PLoS ONE: Copy Number Winsten op 8q24 en 20q11-Q13 bij maagkanker komen vaker voor in de darm-Type dan Diffuse-Type

Abstract

Het huidige onderzoek was gericht op het ontdekken van DNA copy number veranderingen (CNA) die betrokken zijn bij de carcinogenese van de maag en in het begrijpen van hun clinicopathologische betekenissen in de Koreaanse bevolking. DNA kopie aantallen werden geanalyseerd met behulp van Agilent 244K of 400K-array comparatieve genomische hybridisatie (aCGH) in vriesverse tumor en geëvenaard normale weefsels van 40 maagkanker patiënten. Sommige van de gedetecteerde CNA gebieden werden gevalideerd met behulp van multiplex ligatie-afhankelijke probe amplificatie (MLPA) in zes van de 40 patiënten en op maat Agilent 60K aCGH in een onafhankelijke set van 48 maagkanker. Het mRNA van genen aan de gemeenschappelijke CNA's werden geanalyseerd met behulp van kwantitatieve real-time PCR. Kopieer aantal winsten waren vaker voor dan de verliezen over het hele genoom in tumorweefsels vergeleken met geëvenaard normale weefsels. Het gemiddelde aantal wijzigingen per case was 64 voor winsten en 40 voor verliezen, en de mediane aberratie lengte was 44.016 bp voor winsten en 4732 bp voor verliezen. Kopieaantal winsten werden vaak gedetecteerd bij 7p22.1 (20%), 8q24.21 (27% -30%), 8q24.3 (22% -48%), 13q34 (20% -31%) en 20q11-q13 (25% -30%), en verliezen aan 3p14.2 (43%), 4q35.2 (27%), 6q26 (23%) en 17p13.3 (20% -23%). CNA's op 7p22.1, 13q34, en 17p13.3 zijn niet gemeld in andere populaties. De meeste kopieaantal verliezen werden geassocieerd met down-regulatie van mRNA-niveaus, maar de correlatie tussen kopieaantal winsten en mRNA-expressieniveaus varieerden in een gen-afhankelijke wijze. Bovendien, copy number krijgt de neiging om vaker voorkomen in de darm-type kanker dan in de diffuse-type kanker. Kortom, de huidige studie suggereert dat het aantal kopieën winsten op 8q24 en 20q11-Q13 en verliezen aan 3p14.2 kunnen zijn gemeenschappelijke gebeurtenissen bij maagkanker maar CNA's in 7p22.1, 13q34 en 17p13.3 kunnen Koreaanse-specifiek.

Visum: Jin DH, Park SE, Lee J, Kim KM, Kim S, Kim DH, et al. (2015) Copy Number Winsten op 8q24 en 20q11-Q13 bij maagkanker komen vaker voor in de darm-Type dan Diffuse-Type. PLoS ONE 10 (9): e0137657. doi: 10.1371 /journal.pone.0137657

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN

Ontvangen: 8 maart 2015; Aanvaard: 19 augustus 2015; Gepubliceerd: 11 september 2015

Copyright: © 2015 Jin et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden. De aCGH-244K en aCGH-400K gegevens kunnen worden gedownload van de NCBI Gene Expression Omnibus portal. (Www.ncbi.nlm.nih.gov/geo, toegangsnummer: GSE69318 en GSE69266, respectievelijk)

Financiering: dit werk werd ondersteund door subsidies van de National R & D Program for Cancer control, Ministerie van Volksgezondheid en Welzijn (p0270) en uit de Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het Ministerie van Health & Welfare (HI14C1979), de Republiek Korea

Competing belangen. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is de derde belangrijke oorzaak van kanker. sterfgevallen wereldwijd. Ondanks de aanzienlijke vooruitgang in de diagnose en behandeling van maagkanker, vijf jaar te overleven tarieven van maagkanker patiënten blijven onder de 30% in de meeste landen [1]. Bovendien, ongeveer de helft van de patiënten die nog curatieve resectie ondergaan ontwikkelen locoregionale of afstandsmetastasen ondanks de multimodaliteit therapeutische benadering en sterven aan de ziekte [2,3]. Hoewel de meeste maagkanker tonen vergelijkbare klinische kenmerken, er een aanzienlijke heterogeniteit in de histopathologie en verwante moleculaire veranderingen [4]. Daarom is het belangrijk om de moleculaire biomarkers die bij de carcinogenese van maagkanker voor vroege detectie en gerichte behandeling van de ziekte te identificeren.

