PLoS ONE: Neka-7 mikrornk obitelj je selektivno izlučuje u izvanstanični okoliš preko Exosomes u metastatskim rakom želuca stanične linije

Sažetak pregled

Pozadina pregled

Exosomes igraju važnu ulogu u stanice na stanicu komunikacije, stanica ciljanje prenijeti exosomal molekule, uključujući proteine, mRNA, a mikroRNA (miRNAs) pomoću endocytosis- kao put. miRNAs su male nekodirajuće RNA molekule u prosjeku 22 nukleotida u dužini koji reguliraju brojne biološke procese, uključujući rak patogeneze i posreduju gen podregulacijsku ciljajući mRNA da se potakne razgradnju RNA i /ili ometa prijevod. Nedavna izvješća upućuju na to da miRNAs može se stabilno detektirati u cirkulaciji u plazmi i serumu, jer su miRNAs pakirana od exosomes se treba zaštititi od razgradnje RNA. Dakle, profiliranje exosomal miRNAs imaju potrebu razjašnjenja međustanične signalizacije i otkriti marker novu bolest, kao dobro. Pregled

Metodologija /glavne nalaze

Exosomes bili izolirani od uzgojenih staničnim linijama karcinoma i njihova kvaliteta je potvrđen analizama transmisijskim elektronskim mikroskopom i zapadne upijajući. Jedan od ispitanih staničnih linija, metastaza raka želuca stanična linija, AZ-P7a pokazala najveći prinos RNA u objavljenim exosomes i karakterističan oblik u morfologiju. Osim toga, RNA izolirane su iz stanica i kulture medija, i profila od tih triju Mirna frakcije dobivene su pomoću microarray analize. Usporedbom intenziteta signala u microarray podatke i sljedeće provjere valjanosti pomoću RT-PCR analizu, ustanovili smo da neka-7 obitelj Mirna je u izobilju u oba intracelularne i ekstracelularne frakcija iz AZ-P7a stanicama, dok niske metastatskim AZ-521, roditeljske stanice linija AZ-P7a, kao i druge stanične linije karcinoma ne pokazuju takvu sklonost. pregled

Zaključci /Značaj pregled

obogaćivanje neka-7 obitelji Mirne na izvanstanične frakcije, naročito u exosomes iz AZ-P7a stanica može odražavati njihove onkogene karakteristike, uključujući tumorigenezi i metastaze. Budući da je neka-7 miRNAs općenito imaju tumor-supresije ulogu kao ciljanje onkogeni, kao što su RAS pregled i HMGA2 pregled, naši rezultati ukazuju na to da AZ-P7a stanice otpuštaju neka-7 miRNAs putem exosomes Into the vanstanični okoliš za održavanje njihove onkogenezom pregled

Izvor. Ohshima K, Inoue K, Fujiwara A, Hatakeyama K, Kanto K, Watanabe Y, et al. (2010) Da-7 mikrornk Family selektivno izlučuje u izvanstaničnoj okolini preko Exosomes na metastatskim rakom želuca stanične linije. PLoS ONE 5 (10): e13247. doi: 10,1371 /journal.pone.0013247 pregled

Urednik: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Njemačka pregled

Primljeno: 14. travnja, 2010; Prihvaćeno: 10. rujna 2010; Objavljeno: 8. listopada 2010 pregled

Copyright: © 2010 Ohshima et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Rad je podržan od strane grant u suradnji s inovativnom tehnologijom i Advanced Research in evolucijskog područja (gradsko područje) od Ministarstva obrazovanja, kulture, športa, znanosti i tehnologije Japana. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

stanice izlučuju različite vrste malih vezikula membrana. Exosomes jedan od vezikule s 30-100 nm promjera fizikalno različita od ostalih izlučenih vezikula [1]. Unutar exosomes, stanični genski proizvodi uključujući i proteina, mRNA, a mikroRNA (miRNAs) su zapakirane i ove molekule mogu se prenijeti na stanicama primatelja da dostavi svoju molekularnu signalizaciju kao što onkogcnczom [2] - [4] i imunološki odgovor [1], [ ,,,0],5]. Exosomes otpuštaju mnogim tipovima stanica [6] koje su tumorske stanice, epitelne stanice, i hematopoetske stanice, kao što su retikulocita, citotoksični T limfociti, Epstein-Barr virus transformira B stanice, mastociti, stanice dendrita, i pločice. Izlučeni exosomes su izolirani i karakterizirani in vitro pregled iz staničnih linija u kulturi [7], zajedno s in vivo pregled u tjelesnim tekućinama [7], uključujući krv [8], urina [9], sline [10], amnionska tekućina [11], a maligni pleuralni izljev krvi [12]. Od promatrati u mnogim rastućim tipova stanica, moguće je da se pogoršati tumorske stanice, što potvrđuju i njihove povećane prisutnosti u plazmi i pleuralnog izljeva pacijenata s rakom [8], [12]. Ova povećana prisutnost u neinvazivnim tjelesnim tekućinama pacijenata oboljelih od raka povećan je na profilu molekularne komponente u exosomes za otkrivanje klinički korisnih tumorske markere i biomarkera [3], [7], [13].

