PLoS ONE: Las ganancias número de copias en 8q24 y 20q11-q13 en el cáncer gástrico son más comunes en intestinal-tipo de difuso Tipo

Extracto

El presente estudio tiene como objetivo descubrir alteraciones en el número de copias de ADN (CNA) que intervienen en la carcinogénesis del estómago y en la comprensión de sus significados clínico-patológicos en la población coreana. el número de copias de ADN fueron analizados utilizando Agilent 244K o 400K gama de hibridación genómica comparada (aCGH) en el tumor fresco congelado y los tejidos normales emparejados de 40 pacientes con cáncer gástrico. Algunas de las regiones de la CNA detectados fueron validados utilizando la sonda de amplificación dependiente de ligado múltiplex (MLPA) en seis de los 40 pacientes y personalizada Agilent 60K aCGH en un conjunto independiente de 48 cánceres gástricos. Los niveles de mRNA de los genes en las regiones comunes CNA se analizaron utilizando cuantitativa en tiempo real PCR. Copiar ganancias numéricas eran más comunes que las pérdidas a través de todo el genoma en tejidos tumorales en comparación con tejidos normales emparejados. El número medio de alteraciones por caso fue de 64 para las ganancias y las pérdidas de 40, y la longitud de la aberración promedio fue de 44016 pb para las ganancias y las pérdidas de 4732 pb. Copiar ganancias numéricas se detectaron con frecuencia en 7p22.1 (20%), 8q24.21 (27% -30%), 8q24.3 (22% -48%), 13q34 (20% -31%), y 20q11-q13 (25% -30%), y las pérdidas en 3p14.2 (43%), 4q35.2 (27%), 6q26 (23%), y 17p13.3 (20% -23%). CNA en 7p22.1, 13q34, y 17p13.3 no se han reportado en otras poblaciones. La mayor parte de las pérdidas de número de copias se asociaron con baja regulación de los niveles de ARNm, pero la correlación entre las ganancias de número de copias y los niveles de expresión de ARNm variar de una manera dependiente de genes. Además, las ganancias de copia de números tienden a ocurrir con más frecuencia en los cánceres de tipo intestinal que en los cánceres de tipo difuso. En conclusión, el presente estudio sugiere que las ganancias en el número de copias en 8q24 y 20q11-q13 y pérdidas en 3p14.2 pueden ser eventos comunes en el cáncer gástrico, pero CNA en 7p22.1, 13q34, y 17p13.3 puede ser coreano-específica.

Visto: Jin DH, Parque SE, Lee J, Kim KM, Kim S, Kim DH, et al. (2015) Copy Number ganancias en 8q24 y 20q11-q13 en el cáncer gástrico son más comunes en Intestinal-Tipo de Tipo-difusa. PLoS ONE 10 (9): e0137657. doi: 10.1371 /journal.pone.0137657

Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, JAPÓN

Recibido: 8 de Marzo, 2015; Aceptado: 19 Agosto 2015; Publicado: 11 Septiembre 2015

Derechos de Autor © 2015 Jin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y. Los datos aCGH-244K y 400K-aCGH se pueden descargar desde el portal de Gene Expression Omnibus del NCBI. (Www.ncbi.nlm.nih.gov/geo, número de acceso: GSE69318 y GSE69266, respectivamente)

Financiación: este trabajo fue apoyado por becas de la Nacional I & D Programa de control del cáncer, Ministerio de Salud y Bienestar (p0270) y del Instituto Coreano de Desarrollo Industria de la Salud (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud & Bienestar (HI14C1979), República de Corea

Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

El cáncer gástrico es la tercera causa principal de cáncer. muertes en el mundo. A pesar de los avances significativos en el diagnóstico y tratamiento del cáncer gástrico, las tasas de supervivencia de cinco años de pacientes con cáncer gástrico permanecen por debajo de 30% en la mayoría de los países [1]. Además, aproximadamente la mitad de los pacientes que se someten a la resección quirúrgica curativa todavía desarrollan metástasis loco-regionales o distantes a pesar del enfoque terapéutico de múltiples modalidades y mueren de la enfermedad [2,3]. Aunque la mayoría de los cánceres gástricos presentan características clínicas similares, existe una heterogeneidad considerable en su histopatología y cambios moleculares asociados [4]. En consecuencia, es importante identificar los biomarcadores moleculares implicados en la carcinogénesis del cáncer gástrico para la detección temprana y el tratamiento de la enfermedad objetivo.

