PLoS ONE: La-7 mikroRNA Familie selektivt utskilles i det ekstracellulære miljøet via Exosomes i en magekreft med spredning Cell Line

Abstract

Bakgrunn

Exosomes spille en viktig rolle i celle-til -celle kommunikasjon, målretting celler til å overføre exosomal molekyler, inkludert proteiner, mRNA, og microRNAs (mirnas) av en endocytose-lignende sti. mirnas er små kodende RNA-molekyler i gjennomsnitt 22 nukleotider i lengde som regulerer en rekke biologiske prosesser, inkludert kreft patogenesen og megle genet nedregulering ved å målrette mRNA å indusere RNA degradering og /eller forstyrrer oversettelse. Nylige rapporter antyder at mirnas kan bli stabilt påvises i sirkulerende plasma og serum siden mirnas er pakket av exosomes som skal beskyttes fra RNA degradering. Dermed profilerings exosomal mirnas har behov for å avklare intersignalering og oppdage en ny sykdom markør også.

metodikk /hovedfunnene

Exosomes ble isolert fra dyrkede kreftcellelinjer og deres kvalitet ble validert ved analyser av transmisjonselektronmikroskopi og western blotting. En av de cellelinjer som ble testet, en magekreft med spredning cellelinje, AZ-P7A, viste den høyeste RNA avkastning i de frigjorte exosomes og karakteristiske form i morfologi. I tillegg ble RNA isolert fra celler og dyrkningsmedium, og profiler av disse tre miRNA fraksjoner ble oppnådd ved bruk av microarray analyse. Ved å sammenligne signal intensiteter av microarray data og følgende validering ved hjelp av RT-PCR-analyse fant vi at la-7 miRNA familien var rikelig i både den intracellulære og ekstracellulære fraksjoner fra AZ-P7A celler, mens lav metastatisk AZ-521, foreldrecellen linje av AZ-P7A, samt andre kreftcellelinjer viste ingen slik tilbøyelighet.

Konklusjon /Betydning

anrikning av la-7 miRNA familien i ekstracellulære fraksjoner, spesielt i exosomes fra AZ-P7A celler kan reflektere deres onkogene egenskaper inkludert tumorigenesis og metastasering. Siden la-7 mirnas generelt spille en tumor-undertrykkende rolle som målgruppe onkogener som RAS Hotell og HMGA2
, våre resultater tyder på at AZ-P7A celler slipper la-7 mirnas via exosomes inn ekstracellulære miljø for å opprettholde sin onkogenese

Citation. Ohshima K, Inoue K, Fujiwara A, Hatakeyama K, Kanto K, Watanabe Y, et al. (2010) La-7 mikroRNA Familie selektivt utskilles i det ekstracellulære miljøet via Exosomes i en magekreft med spredning Cell Line. PLoS ONE 5 (10): e13247. doi: 10,1371 /journal.pone.0013247

Redaktør: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Tyskland

mottatt: 14. april 2010. Godkjent: 10 september 2010; Publisert: 08.10.2010

Copyright: © 2010 Ohshima et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Arbeidet ble støttet av et stipend i samarbeid med innovativ teknologi og Advanced Research i evolutional Area (CITY AREA) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

cellene skiller ut ulike typer små membranvesikler. Exosomes er en av vesiklene med diameter på 30-100 nm og physicochemically forskjellig fra andre sekreterte vesikler [1]. Inne exosomes, cellulær genprodukter, inkludert proteiner, mRNA, og microRNAs (mirnas) er pakket og disse molekylene kan overføres til mottakercellene til å levere deres molekylsignalering, for eksempel onkogenese [2] - [4] og immunresponsen [1], [ ,,,0],5]. Exosomes frigjøres av mange celletyper [6] som omfatter tumorceller, epitelceller, og hematopoietiske celler så som retikulocytter, cytotoksiske T-lymfocytter, Epstein-Barr-virus-transformerte B-celler, mastocyttene, dendrittiske celler og blodplater. Utskilte exosomes er blitt isolert og karakterisert in vitro
fra dyrkede cellelinjer [7] sammen med in vivo
i kroppsvæsker [7], inkludert blod [8], urin [9], spytt [10], fostervann [11], og ondartet pleural effusjon [12]. Siden observert i mange prolifererende celletyper, er det tenkelig å forverre tumorceller, som vist ved deres økte tilstedeværelse i plasma og pleural effusjon hos pasienter med kreft [8], [12]. Dette økt tilstedeværelse i ikke-invasiv kroppsvæsker av kreftpasienter har akselerert å profilere molekylære komponenter i exosomes for å oppdage klinisk anvendelige tumormarkører og biomarkører [3], [7], [13].