miRNAs su klasa nekodirajuće malih RNA koji su uključeni u post-translacijske regulaciji ekspresije gena inhibirajući stabilnost i prijevod mRNA [14]. Nedavni dokazi pokazuju da je Mirna mutacije ili misexpression korelaciji s različitim ljudskim raka i ukazuju na to da su neki miRNAs može funkcionirati kao onkogena ili tumorske smetnji [15], [16]. Za analizu RNA, to je uvijek uzeti u obzir njihovu stabilnost od razgradnje RNaza. Nedavna otkrića pokazuju da endogena plazmi miRNAs u uzorcima krvi su stabilno detektirati u obliku koji je otporan na RNase aktivnost [17], dokazuje odredivanjem miRNAs u tjelesnim tekućinama kao što je krv [17] - [24], urin [25] i sline [10], [26]. pregled

Uzgojene stanice raka koriste se za traženje tumorskih biljega. Konkretno, prepoznavanje proteini i peptidi luče u medij kulture je razvijen od strane proteomika pristup temeljen [27], [28]. Što se tiče molekularne potpisa u exosomes, proteomika kao transkriptomika analize su provedene da bi se otkrilo tumorigenezi i identificirati tumorski marker kandidate [2] - [4], [7], [29]. Evo, identificirati Mirna odnose na tumorigenezi i metastaza, proveli smo široku analizu Mirne u tri staničnih frakcija, uključujući stanice, exosomes i medija iz stanica u kulturi. Poredak podatke tih intracelularne i ekstracelularne miRNAs dobivenih microarray analize, otkrili smo da je obitelj neka-7 Mirna je bogata svim frakcijama iz AZ-P7a stanicama, metastatski rak želuca stanična linija koja proizvodi homogenu i kondenzirano morfologiju, a visoka oporavak stopa exosomal miRNAs. Ovi rezultati su različita od ostalih staničnih linija, uključujući karcinom pluća staničnih linija (SBC-3, NCI-H69 i DMS53), kolorektalnog raka stanične linije (SW480 i SW620) i AZ-521, roditeljskoj liniji stanica AZ-P7a. S obzirom da su neka-7 funkcija obitelji Mirna uglavnom kao tumor supresorski geni [30] ciljati onkogeni, kao što su RAS pregled i visoka pokretljivost skupina A2 ( HMGA2 pregled) [31], predlažemo da AZ -P7a stanice selektivno luče neka-7 miRNAs u izvanstanični okoliš kroz exosomes za održavanje njihove tumorskih i metastatskih sklonosti. pregled