número de copias de ADN alteración (CNA) definida como segmentos de ADN 1 kb o más grandes en tamaño, es un tipo importante de alteración genética observada en las células cancerosas [5]. CNA puede influir en la expresión génica, la variación fenotípica y la adaptación mediante la interrupción de las regiones reguladoras de ADN proximales o distantes o mediante la alteración de los niveles de dosificación de genes [6,7]. Además, la distribución del número de copias es significativamente diferente en las poblaciones ancestrales distintas, que pueden dar lugar a diferente susceptibilidad a las enfermedades a través de grupos ancestrales [8]. alteraciones Recientemente, varios grupos han analizados de ADN el número de copias en el cáncer gástrico usando la gama de hibridación genómica comparativa (aCGH) y se han identificado nuevos genes importantes en la patogénesis del cáncer gástrico [9-14]. Por ejemplo, Tsukamoto et al. [10] investigaron CNA en 30 casos de cáncer gástrico mediante el uso de BAC o PAC clones, e identificaron las regiones más frecuentes de ADN ganancias de número de copias como 20q13, 20q11, 8q24 y 20p12, y los de las pérdidas como 4q34-qter, 5q12, 18q21, y 3p14. Fan et al. [11] detectó CNA en 64 tejidos de cáncer gástrico y 8 líneas celulares de cáncer gástrico mediante el uso de clones BAC, y observó que 20q12-20q13 y 9p21 fueron las regiones con mayor frecuencia amplificados y eliminados, respectivamente. Además, Cheng et al. [12] estudiaron CNA en 27 cánceres gástricos por aCGH-244K e identificaron 8p11-Q24, 20q11-q13 y 7q21-q22 como las regiones más ganado y 4q34, 6p25, 18q12, 18q22 y como las regiones más perdidos. En estos estudios previos, se aplicaron diversas microarrays (BAC o PAC clon, oligo) para investigar CNA en el cáncer gástrico, y las regiones de la CNA reportados fueron diferentes para las distintas poblaciones de estudio.

Para identificar CNA importante en la patogénesis del cáncer gástrico en la población de Corea, que por primera vez un análisis de todo el genoma del número de copias de ADN utilizando aCGH-244K o aCGH-400K en 40 cánceres gástricos y luego validado las CNA detectados utilizando un personalizado aCGH-60K en otro conjunto de 48 gástrica tipos de cáncer. Los efectos de la CNA sobre la expresión génica se analizaron en algunos de los genes con los CNA.

Resultados

Descubrimiento del CNA involucrado en la carcinogénesis del estómago

Para descubrir CNA involucrados en la carcinogénesis del estómago, tumor y los tejidos normales emparejados de 40 pacientes con cáncer gástrico se analizaron mediante array de hibridación genómica comparada (aCGH); 30 casos por aCGH-400K y 10 casos por aCGH-244K. CNA se detectaron en todo el genoma, y ​​las ganancias de número de copias fueron más comunes que las pérdidas de número de copias (Figura 1A). El número de CNA era muy diferente entre los individuos. El número medio de CNA por caso fue de 64 para las ganancias y las pérdidas de 40 (figura 1B), y la duración media de la región CNA era 44016 pb para las ganancias y las pérdidas de 4732 pb para (figura 1C). Los CNA comunes se detectaron utilizando un algoritmo de contexto-corregida con un umbral de valor de p de 0,05 y el umbral de solapamiento de 0,9 (Fig 1D). aumentos del número de copias se han detectado con frecuencia en regiones cromosómicas 7p22.1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34, 20q11-q13 y, y copiar las pérdidas numéricas fueron observados con frecuencia en 3p14.2, 6q26, 7q36.3, 13q34, 18q23 y . Las pérdidas se detectaron principalmente en los extremos de los cromosomas, y el tamaño relativamente pequeño. El CNA fueron menos comunes en los cromosomas 2 y 15. Las longitudes de aberración comunes con un bajo valor de p cayó principalmente dentro de 1 kb-10 kb (Figura 1E). aberraciones comunes en torno a MYC
gen en 8q24.21 se muestra en la figura 1F. Los datos aCGH-244K y 400K-aCGH se pueden descargar desde el portal de la NCBI Gene Expression Omnibus (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). (Número de acceso: GSE69318 y GSE69266, respectivamente)