miRNAs er en klasse av ikke-kodende små RNA som er involvert i post-translasjonell regulering av genekspresjon ved å inhibere både stabilitet og translasjon av mRNA [14]. Nyere bevis har vist at miRNA mutasjoner eller misexpression korrelerer med ulike kreft hos mennesker og indikerer at noen mirnas kan fungere som onkogener eller tumor suppressors [15], [16]. Å analysere RNA, er det alltid å vurdere sin stabilitet fra nedbrytning av RNase. Nyere funn tyder på at endogene plasma mirnas i blodprøver er stabilt påvises i en form som er resistent overfor RNase-aktivitet [17], vist ved identifikasjon av mirnas i kroppsvæsker slik som blod [17] - [24], urin [25], og spytt [10], [26].

Dyrkede kreftcellene har blitt brukt for å søke etter tumormarkører. Spesielt har identifisere proteiner og peptider utskilt i kulturmedier som er utviklet av proteomforskning basert tilnærming [27], [28]. Når det gjelder molekylær signatur i exosomes, har proteomforskning samt transcriptomics analyser blitt utført for å avdekke tumorgenese og identifisere tumor markør kandidater [2] - [4], [7], [29]. Her, for å identifisere miRNA relatert til tumorigenesis og metastasering, utførte vi omfattende miRNA analyse i tre cellulære fraksjoner, inkludert celler, exosomes og medium fra dyrkede celler. -Vurdering av data i disse intracellulære og ekstracellulære mirnas erholdt ved mikromatriseanalyse, har vi funnet at la-7 miRNA familien er rik på alle fraksjoner fra AZ-P7A-celler, en magekreft cellelinje som produserer homogen og kondensert morfologi og høy gjenvinning frekvensen av exosomal miRNAs. Disse funnene var forskjellig fra andre cellelinjer inkludert lungekreft cellelinjer (SBC-3, NCI-H69, og DMS53), tykktarmskreft cellelinjer (SW480 og SW620) og AZ-521, den foreldrecellelinje fra AZ-P7A. Tatt i betraktning at la-7 miRNA familie funksjoner hovedsakelig som tumorsuppressorgener [30] for å målrette onkogener som RAS Hotell og høy mobilitet gruppe A2 ( HMGA2
) [31], foreslår vi at AZ -P7a celler selektivt utskille la-7 mirnas i det ekstracellulære miljøet via exosomes å opprettholde sine tumorigene og metastatiske tilbøyeligheter.