Rezultati

Izolacija exosomes iz stanične linije raznih karcinoma

Exosomes su proizvedeni iz unutarnjeg stanica u izvanstanični okoliš putem eksocitozu nalik puta [1]. Osim tjelesnim tekućinama kao što seruma i plazme iz periferne krvi [7], [8], exosomes nalaze u mediju uzgojenih stanica [7], olakšava identificiranje exosomal molekula uključujući bjelančevine, mRNA, te miRNAs za cilj za njihovu kliničku uporabu. Profiliranje takve exosomal molekule proizvedene u kulturi stanica raka doveli otkriti novi kandidata marker i antigen za dijagnostiku raka i imunoterapija [7]. U ovoj studiji, u svrhu profila exosomal miRNAs, najprije izoliran exosomes iz medija kulture 46 kanceroznih staničnih linija s različitim vrstama tkiva, što uključuje 8 za želudac, 16 za pluća, 5 za debelo crijevo, 9 za gušterače, 3 za prostatu i 5 za prsa. Nakon Stanice su uzgajane 48 sati, exosomes su sakupljene s kombinacijom sukcesivnog centrifugiranje i molekulske mase cut-off membrane kao što je opisano u materijalima i metodama. Njihova čistoća exosomal frakcija je procijenjena pomoću analize transmisijskim elektronskim mikroskopom i zapadne upijajući. Transmisijskim elektronskim mikroskopom pokazala je okruglog oblika vezikularnih membranske strukture u predjelu veličine od 100 nm u promjeru. Među tri stanične linije, SBC-3, AZ-521 i AZ-P7a, to je od interesa da je morfologija iz AZ-P7a stanica je više homogena i kondenzira od ostalih stanica (Slika 1A). Immunoelectron mikroskopija je pokazala da su izvanstanični čestice izolirani iz medija kulture AZ-P7a stanicama imali imunoreaktivnost s protutijelom CD63, jedan od exosomal membranskih proteina, na kapsularni membrane (Slika 1B). Prisutnost poznatih exosomal proteina, uključujući CD29 /β1-integrin, Aip1 /Alix i gen tumorskog osjetljivosti 101 (Tsg101) potvrđeno Western blot analizom, a protein lokaliziran u endoplazmatski retikulum, Bip /Grp78 bio undetectable (Slika 1C). Ovaj rezultat pokazuje da je kontaminacija materijal koji je izveden od ostalih staničnih odjeljaka u exosomal frakcijama je minimalna. Je prinos exosomal proteina iz AZ-P7a stanica je bila 10 puta veća od one od AZ-521 stanice; ~2.5 Mg proteina dobivene su od 1 × 10 ^{8 AZ-P7a stanicama. Pregled}

Obogaćivanje exosomal RNA dobivenih iz AZ-P7a stanica pregled

Nakon izolacije, exosomal ukupni RNA su izolirani iz 46 uzgojene stanične linije. Zanimljivo je da su RNK prinosi iz AZ-P7a stanicama je bila mnogo veća od onih iz drugih stanica (Slika 2a). Distribucija u dužini pokazala prisutnost velikih količina malih RNA u exosomes (središte ploče, slika 2b). Treba napomenuti da postoji značajna razlika u ukupnoj exosomes i exosomal Mirna razinama između bolesnika s adenokarcinoma pluća i kontrole [8]. AZ-P7a stanična linija je uspostavljena ponovljenom inokulacije sa roditeljskih AZ-521 stanica kod miševa, rezultirala je visokom peritonealnoj-metastatskim potencijalom [32], [33]. Dakle, visoki prinosi obje RNA i proteina uz morfoloških obilježja u AZ-P7a stanica može se pripisati njihovim visokim tumorskih i metastatskih sklonostima. Jer miRNAs otkriveni su u stanično slobodnim tjelesnih tekućina [17] - [20], također izvodi izravnu izolaciju ukupne RNA iz medija kulture bez postupka izoliranja exosomes. Iznosi ukupne RNA iz kulture medija uglavnom su bili veći od onih iz exosomes (Slika 2). Raspodjela RNA duljine su pokazali da je Mirni frakcije otkrivena u rasponu od 10 do 40 nukleotida duljine u RNA koje su priređene iz hranjivog medija (donji dio), kao i exosomes (središte ploče) od AZ-P7a stanica (slika 2B). Prema proizvodnju protokola za Bioanalyzer, vrhovi s više od 40 dužine nukleotida sadržavati i druge male RNA, uključujući tRNAs na 70~90, 5S ribosomskc RNA na 100 ° C, a 5.8S ribosomskc RNA na 150, što je uočeno u unutarstanični dio (lijeva ploča) , Ovi rezultati sugeriraju da miRNAs mogu postojati u mediju kulture izvan exosomal frakcije iako RNA Vjeruje se da zaštićena od RNases kako se pakiraju u exosomes. Posebno, u usporedbi s vezanim stanicama, prirast RNA prinosa je znakovito veći u plutajuće stanice (NCI-H69 i Lu-135) ili stanice sa mix populacije pluta i vezanim stanicama (ColO205), koji može biti reflektirana od kontaminacije od RNA prolio iz lizirane stanice koji su stalno lijevo u kulturi medija. pregled