Validación de los aCGHs por MLPA análisis

Algunos desequilibrios genómicos detectados por el aCGH fueron validados mediante la amplificación basada en PCR multiplex ligadura dependientes de la sonda (MLPA). Seis de las 40 muestras de tejidos analizados utilizando aCGH estaban disponibles para MLPA. el número de copias alteraciones de MYC gratis (8q24.21), FHIT gratis (3p14.2), WDR60 gratis (7q36.3), COL4A2
(13q34), NFATc1 gratis (18q23), y NCOA3
se analizaron en seis tumoral emparejados y pares normales de tejido (268-1, 271-1, 272-2 (20q12), 301 -1, 685-1 y 685-2). MYC
se amplificó en 271-1T y 301-1T (figura 2A), NCOA3
fue ganado en 301-1T y 685-2T (Figura 2B), y FHIT
se ha eliminado en 271-1T, 301-1T y 685-1T (figura 2A). Estos resultados fueron muy coherentes con los detectados por aCGH. Sin embargo, las pérdidas de número de copias de genes, como WDR60 gratis (Figura 2C), NFATc1 gratis (Figura 2D), y COL4A2 gratis (Figura 2E), que se encontraron que se pierde en aCGH, no se detectaron en la MLPA. La longitud de la región de supresión en el WDR60
gen detectado por aCGH era de 2907 pb, y COL4A2
y NFATc1
eran 1.903 pb y 2596 pb, respectivamente. Sobre la base de estas observaciones, es probable que las aberraciones que abarcan pequeñas regiones observadas por aCGH pueden ser falsas.

validación adicional de las regiones de la CNA por aCGH-60K

Para validar y estrechar las regiones de la CNA del recurrente (> 20%) del número de copias ganancias o pérdidas observadas por aCGH en las 40 muestras, que además analiza sus aberraciones en el tumor y los tejidos normales emparejados de otros 48 pacientes con cáncer gástrico usando un personalizado aCGH-60K. Las regiones de la CNA en 8q24, 20q11-q13, 3p14.2, y 18q23 mostraron alteraciones coincidentes de número de copias en el aCGH-60K, pero CNA en otras regiones, tales como 20p13-20p12 y 20q21.2, no mostraron los mismos patrones como en el 244K y 400K, lo que sugiere resultados heterogéneos entre plataformas aCGH. Para encontrar regiones comunes mínimas (MCR) de alteraciones del número de copias entre las tres plataformas, que se superponían las regiones de la CNA en un total de 88 muestras. El MCR del recurrente (> 20%) se detectaron aumentos de copia de números en varias regiones cromosómicas incluyendo 7p22.1 (20%), 7q22.1 (31% ~ 44%), 8q24.21 (27% ~ 30%), 8q24.3 (22% ~ 48%), 13q34 (20% ~ 31%), y 20q11 ~ q13 (25% ~ 30%) (Tabla 1 y la Tabla a en S1 File). El MCR del recurrente (> 20%) Número de copiar las pérdidas también fueron encontrados en siete regiones cromosómicas, incluyendo 3p14.2 (43%) que alberga FHIT gratis (Tabla 1 y la Tabla B en S1 Archivo)

Asociación gen-dependiente entre los niveles de ARNm y CNA

Para investigar el efecto de la CNA en la expresión génica, que mide los niveles de mRNA de múltiples genes ( MYC
, Scrib
, PUF60
, Bop1
, SNTA1
, E2F1
, CD40
, Eya2
, NCOA3
, FHIT
, CRK
, y SMAD2
) en las regiones de aberración comunes en 48 tumor y los tejidos normales emparejados y se analizó la asociación con el CNA. El efecto de la CNA en la expresión génica se analizó mediante la comparación del cambio de mRNA de plegado (FC) en los cánceres con y sin CNA. La correlación entre las alteraciones del número de copias y la expresión del gen correspondiente fue diferente de acuerdo con copiar las ganancias o pérdidas numéricas. La mayoría de los genes con las pérdidas de número de copias mostró regulación a la baja de ARNm: el nivel de ARNm se downregulated en el FHIT gratis (Tabla 2 y Figura 3A), CRK
, y SMAD2
genes (Tabla 2). Sin embargo, encontramos la correlación entre las ganancias de número de copias y la regulación positiva de los niveles de mRNA fue de genes específicos: los niveles de mRNA en los genes, como MYC
, PUF60
, Bop1
(figura 3B), y E2F1
se asocia positivamente con aumentos del número de copias. Sin embargo, no se encontró asociación entre los niveles de ARNm y copiar ganancias número de genes tales como Scrib
, Bcl2l1
, SNTA1
, CD40
, Eya2
y NCOA3 gratis (Tabla 2) lo que sugiere que la relación entre las ganancias y la expresión de número de copias puede ser específico del gen.

