, что морфология из клеток AZ-P7A была более однородной и конденсируется, чем другие клетки (рис 1А). Иммуноэлектронной микроскопии показал, что внеклеточные частицы, выделенные из культуральной среды клеток AZ-P7A имели иммунореактивности с антителами против CD63, один из exosomal мембранных белков, на капсульных оболочек (Фигура 1В). Присутствие известных exosomal белков, включая CD29 /β 1-интегрин, Aip1 /Аликс и опухолевого гена восприимчивости 101 (TSG101) была подтверждена с помощью Вестерн-блот-анализа, в то время как белок локализуется в эндоплазматический ретикулум, Бип /GRP78, было невозможно обнаружить (фиг.1С). Этот результат указывает на то, что загрязнение материала, полученного из других клеточных отсеков, расположенных в exosomal фракций было минимальным. Выход exosomal белков из клеток AZ-P7A была в 10 раз выше, чем от AZ-521 клеток; ~2.5 Мг белка получали из 1 × 10 ^{8 AZ-P7A клеток.}

Обогащение exosomal РНК, полученных из клеток AZ-P7A
<р> После выделения exosomal тотальную РНК были выделены из 46 культивированные клеточные линии. Интересно отметить, что РНК-выходы из клеток AZ-P7A были намного больше, чем из других клеток (фиг.2А). Распределение по длине показал наличие большого количества малых РНК в экзосомы (центральная панель, рис 2В). Следует отметить, что существует значительная разница в общих экзосомы и уровни exosomal микроРНК между пациентами с аденокарциному легкого и управления [8]. клеточная линия АЗ-P7A была создана путем повторного посева родительских клеток AZ-521 у мышей, привели к высокому перитонеального-метастатического потенциала [32], [33]. Таким образом, высокие урожаи как РНК и белка наряду с морфологическими характеристиками, в клетках AZ-P7A может быть связано с их высокими онкогенных и метастатических наклонностей. Так как микроРНК были обнаружены в бесклеточных жидкостях организма [17] - [20], мы также провели прямую изоляцию от общей РНК из культуральной среды без процедуры выделения экзосомы. Количества тотальную РНК из культуральной среды, как правило, больше, чем те, от экзосомы (фиг.2А). Распределение РНК в длину, показали, что микроРНК фракции были обнаружены в диапазоне от 10 до 40 нуклеотида длиной в РНК, полученных из культуральной среды (правая панель), а также экзосомы (центральная панель) из клеток AZ-P7A (рис 2B). В соответствии с протоколом изготовления для Bioanalyzer, пики с более чем 40 нуклеотидов длиной содержат другие малые РНК, включая тРНК в 70~90, 5S рибосомальной РНК при 100 и 5.8S рибосомальной РНК при 150, как это наблюдалось в внутриклеточная фракция (левая панель) , Эти результаты свидетельствуют о том, что микроРНК могут существовать в культуральной среде за пределами exosomal фракции, хотя РНК, как полагают, должны быть защищены от РНКазы в качестве упаковываемого в экзосомы. В частности, по сравнению с адгезивными клетками, прирост урожайности РНК была заметно больше в плавучем клеток (NCI-H69 и Lu-135) или клеток с населением сочетание плавающих и адгезивных клеток (Colo205), которые могут быть отражены в результате загрязнения РНК пролить из лизированных клеток, которые непрерывно оставленные в культуральной среде.