Resultater

Isolering av exosomes fra ulike kreftcellelinjer

Exosomes fremstilles fra indre cellene til det ekstracellulære miljø via en exocytose-lignende bane [1]. I tillegg til kroppsvæsker så som serum og plasma fra perifert blod [7], [8], exosomes er funnet i mediet av dyrkede celler [7], tilrettelegging for identifikasjon av exosomal molekyler, inkludert proteiner, mRNA-er, og mirnas for det formål for deres kliniske anvendelse. Profilering slike exosomal molekyler som produseres i dyrkede kreftceller har ført til å oppdage en ny kandidat markør og antigen for kreftdiagnostikk og immunterapi [7]. I denne studien, for det formål å profilere exosomal mirnas, vi først isolert exosomes fra dyrkingsmedier av 46 cancercellelinjer med forskjellige typer vev, som inkluderer 8 for mage, 16 for lunge, 5 for kolon, 9 for bukspyttkjertel, 3 for prostata , og 5 for brystkreft. Etter at cellene ble dyrket i 48 timer, ble exosomes oppsamlet med en kombinasjon av suksessive sentrifugering og molekylvekt cut-off-membraner som er beskrevet i Materialer og Metoder. Deres renhet av exosomal fraksjoner ble fastslått ved analyse av transmisjonselektronmikroskopi og Western blotting. Transmisjonselektronmikroskopi viste rund-formede vesikulær membran struktur omtrent innen størrelse på 100 nm i diameter. Mellom tre cellelinjer, SBC-3, AZ-521, og AZ-P7A, er det av interesse at morfologien fra AZ-P7A celler var mer homogen og kondensert enn andre celler (figur 1A). Immunelek- mikroskopi viste at de ekstracellulære partikler isolert fra kulturmediet av AZ-P7A celler hadde immunoreaktivitet med et antistoff mot CD63, en av de exosomal membranproteiner, på kapselmembraner (figur 1B). Tilstedeværelsen av kjente exosomal proteiner inkludert CD29 /β1-inte, Aip1 /Alix og tumor mottakelighet gen 101 (Tsg101) ble bekreftet ved western blot analyse, mens et protein lokalisert til endoplasmatisk retikulum, Bip /grp78, var umulig å oppdage (figur 1C). Dette resultatet indikerer at forurensning av materialet som ble oppnådd fra andre cellulære avdelinger i exosomal fraksjonene var minimal. Utbyttet av exosomal proteiner fra AZ-P7A-celler var 10 ganger høyere enn den fra A-521 celler; ~2.5 Mg proteiner ble oppnådd fra 1 × 10 ^{8 AZ-P7A celler.}

Anriking av exosomal RNA avledet fra AZ-P7A celler

Etter isolering exosomal total RNA ble isolert fra 46 dyrkede cellelinjer. Interessant, RNA utbytter fra AZ-P7A celler var mye større enn de fra andre celler (figur 2A). Fordelingen i lengde viste tilstedeværelse av store mengder små RNA i exosomes (sentrale panel, figur 2B). Det bør bemerkes at det er en signifikant forskjell i totale exosomes og exosomal miRNA nivåer mellom pasienter med lunge-adenokarsinom og kontroller [8]. AZ-P7A-cellelinjen ble etablert ved gjentatt inokulering av foreldre AZ-521-celler i mus, resulterte i høy peritoneal-metastatisk potensiale [32], [33]. Således kan høye utbytter av både RNA og protein sammen med de morfologiske egenskaper i Ø-P7A celler tilskrives deres høye tumorigen og metastatiske tilbøyeligheter. Siden mirnas er påvist i cellefrie kroppsvæsker [17] - [20], også utførte vi direkte isolering av total RNA fra kulturmedium uten prosedyre for å isolere exosomes. Mengden av total RNA fra kultur media var generelt større enn de fra exosomes (figur 2A). RNA fordeling i lengde viste at miRNA fraksjoner ble påvist i området fra 10 til 40 nukleotid lengde i RNA fremstilt fra (høyre panel) kulturmedium samt exosomes (sentrale panel) fra AZ-P7A celler (figur 2B). I henhold til fremstillingen protokoll for Bioanalyzer, topper med lengre enn 40 nukleotid lengde inneholde andre små RNA inkludert tRNA ved 70~90, 5S ribosomalt RNA ved 100, og 5.8S ribosomal RNA ved 150, som observert i den intracellulære fraksjon (venstre panel) . Disse resultatene antyder at mirnas kan eksistere i dyrkningsmediet utenfor exosomal fraksjonen selv om RNA antas å være beskyttet fra RNasene som blir pakket i exosomes. Spesielt sammenlignet med adherente celler, økning av RNA-utbyttene var bemerkelsesverdig større i flytende celler (NCI-H69 og Lu-135) eller celler med blanding populasjoner av flytende og adherente celler (Colo205), som kan bli reflektert ved forurensning av RNA felle fra lyserte celler som har blitt stadig igjen i kulturmedier.