Asociación de CNA con características clinicopatológicas

La asociación entre las alteraciones del número de copias y variables clínico se analizó en 88 pacientes con cáncer gástrico. Quince genes con recurrente (> 20%) fueron seleccionados copia alteraciones numéricas para el análisis. las pérdidas del número de copias de CRK gratis ( P
= 0,07), SMAD2 gratis ( P
= 0,09), FHIT gratis ( P
= 0,68), y NFATc1 gratis ( P = 0,11)
genes no variaron significativamente entre los cánceres de tipo difuso y cánceres de tipo intestinal (figura 3C). Sin embargo, las ganancias de copia de números tienden a ocurrir a una alta prevalencia en los cánceres de tipo intestinal que en los cánceres de tipo difuso (Figura 3D y 3E, la Tabla C en S1 Archivo). Para Scrib gratis ( P
= 0,36), PUF60 gratis ( P
= 0,07), MAPK15 gratis ( P
= 0,08), E2F1 gratis ( P
= 0,14), SNTA1 gratis ( P
= 0,15), Bcl2l1 gratis ( P
= 0,15), NCOA3 gratis ( P
= 0,22), y Eya2 gratis ( P
= 0,06), copia ganancias numéricas ocurrieron en una alta prevalencia en los cánceres de tipo intestinal que en los cánceres de tipo difuso, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa. el número de copias ganancias de MYC gratis ( P
= 0,03), Bop1 gratis ( P
= 0,03), y CD40
( P
= 0,01) fueron encontrados en una alta prevalencia significativamente en los cánceres de tipo intestinal en comparación con los cánceres de tipo difuso. Para detectar CNA relacionada con la edad, se analizó la correlación entre la edad del paciente y de copia Cambio de número utilizando los coeficientes de correlación de Pearson, pero encontramos no se encontró correlación entre el cambio del número de copias de genes de 15 y la edad del paciente (Figura 4A). El análisis de agrupamiento jerárquico se realizó con el fin de los pacientes del grupo con CNA similar. La mayoría de los pacientes con aumentos del número de copias en 8q24 también tuvieron aumentos en el número de copias o 20q11.21 20q13.12 (figura 4B). Los datos se dividen en 4 grupos de acuerdo a la presencia de las ganancias de número de copias en 8q24 y 20q11.21 (o 20q13.12). Copiar ganancias numéricas en 8q24 se asoció significativamente con aumentos en el número de copias o 20q11.21 20q13.12 ( P = 0,005
, la prueba exacta de Fisher; el cuadro D S1 Archivo). Estas observaciones sugieren que las dos regiones, 8q24 y 20q11.21 (o 20q13.12), pueden ser igualmente susceptibles a copiar ganancias numéricas en el cáncer gástrico.

Discusión

El cambio de la dosis génica por la CNA está siendo cada vez más reconocido como un componente importante de la tumorigénesis. Para descubrir novela CNA involucrados en la patogénesis del cáncer gástrico, se realizó un análisis de todo el genoma de la CNA en el tumor y se correspondía con los tejidos normales de 88 pacientes con cáncer gástrico y se presentan periódicamente, (> 20%) copiar ganancias numéricas en múltiples regiones cromosómicas incluyendo 7p22 0.1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34, 20q11 ~ q13 y una pérdida corriente en 3p14.2, 4q35.2, 6q26, y 17p13.3. El CNA en 7p22.1, 13q34, y 17p13.3 no se han reportado en otras poblaciones. Los 7p22.1 regiones identificadas en el presente estudio contienen los genes FBXL18, ACTB, ACTG1, y RNF216. Aunque CNA en 7p22.1 no se han reportado en el cáncer gástrico, varios estudios informaron sobre su impacto en el desarrollo de adenocarcinoma de células claras de ovario [15] y la endometriosis [16]. En este estudio, copiar alteraciones en el número de MYC gratis (8q24.21), FHIT gratis (3p14.2), y NCOA3 gratis (20q12) fueron validados mediante MLPA, pero copiar las pérdidas numéricas ( WDR60
, COL4A2
, NFATc1
) de aproximadamente 2000 pb no fueron validados por MLPA. No fue posible realizar una amplia estimación de cálculo de las tasas de falsos positivos de llamadas basadas en matriz. En su lugar, hemos comparado la prevalencia de las pérdidas número de copias entre aCGH-244K & -400K Y el aCGH-60K con sondas de alta densidad de acuerdo con los tamaños de las pérdidas de número de copias: 1 kb-5kb, 5 kb-10kb, 10kb-50kb, 100kb 50kb-y 100K-. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas sólo en las pérdidas del número de copias de pequeño tamaño (1 kb-5 kb) (Tabla E en S1 Archivo). Además, no se encontraron diferencias significativas en los cromosomas de manera específica del locus: no se encontraron diferencias en los cromosomas 3, 6, 16, 17, y 20 (datos no mostrados). Por lo tanto, es posible que copian las pérdidas número de pequeños tamaño detectado en aCGH-244K y 400K-aCGH pueden ser falsas en algunos loci.