микроРНК профилирование с помощью микрочипов анализа
<р> микроРНК профили в внутриклеточных и внеклеточных фракций определяли с помощью анализа микрочипов для семи линий раковых клеток, включая AZ- 521, AZ-P7A, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 и SW620. Образцы из культуральной среды, а также экзосомы предоставляемые гибридизация сигналы (Рисунок 3), что указывает на наличие микроРНК в этих образцах. До настоящего времени, анализируя данные микрочипов для микроРНК среди образцов, нет четких методов не было сделано для нормализации интенсивности сигнала, так как трудно найти соответствующий внутренний стандартный материал [34]. Таким образом, данные микрочипов микроРНК были в целом проанализированы без нормализации, при условии, что общее количество входных РНК являются постоянными среди образцов [34], [35]. В этом исследовании, после усреднения данных микрочипов микроРНК между двумя повторами, мы оценивали микроРНК в зависимости от их интенсивности сигналов. Мы обнаружили, что пусть-7 семейства микроРНК, такие как пусть-7а, пусть-7b, пусть-7с, пусть-7d, пусть-7e, пусть-7f, пусть-7G, и пусть-7i были обнаружены с относительно высокими сигналами на протяжении большей внутриклеточных фракций из семи клеточных линий (таблица 1, рисунок 3). Тем не менее, нет или мало интенсивности сигналов для выпускаемых-7 микроРНК были обнаружены во внеклеточных фракций, за исключением обеих внеклеточного фракций из клеток AZ-P7A и культуральной среды фракции из клеток NCI-H69 (таблица 1, рисунок 3). В частности, в обоих внеклеточных фракций из клеток AZ-P7A, все восемь пусть-7 микроРНК были обнаружены, хотя ранг LET-7g был ниже, чем в других семи пусть-7 микроРНК. На основе различных моделей выпускаемых-7 уровней микроРНК среди трех клеточных фракций, мы разделили семь клеточных линий на три группы (рисунок 3) следующим образом; (1) AZ-P7A, клетки, которые позволяют-7 микроРНК были обнаружены во всех трех фракций, (2) AZ-521 наряду с SBC-3, DMS53, SW480 и SW620, клетки, которые позволяют-7 микроРНК, как правило, находятся в только внутриклеточные фракции, (3) NCI-H69, клетки, которые позволяют-7 микроРНК были найдены в внутриклеточных фракций, а также в культуральной среде, в некоторой степени.

оТ-ПЦР анализ внутриклеточной и внеклеточной корреспонден- 7 микроРНК семья
<р> затем мы проводили количественную RT-PCR для выпускаемого-7 семейства восемь микроРНК для проверки данных микрочипов. пусть-7 микроРНК были легко обнаружены в внутриклеточным и внеклеточным фракций из клеток AZ-P7A (фиг.4А) и в клетках AZ-521 (фиг.4В). Уровни давайте-7 микроРНК на входных РНК, как правило, выше в внеклеточного фракции из клеток AZ-P7A, чем из клеток AZ-521. Для нормализации уровней целевых микроРНК, полученных с помощью ОТ-ПЦР, U6 мяРНК было как правило, используется в качестве внутреннего контроля. Мы наблюдали наличие U6 мяРНК во всех трех фракций из клеток AZ-P7A и клеток AZ-521 (фиг.4С), а затем сравнили уровни LET-7 микроРНК между соответствующими фракциями из этих двух клеточных линий. После нормализации, уровни LET-7 микроРНК, включая LET-7а, пусть-7b, пусть-7с, пусть-7d, пусть-7e, и пусть-7i в обеих фракций экзосомы и культуральной среды от AZ-521 клеток были понижена по сравнению с теми из клеток AZ-P7A. Наоборот, не было большой разницы в уровне внутриклеточного LET-7 микроРНК. Далее мы сравнили уровень exosomal пусть-7а из клеток AZ-P7A с теми из других клеточных линий рака, включая SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 и SW620, и обнаружили, что уровень пусть-7а только из SW620 клеток был относительно близко (в 0,7 раза) до уровня от клеток AZ-P7A (рис 4д). Следует отметить, что внутриклеточный уровень LET-7а из SW620 клеток было примерно в 3,5 раза больше, чем в изобилии, что из клеток AZ-P7A. Основываясь на этих результатах, мы предположили, локализацию Let-7а в долях клеток и экзосомы (рисунок 5), и проводится дальнейший анализ. Нормированные уровни U6, мы рассчитали относительные уровни LET-7а расфасованные экзосомы на уровне клеточного LET-7а (рис 4F). В результате, количество exosomal пусть-7А была значительно больше в клетках AZ-P7A, чем другие шесть клеток, предполагая, что клетки АЗ-P7A селективно и активно секретируется LET-7 микроРНК семейство во внеклеточную среду через экзосомы.