DNA kopieaantal verandering (CNA) gedefinieerd als DNA-segmenten 1 kb of groter, is een belangrijk type genetische verandering waargenomen in kankercellen [5]. CNA's kunnen genexpressie, fenotypische variatie en aanpassing te beïnvloeden door het verstoren van proximale of verre DNA regulerende regio's of door het veranderen van gen doseringsniveaus [6,7]. Bovendien is de verdeling van kopieaantal aanmerkelijk verschilt voorouderlijke verschillende populaties, die kunnen leiden tot verschillende gevoeligheid voor ziekten in voorouderlijke groepen [8]. Onlangs hebben diverse groepen geanalyseerd veranderingen van DNA te kopiëren nummer bij maagkanker met behulp van array-comparatieve genomische hybridisatie (aCGH) en hebben nieuwe genen belangrijk in de pathogenese van maagkanker [9-14] geïdentificeerd. Bijvoorbeeld Tsukamoto et al. [10] onderzocht CNA in 30 gevallen van maagkanker met BAC of PAC klonen en die de meest voorkomende gebieden van DNA kopieaantal voordelen dat 20q13, 20q11, 8q24 en 20p12, en van verliezen 4q34-qter, 5q12, 18q21, 3p14 en. Fan et al. [11] CNA gedetecteerd in 64 maagkanker weefsels en 8 maagkanker cellijnen met BAC-klonen, en merkte op dat 20q12-20q13 9p21 en waren de meest versterkt en verwijderde gebieden, respectievelijk. Bovendien, Cheng et al. [12] studeerde CNA's in 27 maagkanker door aCGH-244K en geïdentificeerd 8p11-Q24, 20q11-Q13, en 7q21-Q22 als de meest opgedaan regio's en 4q34, 6p25, 18q12 en 18q22 als de meest verloren gebieden. In deze eerdere studies werden verschillende microarrays (BAC of PAC-kloon, oligo) toegepast op CNA's te onderzoeken bij maagkanker, en de gerapporteerde CNA regio's waren verschillend voor de verschillende studie populaties.

Om CNA belangrijk te identificeren in de pathogenese van maagkanker in de Koreaanse bevolking, we eerst voerden een genoom-brede analyse van DNA copy number met behulp van aCGH-244K of aCGH-400K in 40 maagkanker en vervolgens gevalideerd de gedetecteerde CNA's met behulp van een aangepaste aCGH-60K in een andere set van 48 de maag kankers. De effecten van CNA's op genexpressie werden geanalyseerd in een aantal van de genen met CNA's.

Resultaten

Ontdekking van CNA's betrokken bij de carcinogenese van de maag

Om CNA's betrokken bij het ontdekken de carcinogenese van de maag, tumor en gekoppeld normale weefsels van 40 maagkankerpatienten werden geanalyseerd met matrix vergelijkende genomische hybridisatie (aCGH); 30 zaken door aCGH-400K en 10 gevallen door aCGH-244K. CNA's werden ontdekt in de hele genoom, en copy number winsten werden meer gemeen dan copy number verliezen (figuur 1A). Het aantal CNA's was enorm verschillend onder individuen. Het gemiddelde aantal CNA's per geval was 64 voor winsten en 40 voor verliezen (figuur 1B), en de mediane duur van de regio CNA was 44.016 bp voor winsten en 4732 bp voor verliezen (figuur 1C). De gemeenschappelijke CNA's werden gedetecteerd met een context-gecorrigeerde algoritme met een p-waarde van 0,05 en drempel overlap van 0,9 (figuur 1D). aantal Copy winsten werden vaak aangetroffen op chromosomale regio 7p22.1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34 en 20q11-Q13, en het aantal kopieën verliezen werden vaak waargenomen op 3p14.2, 6q26, 7q36.3, 13q34 en 18q23 . De verliezen grotendeels gedetecteerd bij de uiteinden van chromosomen en de grootte was relatief klein. De CNA's waren minder vaak op chromosomen 2 en 15. De gemeenschappelijke aberratie lengtes met een lage p-waarde voornamelijk vielen binnen 1 kb-10 kb (Figuur 1E). Common aberraties rond MYC
gen bij 8q24.21 zijn weergegeven in figuur 1F. De aCGH-244K en aCGH-400K gegevens kunnen worden gedownload van de NCBI Gene Expression Omnibus portal (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). (Toegangsnummer: GSE69318 en GSE69266, respectievelijk)