Se analizaron, además, las regiones comunes mínimas de recurrente (≥10%) amplificación o deleción en 88 cánceres gástricos (Tabla S1 F en File) y los comparó con el gran cáncer gástrico TCGA (el Atlas del Genoma del cáncer) estudio (14) y tres estudios previos (tabla G en S1 archivo). El estudio TCGA se compone de 295 adenocarcinomas gástricos primarios y se seleccionaron 30 amplificaciones focales y 45 supresiones focales. La amplificación (≥ 5 copias) en 8q24.21 ( MYC
), 17q12 ( ErbB2
etc.), 20q11.1-q13.33 (Eya2
, NCOA3
etc.), y su eliminación (0 copias) en 3p14.2 ( FHIT
) fueron observados en nuestros datos, así como los datos de la TCGA y estudios de otros (Tabla G en S1 File). Sin embargo, CNA en 7p22.1, 13q34, y 17p13.3 no se han reportado en el estudio TCGA y otras poblaciones. El número de las regiones del CNA identificadas en el estudio TCGA era más grande que el presente estudio, lo que podría ser el resultado de los diferentes subgrupos de miembros de la muestra. El estudio consiste en TCGA más grande de tipo intestinal (66,4%) en comparación con los de tipo difuso de cáncer (23,4%).

Entre los genes localizados en 8q24.21, MYC es conocido por promover el crecimiento y la proliferación de la normalidad las células gástricas, y desmontables de MYC
frena el crecimiento y proliferación de células de cáncer gástrico [17]. MYC
codifica un factor de transcripción que regula una variedad de genes relacionados con la proliferación, la diferenciación y la apoptosis [18]. MYC
se amplifica y se sobre-expresado en el cáncer gástrico [19], y su expresión aumenta progresivamente a medida que se desarrolla el cáncer [20]. MYC
amplificación se asocia con el comportamiento agresivo de células de cáncer gástrico [21,22]. En este estudio, copiar ganancias número de MYC
fueron encontrados en una alta prevalencia en los cánceres de tipo intestinal en comparación con los cánceres de tipo difuso, el apoyo a la observación de que la expresión de la proteína MYC se observa con mayor frecuencia en intestinal- escriba los tumores que en los tumores de tipo difuso [23]. Hemos analizado el efecto de MYC
CNA sobre la supervivencia global dentro de cada tipo. Los pacientes con copia ganancias número de MYC
tenían mala supervivencia global en comparación con los que no, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa en el tipo difuso y tumores de tipo intestinal (Fig S1). Los aumentos del número de copias del POU5F1B
(clase de dominio POU factor de transcripción 5 1B) pseudogen en 8q24.21 se encontraron en el 27% de las muestras analizadas. POU5F1B
se sabe que se asocia con la abundancia de ARNm y un fenotipo agresivo en el cáncer gástrico [24].