Обсуждение
<р> в настоящем исследовании мы показали, что семья пусть-7 микроРНК секретируется во внеклеточную среду через exosomal транспорта, который был специфическим для метастатических желудка линии раковых клеток, AZ-P7A. пусть-7 микроРНК семьи у человека состоит из 10 последовательностей из 13 предшественников [30]. В общем, давайте-7 микроРНК выступать в качестве супрессора опухоли путем пристреливать онкогенов, таких как RAS
и HMGA2
и пусть-7 микроРНК подавляются во многих раковых образований из солидных органов [31]. AZ-P7A клетки обладают способностью метастатического с перитонеального распространения в голых мышей [32], [33]. Таким образом, мы полагаем, что exosomal выпуск пусть-7 микроРНК в межклеточное окружающей среде приводит к снижению анти-онкогенного эффекта в клетках, что приводит к поддерживать их онкогенеза и инвазивности. С другой стороны, пусть-7 микроРНК реже играют онкогенные функцию, в связи с увеличением экспрессии с помощью гипометилированию в LET-7 локуса [36] или ориентации каспазы-3 мРНК [37]. В этом случае выпуск exosomal выпускаемых-7 микроРНК может привести к трансформации в клетки-мишени путем переноса их онкогенными свойствами.
<Р> У больных раком легкого, общие уровни экзосомы и их микроРНК возрастает по сравнению с контрольной группой [8 ]. Было показано, что опухолевые экзосомы индуцировать иммунный механизм выхода в раковых заболеваний путем спонтанного апоптоза клеток Т [38] - [40]. В данном исследовании мы показали однородную морфологию и обогащение РНК в экзосомы из метастатических клеток AZ-P7A. Это может быть отражено их туморогенности.

микроРНК очень стабильны в плазме крови и сыворотки, так как защищен от РНКазы [17]. Таким образом, он делает уровни микроРНК испытанные для клинической диагностики в качестве опухолевых маркеров и биомаркеров. Как это происходит? Чин и др. предложили две гипотезы для источника микроРНК на циркулирующие образцы крови; это может быть из-за в результате гибели клеток опухоли и лизиса или высвобождения опухолевыми клетками во внеклеточное микроокружение кровеносных сосудов [19]. Наоборот к адгезивных клеток, мы наблюдали, что количество тотальную РНК в культуральной среде были относительно выше, чем в экзосомы для ячеек с плавающей таким свойством как NCI-H69, Lu-135 и Colo205. Этот прирост, вероятно, привело к загрязнению РНК из мертвых клеток в культуральной среде.
<Р> Для открытия новых опухолевых маркеров в крови и биомаркеров, omics подходы в том числе протеомики и транскриптомика проводятся либо путем непосредственного анализа проб крови или применения профилирования в образцах тканей. Есть противоречивые отчеты, если ли профили микроРНК и мРНК в крови параллельны с профилем опухоли. Подпись exosomal микроРНК отражает происходящие из опухолевых клеток у больных с легочной аденокарциномы [8] и рака молочной железы [41]. С другой стороны, Ског и др. показали, что анализ микрочипов для мРНК, полученных из клеток глиобластомы и соответствующих экзосомы выявленных мРНК исключительно обнаруженные в микропузырьков, полагают, что мРНК локализованы в определенной области цитоплазмы [3]. Кроме того, Танака и др. показали, что уровень микроРНК-92а уменьшилось в плазме крови больных острым лейкозом в то время как его сильная экспрессия была обнаружена в образцах ткани [24]. Наши результаты по селективному обогащению LET-7 семейства микроРНК в AZ-P7A клеток, полученных экзосомы подходят с последнем случае. Если молекулы-мишени не являются микроРНК, полученные из циркулирующих опухолевых клеток, что предполагает тщательное исследование необходимо использовать профили микроРНК в образцах тканей для обнаружения в сыворотке или плазме образцов
. <Р> Так как экзосомы образуются в кроветворных клетках, а также эпителиальных клеток , циркулирующей крови содержит экзосомы, полученные из обоих типов клеток. В общем, чтобы исследовать exosomal профили белков, мРНК и микроРНК в сыворотке и плазме, экзосомы, полученные из опухолей с эпителиальными характеристиками отделены от тех, из гемопоэтических клеток [8], [13]. Это осуществляется с использованием аффинной очистки с антителами против молекул, таких как EpCAM, которые экспрессируют на поверхности эпителиальных клеток. Наши результаты, что были подобные уровни LET-7 семейства микроРНК между экзосомы и культуральной среды из клеток AZ-P7A позволяют предположить, что эти уровни микроРНК могут быть измерены без выделения экзосомы из клинических образцов, таких как сыворотки и плазмы.
<Р> В заключение, данное исследование показало, что пусть-7 микроРНК семья богата экзосомы с метастатической желудка линии раковых клеток, AZ-P7A клеток. Так пусть-7 микроРНК участвуют в процессе пролиферации [31], их секрецию exosomal может играть важную роль в онкогенеза и метастазирования.