miRNA profilering av microarray analyse

miRNA profiler i de intracellulære og ekstracellulære fraksjoner ble bestemt av microarray analyse for syv kreftcellelinjer inkludert AZ- 521, AZ-P7A, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480, og SW620. Prøver fra dyrkningsmedier, samt exosomes tilgjengelig hybridiseringssignaler (figur 3), hvilket indikerer eksistensen av mirnas i disse prøvene. Opp til i dag, å analysere mikroarray data for miRNA blant prøver er det ingen klare fremgangsmåter blitt gjort for å normalisere signalintensiteten, siden det er vanskelig å finne et egnet materiale for intern standard [34]. Dermed har miRNA microarray data vært generelt analysert uten normalisering, forutsatt at den samlede inngangs RNA er konstant blant prøvene [34], [35]. I denne studien, etter snitt miRNA microarray data mellom to replikater, rangert vi mirnas henhold til deres signal intensiteter. Vi fant ut at la-7 miRNA familie som la-7a, la-7b, la-7c, la-7d, la-7e, la-7F, la-7g, og la-7i ble påvist med relativt høye signaler gjennom det meste av de intracellulære fraksjoner fra de syv cellelinjer (tabell 1, figur 3). Men ingen eller lite signal intensiteter for la-7 mirnas ble påvist i de ekstracellulære fraksjonene unntatt begge ekstracellulære fraksjoner fra AZ-P7A celler og kulturmedium brøkdel fra NCI-H69 celler (tabell 1, figur 3). Spesielt i både ekstracellulære fraksjoner fra AZ-P7A celler, hele åtte la-7 mirnas ble oppdaget selv om rangeringen av la-7g var lavere enn andre syv la-7 miRNAs. Basert på forskjellige mønstre av la-7 miRNA nivåer hos de tre cellulære fraksjoner, fordelt vi de syv cellelinjene inn i tre grupper (figur 3) som følger; (1) AZ-P7A, celler som lar-7 mirnas ble funnet i alle de tre fraksjonene, (2) AZ-521 sammen med SBC-3, DMS53, SW480, og SW620, celler som lar-7 mirnas ble generelt funnet i bare intracellulære fraksjoner, (3) NCI-H69, celler som lar-7 mirnas ble funnet i de intracellulære fraksjoner samt i kulturmediet i en viss grad.

RT-PCR-analyser av intracellulære og ekstracellulære brev 7 miRNA familie

Vi deretter utført kvantitativ RT-PCR for åtte la-7 miRNA familie å validere microarray data. la-7 mirnas lett ble påvist i de intracellulære og ekstracellulære fraksjoner fra AZ-P7A celler (figur 4A) og AZ-521 celler (figur 4B). Nivåene av la-7 mirnas per innsats RNA var generelt høyere i de ekstracellulære fraksjoner fra AZ-P7A celler enn fra AZ-521 celler. For å normalisere nivåer av target mirnas oppnådd ved RT-PCR, og U6 snRNA generelt blitt anvendt som en intern kontroll. Vi har observert at nærvær av U6 snRNA i alle tre fraksjoner fra AZ-P7A celler og AZ-521-celler (figur 4C) og deretter sammenlignet nivåene av la-7 mirnas mellom de tilsvarende fraksjoner fra disse to cellelinjene. Etter normalisering, nivåene av la-7 mirnas inkludert la-7a, la-7b, la-7c, la-7d, la-7e, og la-7i i begge fraksjonene av exosomes og kultur media fra AZ-521 celler senket sammenlignet med de fra AZ-P7A celler. Tvert i mot var det ingen stor forskjell i nivåene av det intracellulære la-7 mirnas. Vi neste sammenlignet nivået på exosomal la-7a fra AZ-P7A celler med de fra andre kreftcellelinjer inkludert SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480, og SW620, og funnet ut at den la-7a nivå bare fra SW620 celler var relativt nær (0,7 ganger) til nivået av AZ-P7A celler (figur 4E). Det skal bemerkes at det intracellulære nivå av la-7a fra SW620-celler var ca. 3,5 ganger mer rikelig enn det fra AZ-P7A celler. Basert på disse resultatene, antok vi lokalisering av la-7a i fraksjoner av celler og exosomes (figur 5), og gjennomførte ytterligere analyse. Normalisert ved U6 nivåer, vi beregnet relative nivåer av la-7a pakket i exosomes per nivåene av mobilnettet la-7a (figur 4F). Som et resultat vil mengden av exosomal la-7a var mye større i AZ-P7A celler enn andre seks celler, noe som antyder at AZ-P7A cellene ble selektivt og aktivt utskilt la-7 miRNA familie inn i det ekstracellulære miljøet via exosomes.