Mirna profiliranje po microarray analiza Netlogu

Mirna profili u intracelularne i ekstracelularne frakcije određena su analize mikropolja sedam staničnim linijama karcinoma, uključujući AZ- 521, AZ-P7a, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480, i SW620. Uzorci iz kulture medija, kao i exosomes predviđene hibridizacije signala (slika 3), što ukazuje na postojanje miRNAs u tim uzorcima. Do sada je, analizirajući Microarray podatke za MIRNA među uzorcima, nema jasnih metode su napravljene za normalizaciju intenzitetu signala, jer je teško naći odgovarajući interni standard materijala [34]. Dakle, Mirna microarray podaci su općenito analizirani bez normalizacije, uz pretpostavku da je ukupna količina ulaznih RNA konstantne među uzorcima [34], [35]. U ovom istraživanju, nakon prosječno Mirna Microarray podataka između dva ponavljanja, rangirani smo miRNAs prema njihovim intenziteta signala. Otkrili smo da je neka-7 obitelj Mirna kao neka-7a, neka-7b, neka-7c, neka-7d, neka-7e, neka-7f, neka-7g, i neka-7i su otkrivene s relativno visokim signala kroz većinu unutarstaničnih frakcija iz stanične linije sedam (Tablica 1, Slika 3). Međutim, bez ili s malo intenziteta signala za neka-7 miRNAs otkrivene su u ekstracelularne frakcije osim oba izvanstaničnog frakcija iz AZ-P7a stanice i kulture srednje frakcije iz NCI-H69 stanica (Tablica 1, Slika 3). Posebno, u oba ekstracelularne frakcija iz AZ-P7a stanice, svih osam neka-7 miRNAs su otkrivene iako je rang neka-7g bila je niža od ostalih sedam neka-7 miRNAs. Na temelju različitih obrazaca omogućuju-7 razina Mirna među tri staničnim frakcijama, podijelili smo sedam staničnih linija u tri skupine (Slika 3) kako slijedi; (1) AZ-P7a, stanice miRNAs pronađeni su u sva tri frakcije koje 7 pusti, (2) AZ-521, zajedno s SBC-3, DMS53, SW480, i SW620, stanice koje omogućuju-7 miRNAs su općenito naći u Samo unutarstanični frakcije, (3) NCI-H69, stanice koje omogućuju-7 miRNAs pronađeni su u intracelularne frakcija i u mediju za kulturu do neke mjere. pregled

RT-PCR analize unutarstanične i izvanstanične let- 7. Mirna obiteljska pregled

Nakon toga provedena kvantitativna RT-PCR za osam neka-7 Mirna obitelji za provjeru valjanosti podataka microarray. neka-7 miRNAs lako su detektirani u intracelularne i ekstracelularne frakcija iz AZ-P7a stanica (slika 4a) i AZ-521 stanicama (slika 4b). Razine neka-7 miRNAs po ulaznim RNA su općenito veći u izvanstaničnoj frakcija iz AZ-P7a stanica nego iz AZ-521 stanicama. Normalizaciju razine ciljnih miRNAs dobivenih pomoću RT-PCR, U6 snRNA je općenito korišten kao internom kontrolom. Uočili smo prisutnost U6 snRNA u sve tri frakcije iz AZ-P7a stanica i AZ-521 stanicama (Slika 4c), a zatim u odnosu na razine omogućuju-7 miRNAs između odgovarajućih frakcija iz ove dvije stanične linije. Nakon normalizacije, razine omogućuju-7 miRNAs uključujući neka-7a, neka-7b, neka-7c, neka-7d, neka-7E, i neka-7i u obje frakcije exosomes i kulture medija iz AZ-521 stanice bile spušta u usporedbi s onima iz AZ-P7a stanica. Naprotiv, nije bilo velike razlike u razinama unutarstaničnom omogućuju-7 miRNAs. Potom smo u odnosu na razinu exosomal neka-7a iz AZ-P7a stanica s onima iz drugih staničnim linijama karcinoma, uključujući SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480, i SW620, i utvrdili da je razina neka-7a samo SW620 stanica bio je relativno blizu (0,7 puta) na razini iz AZ-P7a stanica (Slika 4e). Treba primijetiti da je intracelularni nivo neka-7a iz SW620 stanica bila je oko 3,5 puta više u izobilju nego iz AZ-P7a stanica. Na temelju tih rezultata, pretpostavili smo lokalizaciju neka-7a u frakcijama stanica i exosomes (slika 5), ​​a provodi daljnje analize. Normalizira razine U6, izračunali smo relativne razine neka-7a zapakirane u exosomes po razinama stanični neka-7a (slika 4F). Kao rezultat toga, iznos exosomal neka-7a bio mnogo veći u AZ-P7a stanica od ostalih šest stanica, što ukazuje da AZ-P7a stanice su selektivno i aktivno izlučuje neka-7 Mirna obitelj u izvanstanični okoliš preko exosomes. Pregled