Las regiones 8q24.3 y 20q11-q13 contienen cientos de genes (Tabla A en S1 archivo), pero muchos son poco probable que participan en la oncogénesis. Entre los genes ubicados en estas regiones, se analizaron los niveles de mRNA de Scrib
, PUF60
, y Bop1
en 8q24.3 y SNTA1
, E2F1
, CD40
, Eya2
, y NCOA3
en 20q11-q13 (Tabla 2). En el presente estudio, copiar ganancias número de Scrib
, SNTA1
, CD40
, Eya2
, y NCOA3
eran no asociado con un cambio veces en los niveles de mRNA. Sin embargo, el PUF60
, Bop1
, y E2F1
genes resultaron ser significativamente sobre-expresado en los tejidos tumorales con aumentos del número de copias. PUF60
estaba sobreexpresado en los cánceres con el CNA ( P = 0,038
), pero su expresión no fue significativamente diferente entre los tejidos tumorales y tejidos normales emparejados en muestras sin CNA ( P
= 0,111). PUF60 (poli-U factor de empalme de 60 kDa de unión), una proteína represora que interacciona con la unión FUSE-(FIR), desempeña un papel en los procesos nucleares, tales como pre-mRNA de empalme y la regulación transcripcional. Además, suprime PUF60 MYC
la transcripción en el promotor P2 a través del factor de transcripción basal de núcleo-TFIIH [25]. Recientemente, Gumireddy et al. [26] informó de que PUF60 se requiere para la función de regulador de IncRNA regulador de la traducción (treRNA), que participa en la invasión tumoral y la metástasis. Copiar ganancias número de PUF60
muestran una fuerte correlación positiva con la expresión en el cáncer gástrico [27] y el cáncer de ovario [28]. Estas observaciones sugieren que las ganancias en el número de copias de PUF60
puede ser un importante mecanismo que subyace a la sobre-expresión del gen en el cáncer gástrico.

A diferencia de PUF60, el Bop1 y E2F1 resultaron se sobre-expresan en tejidos tumorales con aumentos del número de copias, así como en los que no. el número de copias ganancias de Bop1
y E2F1
en este estudio se produjo en el 23% y el 25% de las muestras estudiadas, respectivamente. El aumento de mRNA doble cambio de Bop1
fue significativa en los tejidos tumorales con las ganancias de número de copias ( P
= 0,024), así como en aquellos sin ( P
< 0,001) . Bop1 (bloque de la proliferación 1) es un componente del complejo PeBoW (Pes1, Bop1, y WDR12), que se requiere para la maduración de 28S y 5.8S ARN ribosómicos y la formación de los ribosomas 60S [29]. Bop1 juega un papel oncogénico en el carcinoma hepatocelular mediante la inducción de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) y la promoción de la remodelación del citoesqueleto de actina [30]. El Bop1
gen es conocido por ser sobreexpresado en el cáncer de recto con ganancia de 8q [31], y el aumento de la dosis de la Bop1
gen se asocia con un aumento de Bop1
mRNA en el cáncer colorrectal [32]. El E2F1 también se sobre-expresa en los tejidos tumorales con aumentos del número de copias ( P Hotel < 0,001) y en aquellos sin ( P
= 0,03). E2F1 juega un papel crucial en el control del ciclo celular y su actividad está regulada mediante la unión a la proteína de retinoblastoma de una manera por células dependiente del ciclo. La sobreexpresión de E2F1 se asocia con el desarrollo de una variedad de tumores, y el aumento del número de copias de E2F1
se sabe que está asociado con el exceso de expresión del gen en el melanoma [33] y el cáncer cervical [ ,,,0],34]. Sobre la base de estas observaciones, es probable que el impacto global de las ganancias de número de copias en la expresión génica en el cáncer gástrico varía de una manera dependiente de genes.

A pesar de que las ganancias de número de copias en 13q34 no se informaron en el cáncer gástrico, el se encontraron aumentos en el 20-30% de las muestras estudiadas. son conocidos de copia de ganancias numéricas en 13q34 que se asocia con la progresión de la neoplasia intraepitelial cervical a carcinoma de células escamosas [35] y con adenocarcinoma del intestino delgado [36]. Copiar ganancias numéricas en 17q12 son frecuentes en el cáncer gástrico. En el presente estudio, varios genes, incluyendo ErbB2
, GRB7
, STARD3
, PPP1R1B
, RARA
, y C17orf37, se amplificaron en el 15-20% de los 88 casos, en consonancia con otros estudios [37,38]. No hemos de evaluar la correlación del número de copias y de los niveles de expresión de los genes, pero varios grupos han informado de que los genes son importantes en el desarrollo de cáncer gástrico. Entre ellos, ErbB2 (HER2)
frecuentemente se amplifica y sobreexpresado en los cánceres gástricos [39-41], y la amplificación de HER2
fuertemente asociada a la supervivencia de los pobres, en particular en el intestino tipo de cáncer gástrico [42]. La inmunorreactividad de ErbB2 también se produce a una tasa de prevalencia más alta en tipo intestinal que en los subtipos difusos [43]. Por otra parte, el PPP1R1B-STARD3
transcripción de fusión en el cáncer gástrico humano aumenta la formación de colonias a través de la activación de phosphatidylinosil-3-quinasa y AKT señalización [44]. amplificación frecuente de también fueron reportados GRB7
y cambios positivos en la expresión en el cáncer gástrico [41,43].