Validation van de aCGHs door MLPA analyse

Sommige genomic onevenwichtigheden gedetecteerd door de aCGH werden gevalideerd met behulp van PCR-gebaseerde multiplex ligatie-afhankelijke probe amplificatie (MLPA). Zes van de 40 weefselmonsters geanalyseerd met behulp van aCGH waren beschikbaar voor MLPA. aantal kopie veranderingen in de MYC
(8q24.21), FHIT
(3p14.2), WDR60
(7q36.3), COL4A2
(13q34), NFATC1
(18q23) en NCOA3
(20q12) werden geanalyseerd in zes afgestemd tumor en normaal weefsel paren (268-1, 271-1, 272-2, 301 -1, 685-1 en 685-2). MYC
werd versterkt in 271-1T en 301-1T (figuur 2A), NCOA3
werd opgedaan in 301-1T en 685-2T (figuur 2B), en FHIT
werd verwijderd in 271-1T, 301-1T en 685-1T (figuur 2A). Deze resultaten waren zeer overeen met die gedetecteerd aCGH. Echter, het aantal kopieën verlies van genen zoals WDR60
(figuur 2C), NFATC1
(figuur 2D), en COL4A2
(figuur 2E), die werden gevonden te zijn verloren in aCGH, werden niet gedetecteerd in de MLPA. De lengte van de deletie regio in de WDR60
gen ontdekt door aCGH was 2907 bp, en COL4A2 Kopen en NFATC1
waren 1903 bp en 2596 bp, respectievelijk. Op basis van deze observaties, is het waarschijnlijk dat de aberraties verspreid over kleine gebieden geobserveerd door aCGH vals kan zijn.

extra validatie van de CNA regios op aCGH-60K

Om te valideren en het verkleinen van de CNA's van recidiverende (> 20%) aantal kopieën winsten of verliezen geobserveerd door aCGH in de 40 monsters, we verder hun afwijkingen in tumor en geëvenaard normale weefsels van een andere 48 maagkanker patiënten geanalyseerd met behulp van een op maat gemaakte aCGH-60K. De CNA regio's op 8q24, 20q11-Q13, 3p14.2 en 18q23 toonde samenvallende veranderingen van het aantal kopieën in de aCGH-60K, maar CNA's in andere regio's, zoals 20p13-20p12 en 20q21.2, heeft dezelfde patronen niet tonen zoals in de 244K en 400K, daardoor heterogene resultaten onder aCGH platforms suggereren. Om een ​​minimale gemeenschappelijke gebieden (MCRs) van de kopie aantal wijzigingen te vinden tussen de drie platforms, we overlapt de CNA's in een totaal van 88 monsters. De MCRs terugkerende (> 20%) kopieaantal winsten werden waargenomen op verschillende chromosomale gebieden waaronder 7p22.1 (20%), 7q22.1 (31% ~ 44%), 8q24.21 (27% ~ 30%), 8q24.3 (22% ~ 48%), 13q34 (20% ~ 31%) en 20q11 ~ q13 (25% ~ 30%) (tabel 1 en tabel A in S1 File). De MCRs van recidiverende (> 20%) aantal kopieën verliezen werden ook gevonden in zeven chromosomale regio's, waaronder 3p14.2 (43%) het herbergen van FHIT
(tabel 1 en tabel B in S1 File)