Rasprava pregled

u ovom istraživanju, otkrili smo da je obitelj neka-7 Mirna se izlučuje u izvanstanični okoliš preko exosomal prometa, što je specifična za metastatskim rakom želuca stanične linije, AZ-P7a. neka-7 Mirna obitelj u čovjeka sastoji se od 10 sekvenci iz 13 prekursora [30]. Općenito, neka-7 miRNAs djelovati kao supresor tumora s onkogena ciljanje, kao što su RAS pregled i HMGA2 pregled i neka-7 miRNAs su regulirani u mnogim raka od solidnih organa [31]. AZ-P7a stanice posjeduju metastatske sposobnost s peritonejskom širenje na miševe [32], [33]. Dakle, predlažemo da exosomal oslobađanje neka-7 miRNAs u izvanstanični rezultata okoliša u smanjenju anti-tumorskih učinka unutar stanica, što dovodi do održati svoj razvoj raka i invazivnosti. S druge strane, neka-7 miRNAs rjeđe igraju onkogeni funkciju, a radi povećanja izražavanja hypomethylation na neka-7 lokusa [36] ili ciljanje kaspaze-3 mRNA [37]. U tom slučaju, exosomal oslobađanje neka-7 miRNAs može izazvati transformaciju u ciljnim stanicama prenoseći svoje onkogene svojstva. Pregled

U bolesnika s rakom pluća, ukupna razina exosomes i njihovi miRNAs porast u odnosu na kontrolnu skupinu [8 ]. Pokazano je da tumorske exosomes inducirati imuni bijeg mehanizam u karcinomima spontanom T stanica apoptozom [38] - [40]. U ovom istraživanju, pokazali smo homogene morfologije i obogaćivanje RNA u exosomes s metastatskim AZ-P7a stanica. To bi se moglo odraziti po svojoj torn smjeru. Pregled

miRNAs su vrlo stabilni u krvnoj plazmi i serumu jer zaštićena od RNases [17]. Dakle, čini razine Mirna testirani za kliničku dijagnozu kao tumorskih markera i biomarkera. Kako se to dogodilo? Chin et al. predložili su dvije hipoteze za izvoru miRNAs o cirkulaciji uzoraka krvi; to može biti zbog posljedica smrti i lizira tumorskih stanica ili oslobađanje od tumorskih stanica u izvanstanični okoliš krvnih žila [19]. Naprotiv vezanim stanicama, primijetili smo da su iznosi ukupne RNA u mediju kulture su relativno veći nego u exosomes za stanice s pomičnim imovine, kao što su NCI-H69, Lu-135 i ColO205. Ovo povećanje je vjerojatno rezultiralo zagađenosti RNA iz mrtvih stanica u kulturi medija. Pregled

Za otkrivanju novih tumorskih krvnih markera i biomarkera, omics pristupi uključujući proteomika i transkriptomika provode bilo izravnom analizom uzoraka krvi ili prijavi za profiliranje u uzorcima tkiva. Postoje kontradiktorni izvještaji ukoliko je bilo da su profili Mirne i mRNA u krvotok su paralelno s profilu tumora. Potpis exosomal miRNAs odražava onaj podrijetlom tumorskih stanica u bolesnika s adenokarcinoma pluća [8] i raka dojke [41]. S druge strane, Skog et al. pokazali su da su analize mikropolja za mRNK izvedene iz stanica glioblastoma i odgovarajućih exosomes pokazale mRNA isključivo detektirana u microvesicles, nagađa da mRNA lokaliziran na specifična područja citoplazme [3]. Osim toga, u Tanaka et al. su pokazali da je razina Mir-92a smanjen u krvnoj plazmi pacijenata akutne leukemije, a njegova snažna ekspresija u uzorcima tkiva [24]. Rezultati istraživanja o selektivnom obogaćivanje neka-7 obitelji Mirna u AZ-P7a stanica-izvedeni exosomes stane sa drugom slučaju. Osim ako ciljne molekule su miRNAs izvedeni iz cirkulirajućih tumorskih stanica, što ukazuje na pažljiv istragu potrebno je koristiti Mirna profila iz uzoraka tkiva za detekciju u uzorcima seruma ili plazme. Pregled

S obzirom da se exosomes proizvode u hematopoetskih stanica, kao i epitelnim stanicama cirkulira krv sadrži exosomes iz oba tipa stanica. U principu, da istraži exosomal profile proteina, mRNA, i miRNAs u serumu i plazmi, exosomes izvedeni iz tumora epitelnog karakteristikama odvajaju od onih iz hematopoetskih stanica [8], [13]. Ovo se izvodi uporabom afinitetnog pročišćavanja s antitijelima protiv molekula poput EpCAM koje izražavaju na površini epitela. Naša otkrića da su slične razine neka-7 obitelji Mirna između exosomes i kulture medija iz AZ-P7a stanica ukazuju na to da su te razine Mirna može se mjeriti bez izolacije exosomes iz kliničkih uzoraka poput seruma i plazme. Pregled

zaključak, ovo istraživanje je pokazalo da je neka-7 Mirna obitelj je bogata exosomes iz metastatskim rakom želuca stanične linije, AZ-P7a stanica. Budući da su neka-7 miRNAs koji su uključeni u proces proliferacije [31], njihova exosomal izlučivanje može igrati važnu ulogu u nastanku tumora i metastaza. Pregled