Diskusjoner

i denne studien har vi avdekket at la-7 miRNA familie ble utskilt i det ekstracellulære miljøet via exosomal transport, som var spesifikke for en magekreft med spredning cellelinje, AZ-P7A. la-7 miRNA familie i menneskelig består av 10 sekvenser fra 13 forløpere [30]. Generelt la-7 mirnas fungere som en tumor suppressor av målretting onkogener som RAS Hotell og HMGA2 Hotell og la-7 mirnas er nedregulert i mange kreftformer fra solide organer [31]. AZ-P7A celler har en metastatisk evne med peritoneal formidling i hårløse mus [32], [33]. Derfor foreslår vi at exosomal frigjøring av la-7 mirnas i det ekstracellulære miljøet, fører til reduksjon av anti-tumorgene virkning inne i cellene, noe som fører til å opprettholde sin onkogenese og invasivitet. På den annen side, la-7 mirnas sjeldnere spille en onkogen funksjon, på grunn av økning av ekspresjon av hypometylering ved la-7-locus [36] eller målretting caspase-3 mRNA [37]. I dette tilfellet kan exosomal utgivelsen av la-7 mirnas føre til endring i målceller ved å overføre sine onkogene egenskaper.

Hos pasienter med lungekreft, øke den totale nivåer av exosomes og deres mirnas sammenlignet med kontroller [8 ]. Det er blitt vist at kreft exosomes indusere immun flukt mekanisme i kreftformer ved spontan T-celle-apoptose [38] - [40]. I denne studien har vi vist homogen morfologi og anrikning av RNA i exosomes fra metastatisk AZ-P7A celler. Dette kan bli reflektert av sin tumorigenicity.

mirnas er veldig stabil i blodplasma og serum siden beskyttet mot RNases [17]. Dermed gjør det miRNA nivåer testet for klinisk diagnose som tumor markører og biomarkører. Hvordan skjer det? Chin et al. har foreslått to hypoteser for kilden mirnas på sirkulerende blodprøver; Det kan være på grunn av et resultat av tumor celledød og lyserer eller slipp av tumorceller inn i det ekstracellulære mikromiljøet av blodkar [19]. Tvert imot å heftende celler, observerte vi at mengdene av totalt RNA i kulturmedier var relativt høyere enn i exosomes for celler med flytende eiendom som NCI-H69, Lu-135, og Colo205. Denne økning sannsynligvis resulterte i forurensning av RNA fra døde celler i kulturmedier.

For oppdagelsen av nye blodtumormarkører og biomarkører, omics tilnærminger inkludert proteomikk og transcriptomics gjennomføres enten ved direkte analyse av blodprøver eller applikasjons av profilering i vevsprøver. Det er motstridende rapporter hvis vidt profilene til miRNA og mRNA i blodet er parallelle med svulsten profil. Signaturen til exosomal mirnas gjenspeiler at av opprinnelseskreftceller hos pasienter med lunge adenokarsinom [8] og brystkreft [41]. På den annen side, Skog et al. har vist at microarray analyse for mRNA avledet fra glioblastom celler og de tilsvarende exosomes avslørt mRNA utelukkende oppdaget i mikrovesikler, spekulerer at mRNA er lokalisert til et bestemt område av cytoplasma [3]. I tillegg, Tanaka et al. har vist at nivået av MIR-92A redusert i blodplasma fra akutt leukemi pasienter mens den sterke ekspresjon ble funnet i vevsprøver [24]. Våre resultater på selektiv anrikning av la-7 miRNA familie i AZ-P7A celler-avledet exosomes fit med sistnevnte tilfelle. Med mindre målmolekylene er mirnas avledet fra sirkulerende tumorceller, tyder det grundige undersøkelser for å bruke miRNA profiler i vevsprøver for deteksjon i serum eller plasma.