Материалы и методы

Культура клеток
<р> человеческие клеточные линии рака желудка клеток (AZ-521, MKN45, KATOIII и NUGC-3), клеточные линии рака легких человека (SBC-3, Lu-65, Lu-135, и КНС-62), поджелудочной железы и человеческие раковые клетки ( костюм-2) были приобретены у японской коллекции Research биоресурсам. раковые клетки человеческого желудка (SNU-1), клеточные линии рака предстательной человеческого легкого (DMS-53, DMS114, NCI-H69, А549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SK-MES-1, и HCC827), человеческие клетки мезотелиомы (MSTO-H211), ободочной и прямой линии раковых клеток человека (SW480, SW620, Colo205, LoVo, и НСТ116, панкреатических раковых клеток линии человека (BxPC-3, AspC-1, Рапс-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45 и Capan-2), линии предстательной железы человека клеток рака (PC-3, SU145 и LNCaP) и линии клеток рака молочной железы человека (T-47D, MCF7, SK-BR-3, БТ -474 и MDA-MB-231) были приобретены у American Type Culture Collection. MKN28 (человеческие раковые клетки желудка) и ПСН-1 (поджелудочной железы человека раковые клетки) были приобретены у иммунобиологических лабораторий и Европейской коллекции клеточных культур, соответственно . линии человека рак желудка клеток, AZ-P7A [32], [33] и MKN45P [42] были подарком от DRS. Ютака Yonemura и Yoshio Эндо. В AZ-521 и AZ-P7A клеток, не наблюдалось никаких продуктов RT-PCR 14 ретровирусов, включая HPV16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, ВИЧ1, HIV2 и АДВ 1-го типа (данные не показаны), за исключением инфекции этими ретровирусов в обеих клеточных линиях , Клетки поддерживали в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen), 100 ед /мл пенициллина, и 0,1 мг /мл стрептомицина.

Получение и выделение из экзосомы
<р> прилипшие клетки высевают до 150 мм Петри на соответствующее число клеток в пределах от 3 × 10 6 до 1 × 10 7 клеток на чашку, в то время как плавающие клетки высевали в 75 см 2-колбу на 2~2.5 × 10 7 клеток на колбу. Клетки культивировали в полной среде RPMI-1640, 25 мл и 50 мл для посуды и колб, соответственно, в течение 24 ч при 37 ° С и 5% СО <суб> 2, дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), и инкубировали в течение 48 ч в фенолового красного среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, который был предварительно обедненного загрязняя микровезикулы в течение ночи центрифугированием при 100000 • g. Экзосомы были выделены из общего числа клеток в пределах от 6 × 10 от 7 до 3 × 10 8 ячеек, как описано ранее [29]. В кратком изложении, культуральную среду собирали и центрифугировали при 800 х г в течение 5 мин и дополнительный 2000 • g в течение 10 мин для удаления поднимаемые клеток. Супернатант подвергали фильтрованию на 0,1 мкм пор полиэфирсульфон мембранный фильтр (Corning), чтобы удалить остатки клеток и большие везикулы с последующим концентрированием путем 100000 Mw вырезанную мембрану (CentriPlus-70, Millipore). Объем супернатанта был уменьшен с примерно 250-500 мл до приблизительно 30 мл. Затем надосадочную жидкость ультрацентрифуге при 100000 × г в течение 1 ч при 4 ° С с использованием 70Ti ротор (Beckman Coulter по). Полученные гранулы вновь суспендируют в 6 мл PBS и ультрацентрифуге при 100000 × г в течение 1 ч при 4 ° С с использованием 100Ti ротор (Beckman Coulter по).