Materijali i metode pregled

Kultura stanica pregled

ljudska raka želuca stanične linije (AZ-521, MKN45, KATOIII i NUGC-3), humani pluća stanične linije raka (SBC-3, Lu-65, Lu-135, a KNS-62), i ljudske stanice raka gušterače ( odijelo-2) kupljeni su iz japanske zbirke Research Bioresources. Stanice ljudskog raka želuca (SNU-1), humani karcinom pluća stanične linije (DMS-53, DMS114, NCI-H69, 549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SK-MES-1, i HCC827), humani mesothelioma stanice (MSTO-H211), ljudskih staničnih linija raka debelog crijeva (SW480, SW620, Colo205, LoVo, i HCT116, staničnih linija raka gušterače (BxPC-3, ASPC-1, PANC-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45 i Capan-2), ljudskim staničnim linijama raka prostate (PC-3, SU145 i LNCaP), te ljudske stanične linije raka dojke (T-47D, MCF7, SK-BR-3, BT -474, a MDA-MB-231) su kupljeni od American Type Culture Collection. MKN28 (ljudskim stanicama raka želuca) i PSN-1 (ljudske stanice gušterače) kupljeni su od Immuno-biološke laboratorije i europskih Zbirka stanične kulture, odnosno . humanih stanica karcinoma želuca, AZ-P7a [32], [33] i MKN45P [42] su dar dr. Yutaka Yonemura i Yoshio Endo. U AZ-521 i AZ-P7a stanica, nisu opažene RT-PCR produkti 14 retrovirusa uključujući HPV16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, HIV1, HIV2 i ADV tipa 1 (podaci nisu prikazani), osim infekcije te retrovirusa u obje stanične linije , Stanice su održavane u RPMI-1640 mediju (Sigma-Aldrich), uz dodatak 10% toplinski inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (Invitrogen), 100 U /ml penicilina i 0.1 mg /ml streptomicina.

priprave i izolacije od exosomes

drže čvrsto stanice su posađene na 150 mm jela na odgovarajući broj stanica u rasponu od 3 × 10 ^{6-1 × 10 7 stanica po zdjelici, a plutajuće stanice su inokulirane u 75 cm 2-tikvica kod 2~2.5 × 10 7 stanica po tikvici. Stanice su kultivirane u kompletnom RPMI-1640 mediju od 25 ml i 50 ml za suđe i boce, odnosno, 24 sata na 37 ° C i 5% CO _{2, isprane dva puta s fosfatom-puferiranom fiziološkom otopinom (PBS), i inkubirane 48 h na fenol-crvenog RPMI-1640 medij (Sigma-Aldrich) koji sadrži 10% toplinom inaktiviranog fetalnog telećeg seruma koji je prethodno ispražnjeni kontaminirajućih microvesicles centrifugiranjem preko noći na 100000 x g. Exosomes su izolirane iz ukupnog broja stanica u rasponu od 6 × 10 7 3T 10 8 stanica kao što je ranije opisano [29]. Ukratko, medij za kulturu se sakupi i centrifugira pri 800 × g tijekom 5 minuta i dodatnih 2.000 × g tijekom 10 min da se uklone ukinuti stanice. Supernatant je podvrgnut filtracijom na 0.1 um pora polietersulfonski membranski filter (Corning), kako bi se odstranio talog i velikih vezikula, zatim koncentracijom od 100,000 cut-off membranu (centriplus-70, Millipore). Volumen supernatant smanjuje sa otprilike 250-500 ml do oko 30 ml. Supernatant je zatim ultracentrifugiran na 100,000 × g kroz 1 sat na 4 ° C pomoću 70Ti rotor (Beckman Coulter). Dobivene pelete se ponovno suspendiraju u 6 ml PBS i ultracentrifugiran na 100,000 × g kroz 1 sat na 4 ° C pomoću 100Ti rotor (Beckman Coulter). Pregled}}