Siden exosomes er produsert i hematopoetiske celler samt epitelceller sirkulerte blodet inneholder exosomes avledet fra både type celler. Generelt, for å undersøke exosomal profiler av proteiner, mRNA, og mirnas i serum og plasma, er exosomes avledet fra tumorer med epiteliale egenskaper skilles fra de fra hematopoetiske celler [8], [13]. Dette blir utført ved anvendelse av affinitetsrensing med antistoffer mot molekyler slik som EpCAM som uttrykker på overflaten av epitelceller. Våre funn at det var tilsvarende nivåer av la-7 miRNA familien mellom exosomes og kultur media fra AZ-P7A celler tyder på at disse miRNA nivåer kan måles uten å isolere exosomes fra kliniske prøver som serum og plasma.

I konklusjon, denne studien viste at la-7 miRNA familien er rik på exosomes fra en magekreft med spredning cellelinje, AZ-P7A celler. Siden la-7 mirnas er involvert i spredning prosessen [31], deres exosomal sekresjon kan spille en viktig rolle i tumordannelse og metastasering.

Materialer og metoder

Cell kultur

humane magecancercellelinjer (AZ-521, MKN45, KATOIII, og NUGC-3), human lungecancercellelinjer (SBC-3, Lu-65, Lu-135, og KNS-62), og humane kreft i bukspyttkjertelen celler ( Suit-2) ble kjøpt fra japanske Innsamling av forsknings Bioressurser. Humane magecancerceller (SNU-1), human lunge-cancercellelinjer (DMS-53, DMS114, NCI-H69, A549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SK-MES-1, og HCC827), menneske mesothelioma celler (MSTO-H211), menneskelige kolorektal kreft cellelinjer (SW480, SW620, Colo205, LoVo, og HCT116, menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (BxPC-3, ASPC-en, Panc-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45, og CAPAN-2), human prostatacancercellelinjer (PC-3, SU145, og LNCaP), og humane brystcancercellelinjer (T-47D, MCF7, SK-BR-3, BT -474, og MDA-MB-231) ble kjøpt fra American Type Culture Collection. MKN28 (human magekreftceller) og PSN-en (menneskelig kreft i bukspyttkjertelen celler) ble kjøpt fra Immuno-Biologiske Laboratories og European Collection of Cell Culture, henholdsvis . menneske~~POS=TRUNC cellelinjer, AZ-P7A [32], [33] og MKN45P [42] var gave fra dr. Yutaka Yonemura og Yoshio Endo. I AZ-521 og A-P7A celler, ble ingen RT-PCR produktene observert for 14 retrovirus inkludert HPV16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, HIV1, HIV2, og ADV type 1 (data ikke vist), med unntak av infeksjon av disse retrovirus i begge cellelinjene . Celler ble opprettholdt i RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Invitrogen), 100 U /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin.

Produksjon og isolasjon av exosomes

Adherente celler ble sådd til 150 mm-retter på passende antall celler som strekker seg fra 3 x 10 ^{6 til 1 x 10 7 celler pr tallerken, mens flytende celler ble inokulert i 75 cm 2-kolbe på 2~2.5 × 10 7 celler per flaske. Celler ble dyrket i komplett RPMI-1640 medium med 25 ml og 50 ml for servise og kolber, henholdsvis i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO _{2, vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS), og inkuberes 48 timer i fenolrødt-fritt RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich) inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum som på forhånd var oppbrukt forurensende mikrovesikler med over natten sentrifugering ved 100.000 x g. Exosomes ble isolert fra celler totalt fra 6 x 10 7 For å 3 x 10 8 celler som tidligere beskrevet [29]. I korthet, ble kulturmediet oppsamlet og sentrifugert ved 800 x g i 5 minutter og ytterligere 2000 x g i 10 min for å fjerne løftede celler. Supernatanten ble underkastet filtrering på et 0,1 um pore polyetersulfon membranfilter (Corning) for å fjerne cellerester og større vesikler, etterfulgt av konsentrering av en 100000 Mw cut-off-membran (CentriPlus-70, Millipore). Volumet av supernatanten ble redusert fra omtrent 250 til 500 ml til omtrent 30 ml. Supernatanten ble deretter ultrasentrifugert ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C ved anvendelse av 70Ti rotor (Beckman Coulter). De resulterende pelleter ble resuspendert i 6 ml PBS og ultrasentrifugert ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C ved anvendelse av 100Ti rotor (Beckman Coulter).}}