Se detectaron las pérdidas más frecuentes en este estudio sobre 3p14.2 (39% en difuso tipos y el 37% de los tipos intestinales), donde FHIT
se encuentra. FHIT
es un conocido gen supresor de tumores [45], y con frecuencia está involucrado en la pérdida de heterocigosidad (LOH) y deleciones en tumores humanos [46]. carcinomas gástricos primarios representan un reordenamiento de la FHIT
gen y 20 de 30 muestras (67%) mostraron una ausencia de FHIT
expresión de la proteína [47]. La pérdida de FHIT
expresión de la proteína se correlaciona con la progresión de la enfermedad y la mala diferenciación en el cáncer gástrico [48]. En el presente estudio, se observó que FHIT
expresión se redujo en los cánceres gástricos con o sin su CNA, lo que sugiere que la dosis de genes, así como otros mecanismos regulan FHIT
expresión en el cáncer gástrico. Una mutación somática missense (exón 6, el codón 61, ACG → ATG) de FHIT
también ha sido identificado en el cáncer gástrico [49]. Por otra parte, una alta frecuencia de hipermetilación del promotor de FHIT gratis (62%) se observó en el cáncer gástrico [50]. Por lo tanto, es esencial para entender integralmente el control genético de la expresión de genes [51] integración de los datos de número de copias con los datos genómica adicional.

Copiar pérdidas numéricas de varios genes en este estudio no fueron significativamente diferentes entre los cánceres de tipo difuso y cánceres de tipo intestinal. Sin embargo, la prevalencia de las ganancias de número de copias fue diferente entre los dos tipos en ciertos genes, lo que sugiere que los factores ambientales pueden ser más influyente en copia ganancias numéricas que pérdidas. Además, los pacientes con copia ganancias numéricas 8q24.21 y 8q24.3 tendían a tener ganancias en 20q11-q13, lo que sugiere ambas regiones pueden ser igualmente susceptibles a la variación del número de copia. Este estudio fue severamente limitada debido al pequeño número de muestras y la falta de datos de supervivencia. El estudio adicional en una gran cohorte se requiere para comprender el significado funcional de la CNA descubierto en este estudio. Además, las mediciones de ARNm no se realizaron a un nivel del genoma. Se analizaron relación entre los niveles de ARNm de algunos genes conocidos por ser importante en la patogénesis del cáncer humano y el CNA. Se encontró una correlación significativa entre los niveles de expresión de MYC
, PUF60
, Bop1
, y E2F1
genes y su CNA (Tabla 2) . Una correlación estadísticamente significativa entre el CNA de MYC
, PUF60
, y E2F1
genes y sus niveles de expresión se encuentra también por Fan et al. (11). Sin embargo, se necesitan más estudios para comprender claramente el efecto de la CNA sobre la expresión génica. En conclusión, el presente estudio sugiere que el número de copias de ADN gana en 8q24.21, 8q24.3, 20q11-20q13 y pérdidas en 3p14.2 puede ser eventos comunes en el cáncer gástrico. Sin embargo, CNA en 7p22.1, 13q34, y puede ser 17p13.3-coreana específica. Además, copia ganancias numéricas pueden ser más frecuentes en el tipo intestinal de cáncer gástrico de tipo difuso.

Materiales y Métodos

Estudio de la población y la extracción de ADN

Un total de 88 pacientes, 35 mujeres y 53 hombres, que habían sido sometidos a una resección quirúrgica curativa para el cáncer gástrico entre noviembre de 2004 y octubre de 2010 en el Departamento de Cirugía en el Centro Médico Samsung, Seúl, Corea, participaron en este estudio. tejidos tumorales extirpados quirúrgicamente se recogieron después de obtener el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. Este estudio fue aprobado por el Centro Médico Samsung (SMC) Junta de Revisión Institucional (IRB). Los tumores eran-snap congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta que se necesite. Antes de la extracción de ADN a partir de los tejidos congelados frescos, las secciones se colocaron en portaobjetos y se tiñeron con H & E para evaluar la mezcla de los tejidos tumorales y no tumorales. áreas tumorales y no tumorales se microdissected cuidadosamente bajo un microscopio. Los tejidos microdissected se digirieron con proteinasa K, y se aisló el ADN genómico de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit DNeasy Tissue, Qiagen, Valencia, CA). La muestra consistió en 43 cánceres de tipo difuso, 41 de tipo intestinal, y 4 cánceres de tipo mixto.