Передача <р> Гранулированные экзосомы смешивались электронная микроскопия
с равными количествами свежеприготовленного 2% глутаровым альдегидом в PBS, инкубировали в течение ночи при 4 ° с, постфиксами с 1% осмия в PBS при 4 ° с в течение 2 ч и дегидратируют в серии градуированных этанола. После обезвоживания, образцы переносили в окись пропилена и заливали в эпоксидную смолу Quetol 812 (Нисшин ЕМ). Ультратонкие срезы были вырезаны с Ultracut UCT (LEICA), окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца, и наблюдали с ДСР-1230 электронного микроскопа (JEOL). Иммуноэлектронной микроскопический анализ проводили в соответствии с методом, описанным Xiao и соавт. [43] с незначительными изменениями. Короче говоря, экзосомы смешивали и инкубировали с мышиным анти-человеческим CD63 моноклональных антител (№ по каталогу. SC-51662, Santa Cruz) в течение 1 ч при комнатной температуре. Образец капают на поверхность мембраны медной сетки (коллодиевая /углерод с покрытием 400 меш, Нисшин EM) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки PBS, immunogold конъюгированный козий против мышиного IgG (№ по каталогу. EM.GMHL15, BBInternational), разведенного в 1:20 капают на мембрану. Медная сетка была плавал в каплях с ее поверхности мембраны развенчала при комнатной температуре в течение 30 мин. После промывки PBS, уранилацетате капли помещали на поверхность медной сетки и окрашивали при комнатной температуре в течение 30 с. Экзосомы с черными коллоидных частиц золота на капсульных оболочек были отмечены как положительные при просвечивающего электронного микроскопа.

Вестерн-блот анализ
<р> Клетки и exosomal фракции промывали, ресуспендировали в буфере для лизиса [7,5 M мочевины (Sigma-Aldrich), 2,5 М тиомочевины (Sigma-Aldrich), 12,5% глицерина (WAKO), 50 мМ Трис, 2,5% н-октил-бета-D-глюкозид (Sigma-Aldrich), 6,25 мМ трис (2- карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид (Sigma-Aldrich), 1,25 мМ ингибитор протеазы (№ по каталогу. P2714, Sigma-Aldrich)], и инкубировали в течение 1 ч при 4 ° с с использованием ротатора РТ-50 (TAITEC). После центрифугирования при 14000 х г в течение 60 мин при 4 ° С, супернатант собирали и концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа белка Бредфорда (Bio-Rad). Часть белков (10 мкг) денатурировали путем кипячения в буфере Лэммли образца, работать на 10% SDS-полиакриламидном геле и переносили на Иммобилон-P мембраны ПВДФ (0,45 мкм размер пор, Millipore). Блот блокировали в течение 1 ч с 5% обезжиренным сухим молоком в Трис-буферном солевом растворе, содержащем Tween 20 (10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, и 0,01% твин-20). После блокирования мембраны инкубировали с каждым первичным антителом или антисыворотки, включая кролика против TSG101 сыворотки (№ по каталогу. T5951, Sigma-Aldrich), козий анти-Aip1 /Alix сывороткой (№ по каталогу. SC-49268, Santa Cruz), мышиные моноклональные анти-CD29 /β1-интегрина (№ по каталогу. SC-610468, BD Biosciences) и мышиных моноклональных анти-Бип /GRP78 (№ по каталогу. 610979, BD Biosciences) при разведении 1:200 в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем блоты инкубировали с соответствующим анти-IgG вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (Jackson Laboratories) при разведении 1:2,000 в течение 1 ч при комнатной температуре. Специфические белки визуализировали с использованием системы ECL (GE Healthcare) и FUJIFILM Люминесцентные Image Analyzer LAS3000 (Fuji Film). Белок молекулярная масса была выведена с использованием точности плюс протеин Стандарты (Bio-Rad Laboratories).