Transmisjonselektronmikros

pelleterte exosomes ble blandet med like mengder nylaget 2% glutaraldehyd i PBS, inkubert over natten ved 4 ° C, postfiksert med 1% osmiumtetroksyd i PBS ved 4 ° C i 2 timer og dehydrert i en gradert serie av etanol. Etter dehydrering ble prøvene overført til propylenoksid og innleiret i epoksyharpiks Quetol 812 (Nisshin EM). Ultratynne snitt ble kuttet med ULTRACUT UCT (LEICA), farget med uranylacetat og bly citrate, og observert med JEM-1230 elektronmikroskop (JEOL). Immunelek- mikroskopisk analyse ble utført i henhold til metoden beskrevet av Xiao et al. [43] med mindre modifikasjoner. I korte trekk, ble exosomes blandet og inkubert med mus-anti-humant CD63 monoklonalt antistoff (katalog nr. Sc-51662, Santa Cruz) i 1 time ved romtemperatur. Prøven ble dryppet på membranoverflaten av en kobber mesh (collodion /karbon belagt 400 mesh, Nisshin EM) og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Etter vask med PBS, en immun konjugert geit-anti-mus IgG (katalog nr. EM.GMHL15, BBInternational) fortynnet 1:20 ble dryppet på membranen. Kobberet mesh ble fløtet i dråpene med dens membranoverflate som ligger ned ved romtemperatur i 30 min. Etter vask med PBS ble uranylacetat dråper satt inn på kobber mesh overflate og farget ved romtemperatur i 30 sek. Exosomes med svarte kolloidale gullpartikler på kapsel membranene ble merket som positivt under transmisjonselektronmikroskop.

Western blot analyse

Cells og exosomal fraksjoner ble vasket, resuspendert i en lysebuffer [7,5 M urea (Sigma-Aldrich), 2,5 M tiourea (Sigma-Aldrich), 12,5% glycerol (Wako), 50 mM Tris, 2,5% n-oktyl-beta-D-glukosid (Sigma-Aldrich), 6.25 mM Tris (2- karboksyetyl) fosfin-hydroklorid (Sigma-Aldrich), 1,25 mM protease inhibitor (katalog nr. P2714, Sigma-Aldrich)], og inkubert i 1 time ved 4 ° C ved hjelp av Rotator RT-50 (TAITEC). Etter sentrifugering ved 14000 x g i 60 minutter ved 4 ° C, supernatanten ble samlet og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av Bradford-proteinanalysesett (Bio-Rad). En porsjon av proteiner (10 ug) ble denaturert ved koking i Laemmli-prøvebuffer, kjørt på 10% SDS-polyakrylamidgeler, og overført til Immobilon-P PVDF-membraner (0,45 pm porestørrelse, Millipore). Blottene ble blokkert i 1 time med 5% ikke-fett tørrmelk i Tris-bufret saltvann som inneholdt Tween 20 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl og 0,01% Tween 20). Etter blokkering ble membranene inkubert med hver primære antistoff eller antiserum inkludert kanin-anti-Tsg101 serum (katalog nr. T5951, Sigma-Aldrich), geite-anti-Aip1 /Alix serum (katalog nr. Sc-49268, Santa Cruz), muse-monoklonalt anti-CD29 /β1-integrin (katalog nr. sc-610468, BD Biosciences), og muse-monoklonalt anti-Bip /grp78 (katalog nr. 610979, BD Biosciences) ved en fortynning på 1:200 i 1 time ved romtemperatur. Blottene ble deretter inkubert med den tilsvarende anti-IgG sekundært antistoff konjugert med pepperrot peroksidase (Jackson Laboratories) ved en fortynning på 1:2,000 i 1 time ved romtemperatur. Spesifikke proteiner ble visualisert ved hjelp av ECL-systemet (GE Healthcare) og FUJIFILM Lysende Bilde Analyzer LAS3000 (Fuji Film). Proteinet molekylvekt ble utledet ved hjelp av Precision Plus Protein Standards (Bio-Rad Laboratories).