transmisijskim elektronskim mikroskopom pregled

nakupina exosomes su pomiješani s jednakim količinama svježe pripravljenog 2% glutaraldehida u PBS, inkubirane preko noći na 4 ° C, postfiksirana s 1% osmij tetraoksidom u PBS na 4 ° C tijekom 2 sata, te dehidrirani u gradiranog niza etanola. Nakon dehidracije, uzorci su prebačeni u propilen oksida i ugrađen u epoksidnom smolom Quetol 812 (nisshin EM). Veoma tanki rezovi su s Ultracut du (LEICA), obojeni s uranyl acetata i dovesti citrata i promatrajući sa JEM-1230 elektronskim mikroskopom (JEOL). Immunoelectron mikroskopska analiza provedena je u skladu s postupkom opisanim u Xiao et al. [43] uz manje modifikacije. Ukratko, exosomes se pomiješa i inkubira s mišjim anti-humanim CD63 monoklonsko protutijelo (kat. Sc-51.662, Santa Cruz) tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Uzorak je pao na površinu membrane bakrene mreže (kolodij /ugljen obložen 400 mesh, nisshin EM) i inkubirana tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja s PBS, immunogold konjugiranim anti-mišjim IgG (kat. EM.GMHL15, BBInternational) razrijeđen na 1:20 je pao na membranu. Bakar mesh se flotirala u kapljicama s njezinim membranskim površina s kojima se suočavaju se na sobnoj temperaturi 30 min. Nakon ispiranja s PBS, urana acetat kapi se nanese na površinu bakra mreže i obojeni na sobnoj temperaturi tijekom 30 s. Exosomes s crnim koloidne čestice zlata na kapsularni membrane su označeni kao pozitivni pod transmisijskim elektronskim mikroskopom. Pregled

Western blot analiza pregled

Stanice i exosomal frakcije su isprane, ponovno suspendiran u puferu za lizu [7,5 M urea (Sigma-Aldrich), 2,5 M tiourea (Sigma-Aldrich), 12,5% glicerol (Wako), 50 mM Tris, 2,5% n-oktil-beta-D-glukozid (Sigma-Aldrich), 6,25 mM Tris (2 karboksietil) fosfin hidroklorida (Sigma-Aldrich), 1,25 mM inhibitora proteaze (kat. P2714, Sigma-Aldrich)], te inkubira 1 sat na 4 ° C pomoću okretaljka RT-50 (TAITEC). Nakon centrifugiranja na 14.000 × g tijekom 60 min na 4 ° C, supernatant je sakupljen i koncentracija proteina je određena Bradfordovim komplet za određivanje proteina (Bio-Rad). Dio proteina (10 ug) se denaturira kuhanjem u Laemmli puferu uzorka, rad na 10% SDS-poliakrilamidnim gelovima i prenese Immobilon P-PVDF membrane (0.45 veličine um pora, Millipore). Mrlje su blokirane 1 h sa 5% bezmasnim sušenim mlijekom u Tris-puferiranoj fiziološkoj otopini koja sadrži Tween 20 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl i 0,01% Tween 20). Nakon blokiranja membrane se inkubiraju sa svakog primarnog antitijela ili antiseruma uključujući kunićjeg protu-Tsg101 seruma (kat. T5951, Sigma-Aldrich), kozjim anti-Aip1 /Alix seruma (kat. Sc-49.268, Santa Cruz), mišje monoklonsko anti-CD29 /β1-integrin (kat. sc-610.468, BD Biosciences), te mišje monoklonsko anti-Bip /Grp78 (kat. 610.979, BD Biosciences) pri razrjeđenju 1:200 za 1 sat na sobnoj temperaturi. Mrlje su tada bili inkubirani s odgovarajućim anti-IgG sekundarnim protutijelom konjugiranim s peroksidazom iz hrena (Jackson Laboratories) pri razrjeđenju 1:2,000 tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Specifični proteini su vizualizirani pomoću sustava ECL (GE Healthcare), a FUJIFILM FOTOLUMINESCENTNOSTI slike Analyzer LAS3000 (Fuji Film). Protein molekularne težine bio je izveden pomoću Precision Plus Protein standarda (Bio-Rad Laboratories). Pregled