Análisis CNA mediante aCGH

El aCGH se realizó de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Después de la hibridación de ADN y lavado, las diapositivas se escanean inmediatamente utilizando un escáner de microarrays de Agilent, y los datos en bruto se extrajeron usando software de extracción de características en los ajustes de los parámetros por defecto (CGH) de Agilent Technologies. intervalos putativa de la CNA en cada muestra se identificaron utilizando el software Agilent v7.0.4.0 Genómica Workbench. Cy5 /Cy3 coeficientes se convirtieron en registro _{2-transformado los valores. La centralización y difusos correcciones cero se aplicaron a la micromatriz. El método de detección de aberraciones 2 (ADM-2) algoritmo en el umbral de 6,0 se utilizó para identificar el CNA en muestras individuales y para determinar las frecuencias de aberración en muestras de cáncer gástrico (Fig 5). Se emplearon los siguientes filtros: número mínimo de sondas en la región de > = 3, registro proporción promedio mínimo absoluto de la región de > = 0.25. aberraciones comunes se detectaron utilizando el algoritmo contexto corregido al valor de p < 0,05 y un umbral de solapamiento de 0,9. El CNAR (Copia Alteración de números Región) se define como la unión de más de 90 por ciento segmentos aberrantes superpuestas a través de múltiples muestras. El hg19 genoma de montaje UCSC se utilizó como la secuencia de referencia del genoma humano. Para cada plataforma (244K, 400K y 60K), se aplicó el método de normalización mundial Lowess dentro de la matriz para corregir el sesgo espacial local y los gradientes espaciales continuas. Después de la normalización dentro de la matriz, se aplicó un cuantil entre array normalización para comparar los resultados de aberración a través de las matrices. Estos normalizaciones se llevaron a cabo utilizando el paquete limma en R. El MCR (Minimal región común) se definió como una región común de solapamiento 100 por ciento entre muestras en el CNAR. Hay varios MCR en el CNAR de acuerdo con la posible frecuencia de superposición. Se analizó el MCR de amplificación y su eliminación. La amplificación y su eliminación se definió cuando la relación normalizada log2 era ≥0.8 y ≤-0,8, respectivamente. Todos los métodos estadísticos y la visualización de las regiones aberrantes individuales se realizaron utilizando v.3.0.2 lenguaje estadístico R (www.r-project.org).}

Multiplex Ligadura dependiente sonda de amplificación (MLPA) Análisis

MLPA se realizó utilizando el kit P200 SALSA MLPA (MRC-Holland, Amsterdam, Países Bajos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante [52]. El kit P200 contiene 14 sondas de control interno para evaluar la desnaturalización del ADN y la cantidad de ADN, y también para el cromosoma X e Y. Las muestras de ADN se diluyeron con TE a 5 l y se calentaron a 98 ° C durante 5 min en tubos de PCR en un termociclador con una tapa calentada. Después de la adición de 1,5 l de tampón de MLPA y 1,5 l de la mezcla de la sonda, las muestras se calentó adicionalmente durante 1 min a 95 ° C y después se incubaron durante 16 horas a 60 ° C. Las secuencias de la sonda para genes detectados se enumeran en la Tabla H en S1 Archivo. La ligación de oligonucleótidos hibridados se realizó mediante la dilución de las muestras a 40 l con un tampón de dilución que contiene 1 U de la enzima ligasa-65, e incubando durante 15 min a 54 ° C. La enzima ligasa se inactivó por calentamiento a 98 ° C durante 5 min y productos de ligación fueron amplificados por PCR. Mientras que a 60 ° C, se añadieron 10 l de una solución tamponada que contiene los cebadores de PCR, dNTPs y salsa de la polimerasa (MRC-Holland, Amsterdam, Países Bajos). PCR se llevó a cabo durante 35 ciclos (30 s a 95 ° C, 30 s a 60 ° C y 1 min a 72 ° C). Las reacciones de PCR se separaron MLPA usando el sistema de electroforesis capilar, ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA), y los datos se analizaron mediante un GeneMaker 2.0.0 (SoftGenetics, State College, PA). Los datos de población fue normalizado, y las proporciones de la sonda por debajo de 0,75 se considera como una indicación de eliminación, mientras que relaciones sonda por encima de 1,25 fueron considerados como una indicación de la amplificación.

Cuantitativo PCR en tiempo real (QRT-PCR)