RNA Isolation

For RNA isolering fra kulturmedium, ble cellene sådd ut som beskrevet ovenfor. 48 timer etter å ha vokst, kulturmedium ble samlet og sentrifugert ved 800 x g i 5 minutter og ytterligere 2000 x g i 10 min. Supernatanten ble underkastet filtrering på et 0,22 pm pore polyetersulfon membranfilter (Corning), etterfulgt av konsentrering med en 5000 Mw cut-off-membran (Centricon Plus-70, Millipore). Det endelige volum av supernatant var ca. 10-20 ml fra det opprinnelige volum på 250-500 ml. Supernatanten ble blandet med like stort volum av QIAzol Lysis reagens (Qiagen) og fulgte prosedyren for RNA isolering beskrevet nedenfor. Total RNA ble isolert fra celler, exosomes eller dyrkningsmedier ved hjelp av miRNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. For å fjerne genomisk DNA, 40 mikrogram cellulært total RNA ble inkubert med 40 enheter av RQ1 RNase-fri DNase (Promega) ved 37 ° C i 30 minutter i nærvær av 40 enheter RNasin Plus RNase inhibitor (Promega). For total RNA fra exosomes og dyrkningsmedier, ble alle mengder av råprodukter ble behandlet på samme måte, bortsett fra bruken av 5 U DNase. RNA ble renset ved hjelp av RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA prøver ble kvantifisert med en Nanodrop spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific) og vurdert ved hjelp av Agilent små RNA Kit og Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).

Microarray analyse

For miRNA profilering, 100 ng og 20 ng av cellulære og ekstracellulære total RNA, henholdsvis, var fluorescens-merket ved hjelp av miRNA Komplett Merking Reagens og Hyb Kit (Agilent Technologies) i henhold til produksjon protokoll (Agilent miRNA mikromatriser versjon 2.2). Den omfattende miRNA Analysen ble utført ved hjelp av menneskelige miRNA Microarray Kit (8 × 15 K) Ver.3.0 (Agilent). Hybridisering signaler ble påvist med DNA microarray Scanner (Agilent Technologies). De skannede bildene ble analysert ved bruk av Agilent Feature Extraction programvare og dataanalyse ble utført ved hjelp av GeneSpring GX programvare (Agilent Technologies). Dataene som er omtalt i dette manuskriptet har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO), og er tilgjengelig gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE21350: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE21350).

Revers transkripsjon (RT) og kvantitativ RT-PCR for miRNA analyse

kvantitativ miRNA nivåer ble bestemt ved hjelp av real-time RT-PCR med Applied Biosystems 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems), TaqMan® Gene Expression analyse (Applied Biosystems) for human la-7a (analyse ID 000377), la-7b (analyse ID 002619), la-7c (analyse ID 000379), la-7d (analyse ID 002283 ), la-7e (analyse ID 002406), la-7F (analyse ID 000382), la-7g (analyse ID 002282), la-7i (analyse ID 002221), og U6 snRNA (analyse ID 001973) som en endogen kontroll . Ti ng av total RNA ble utsatt for revers transkripsjon med TaqMan® Universal PCR Master Mix Ingen AmpErase (Applied Biosystems) og de respektive TaqMan® reagenser for målgener. RT-PCR ble utført i et totalvolum på 20 ul reaksjonsblanding i henhold til fremstillingen protokoll. Amplifikasjon ble utført som følger: 95 ° C i 10 minutter, 40 sykluser av 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 sek. Prøvene ble analysert i tre eksemplarer som biologisk replikere eller fire eksemplarer som teknisk replikere. De miRNA Nivåene ble definert fra syklusen terskel (Ct), den komparative Ct-metoden, og normalisering av nivået av U6 snRNA i hver prøve. Brett øker eller minsker i hvert miRNA nivå av cellelinjene som ble testet ble fastsatt med utgangspunkt i nivået av AZ-P7A cellelinje.

Takk

Vi takker medlemmene i Shizuoka Cancer Center Research Institute for sine mange nyttige forslag. Vi takker også legene. Yutaka Yonemura og Yoshio Endo for gaven av AZ-P7A og MKN45P cellelinjer.

• PLoS ONE: En Gene Expression underskrift ervervet Chemoresistance til Cisplatin og Fluorouracil Kombinasjon kjemoterapi hos pasienter med ventrikkelkreft
• PLoS ONE: Hypoksi-induserbar faktor 1α Bestemmer Gastric Cancer kjemosensitivitet via Modulation av p53 og NF-kB