Izolacija RNA pregled

izolaciju RNA iz medija za kulturu, stanice su nasađene na gore opisani način. 48 h nakon narasla, medij za kulturu se sakupi i centrifugira pri 800 × g tijekom 5 minuta i dodatnih 2.000 × g tijekom 10 minuta. Supernatant je podvrgnut filtracijom na 0,22 um pora polietersulfonski membranski filter (Corning), slijedi koncentracija s 5,000 molarne graničnu membranu (Centricon Plus-70, Millipore). Krajnji volumen supernatant je približno 10-20 ml od originalnog volumena od 250-500 ml. Supernatant je pomiješan sa jednakom zapreminom QIAzol reagensom za liziranje (Qiagen) i zatim postupak za izolaciju RNA opisane u nastavku. Ukupna RNA je izolirana iz stanica, exosomes ili kulture medija pomoću miRNeasy Mini Kit (Qiagen) prema uputama proizvođača. Ukloniti genomske DNA, 40 ug stanične ukupne RNK su inkubirani sa 40 jedinica RQ1 bez Rnase DNaze (Promega) na 37 ° C tijekom 30 minuta, u prisustvu 40 jedinica RNAsin Plus inhibitora RNAze (Promega). Za ukupne RNK iz exosomes i mediju za kulturu, sve količine sirovi produkti se tretiraju u istom postupku, osim primjenu 5 U DNaze. RNA je pročišćena pomoću čišćenje Kit RNeasy MinElute (Qiagen) prema uputama proizvođača. Uzorci RNK su kvantificirani s NanoDrop spektrofotometar (Thermo Fisher Scientific) i procijeniti pomoću Agilent Mali RNA Kit i Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Pregled

Microarray analiza pregled

Za Mirna profiliranje, 100 ng i 20 ng staničnim i vanstaničnim ukupne RNA, pojedinačno, bile u fluorescencije označen pomoću Mirni Cijela reagens za označavanje i Hib Kit (Agilent Technologies), sukladno protokolu proizvođača (Agilent Mirni microarrays verzija 2.2). Sveobuhvatni Analiza Mirna je izvedena pomoću Human Mirna Microarray Kit (8 × 15 K) Ver.3.0 (Agilent). Hibridizaciju signali su detektirane s mikropolja skener DNA (Agilent Technologies). Skenirane su slike su analizirane pomoću Agilent određivanja značajki softvera i analiza podataka je izvršena pomoću GeneSpring GX softvera (Agilent Technologies). Podaci o kojima se raspravlja u ovom rukopisu su deponirani u NCBI je Gene Expression Omnibus (GEO), a dostupne su putem GEO serije pristupnim brojem GSE21350: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE21350). pregled

reverzne transkripcije (RT) i kvantitativne RT-PCR za Mirne analizu Netlogu

Kvantitativna Mirna razine utvrđene su primjenom u realnom vremenu RT-PCR s Applied Biosystems 7900 sustav HT Sequence Detection (Applied Biosystems), TaqMan® Gene Expression test (Applied Biosystems) za ljudsku neka-7a (test ID 000377), neka-7b (ispitivanje ID 002619), neka-7c (ispitivanje ID 000379), neka-7d (test ID 002283 ), neka-7e (test ID 002406), neka-7f (ID test 000382), neka-7g (ispitivanje ID 002282), neka-7i (ispitivanje ID 002221), te U6 snRNA (ispitivanje ID 001973) kao endogeni kontrolom , Deset ng ukupne RNA podvrgnuti su reverzna transkripcija s TaqMan® Universal PCR Master Mix br AmpErase (Applied Biosystems) i odgovarajućim TaqMan® reagensa za ciljnih gena. RT-PCR je provedena u ukupnom volumenu od 20 ul reakcijske smjese u skladu s protokolom proizvođača. Povećavanje provedeno je na sljedeći način: 95 ° C kroz 10 min, 40 ciklusa od 95 ° C za 15 s i 60 ° C tijekom 60 s. Uzorci su analizirani u triplikatu, kao biološkog identične ili četverostruko kao tehnički replikat. Razine Mirna definirani su s praga ciklusa (CT), komparativne Ct metode, i normalizacije po razini U6 snRNA u svakom uzorku. Fold povećava ili smanjuje u svakoj Mirna razini ispitanih staničnih linija se određuje u odnosu na razinu od AZ-P7a stanične linije. Pregled

Izvori pregled

Zahvaljujemo članovi Shizuoka Cancer Research Institute Center za svoje mnoge korisne prijedloge. Također zahvaljujemo dr. Yutaka Yonemura i Yoshio Endo za dar AZ-P7a i MKN45P staničnim linijama. Pregled

• PLO-ON: Gene Expression Potpis stečene kemijska otpornost na cisplatin i fluorouracil kombinirana kemoterapija u rak želuca Patients
• PLoS ONE: Hipoksija indukcijske Factor 1α Određuje rak želuca kemijske osjetljivosti putem modulacije p53 i NF-κB