Выделение РНК
<р> Для выделения РНК из культуральной среды, клетки высевали, как описано выше. 48 ч после того, как выросли, культуральную среду собирали и центрифугировали при 800 х г в течение 5 мин и дополнительный 2000 × г в течение 10 мин. Супернатант подвергали фильтрованию на 0,22 мкм пор полиэфирсульфон мембранный фильтр (Corning), с последующим концентрированием с 5000 Mw вырезанную мембрану (Centricon Plus-70, Millipore). Конечный объем надосадочной жидкости составляла примерно 10-20 мл от исходного объема 250-500 мл. Супернатант смешивали с равным объемом QIAzol Реактив для лизиса (Qiagen) и следовала процедуре выделения РНК, описанную ниже. Общую РНК выделяли из клеток, экзосомы или носителей культуры с использованием miRNeasy Mini Kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Для удаления геномной ДНК, 40 мкг клеточного тотальной РНК инкубировали с 40 единиц RQ1 РНКазы ДНКазы (Promega) при 37 ° С в течение 30 мин в присутствии 40 единиц Rnasin Plus РНКазы Ингибитор (Promega). Для получения полной РНК из экзосомы и культуральных сред, все количества сырых продуктов обрабатывали в том же порядке, за исключением использования 5 U ДНКазы. РНК очищали с использованием набора для очистки RNeasy MinElute (Qiagen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Образцы РНК были количественно с NanoDrop спектрофотометра (Thermo Fisher Scientific) и оценивали с помощью Agilent Small RNA Kit и Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).

микрочипов анализ
<р> Для профилирования микроРНК, 100 нг и 20 нг клеточных и внеклеточных полных РНК, соответственно, были флуоресцентно-меченного с помощью микроРНК Complete мечения Реагент и Гибр Kit (Agilent Technologies) в соответствии с протоколом Мануфактуры (Agilent микроРНК микрочипов версии 2.2). Комплексный анализ миРНК проводили с использованием микроРНК Microarray Kit Human ver.3.0 (8 × 15 K) (Agilent). Гибридизация сигналы были обнаружены с помощью ДНК Microarray Scanner (Agilent Technologies). Отсканированные изображения были проанализированы с помощью функции извлечения программного обеспечения и анализ данных компании Agilent проводили с использованием программного обеспечения GeneSpring GX (Agilent Technologies). Данные, обсуждаемые в этой рукописи были сданы на хранение в экспрессии генов NCBI в Omnibus (GEO) и доступны через инвентарным номером GSE21350 GEO серии: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE21350).

обратной транскрипции (RT) и количественный RT-PCR для анализа микроРНК
<р> уровни количественный микроРНК были определены с использованием в режиме реального времени RT-PCR с Applied Biosystems 7900 HT Последовательность система обнаружения (Applied Biosystems), TaqMan® Gene Expression Assay (Applied Biosystems) для человека пусть-7а (анализ ID 000377), давайте-7b (анализ ID 002619), пусть-7с (анализ ID 000379), пусть-7d (анализ ID 002283 ), пусть-7e (анализ ID 002406), пусть-7F (анализ ID 000382), пусть-7g (анализ ID 002282), пусть-7i (анализ ID 002221), и U6 мяРНК (анализ ID 001973) в качестве эндогенного контроля , Десять нг тотальной РНК подвергали обратной транскрипции с TaqMan® Универсальной PCR Master Mix Нет AmpErase (Applied Biosystems) и соответствующих реагентов TaqMan® для генов-мишеней. ОТ-ПЦР проводили в общем объеме 20 мкл реакционной смеси в соответствии с протоколом изготовления. Амплификацию проводили следующим образом: 95 ° С в течение 10 мин, 40 циклов при 95 ° С в течение 15 с и 60 ° C в течение 60 сек. Образцы были проанализированы в трех экземплярах в качестве биологической повторности или четырежды в качестве технической репликации. Уровни микроРНК были определены с порога цикла (Ct), сравнительный метод Ct и нормализации по уровню U6 мяРНК в каждом образце. Fold увеличивается или уменьшается на каждом уровне микроРНК клеточных линий тестируемых были определены путем ссылки на уровне клеточной линии AZ-P7A.

Выражение признательности
<р> Мы благодарим членов Сидзуока онкологического исследовательского института Центр за их многочисленные полезные предложения. Мы также благодарим доктора. Ютака Yonemura и Yoshio Эндо для подарка клеточных линий AZ-P7A и MKN45P.

• PLoS ONE: Ген Экспрессия Подпись приобретенному химиорезистентность цисплатин и фторурацил полихимиотерапии в …
• PLoS ONE: Гипоксия-Индуцибельная фактор 1α Определяет рак желудка химиочувствительность с помощью модуляции р53 и…