Gene-afhankelijke relatie tussen CNA's en mRNA levels

Om het effect van CNA's op genexpressie te onderzoeken, gemeten we mRNA-niveaus van meerdere genen ( MYC
, Scrib
, PUF60
, BOP1
, SNTA1
, E2F1
, CD40
, EYA2
NCOA3
, FHIT
, CRK
en SMAD2
) aan de gemeenschappelijke aberratie regio's in 48 tumor en geëvenaard normale weefsels en de associatie geanalyseerd de CNAs. Het effect van CNA op genexpressie werd geanalyseerd door vergelijking van de mRNA veelvoudverandering (FC) in kankers met en zonder CNA. De correlatie tussen het aantal kopieën wijzigingen en bijbehorende genexpressie was verschillend afhankelijk van het aantal winsten of verliezen te kopiëren. De meerderheid van de genen met copy number verliezen toonde downregulatie van mRNA: het mRNA-niveau werd neerwaarts gereguleerd in de FHIT
(tabel 2 en figuur 3A), CRK
en SMAD2
genen (Tabel 2). Toch vonden we de correlatie tussen het aantal kopieën winsten en regulatie van mRNA niveaus was gen-specifiek: het mRNA levels in genen zoals MYC
, PUF60
, BOP1
(figuur 3B), en E2F1
waren positief geassocieerd met het aantal kopieën winsten. Er werd echter geen verband gevonden tussen mRNA niveaus en aantal kopieën winsten van genen zoals Scrib
, BCL2L1
, SNTA1
, CD40
, EYA2 Kopen en NCOA3
(tabel 2) suggereert dat de relatie tussen copy number winsten en expressie gen-specifiek zijn.

Vereniging van CNA's met klinisch-pathologische kenmerken

De associatie tussen copy number wijzigingen en clinicopathologische variabelen werd geanalyseerd in 88 maagkanker patiënten. Vijftien genen met recidiverende (> 20%) kopienummer veranderingen werden geselecteerd voor de analyse. aantal kopie verliezen van CRK
( P
= 0,07), SMAD2
( P
= 0,09), FHIT
( P
= 0,68) en NFATC1
( P
= 0,11) genen varieerde niet significant tussen diffuse type kanker en intestinale type kanker (figuur 3C). Echter, copy number winsten neiging om optreden bij een hoge prevalentie in de darm-type kanker dan in diffuse-type kanker (Fig 3D en 3E, tabel C in S1 File). Voor Scrib
( P
= 0,36), PUF60
( P
= 0,07), MAPK15
( P
= 0,08), E2F1
( P
= 0,14), SNTA1
( P
= 0,15), BCL2L1
( P
= 0,15), NCOA3
( P
= 0,22), en EYA2
( P
= 0,06), kopieaantal krijgt plaats op een hoge prevalentie van intestinale-type kankers dan in diffuse type kanker, maar het verschil was niet statistisch significant. aantal kopie winsten van MYC
( P
= 0,03), BOP1
( P
= 0,03), en CD40
( P
= 0,01) werden gevonden op een aanzienlijk hoge prevalentie in de darm-type van kanker in vergelijking met diffuse-type kanker. Leeftijd-gerelateerde CNA's te detecteren, analyseerden we de correlatie tussen de leeftijd van de patiënt en het aantal kopieën wijzigen met behulp van Pearson correlatiecoëfficiënten maar vond geen correlatie gevonden tussen het aantal kopieën verandering van de 15 genen en leeftijd van de patiënt (figuur 4A). Hiërarchische clustering analyse werd uitgevoerd om patiënten groep met gelijkaardige CNA's. De meeste patiënten met kopieaantal op 8q24 winsten hadden ook kopieaantal winsten bij 20q11.21 of 20q13.12 (figuur 4B). Gegevens werden verder onderverdeeld in 4 clusters volgens de aanwezigheid van kopieaantal op 8q24 winsten en 20q11.21 (of 20q13.12). Kopieer aantal winsten op 8q24 was significant geassocieerd met een kopie aantal winsten op 20q11.21 of 20q13.12 ( P
= 0,005, Fisher's exact test, tabel D in S1 File). Deze waarnemingen suggereren dat de twee regio's, 8q24 en 20q11.21 (of 20q13.12), kunnen op soortgelijke wijze gevoelig zijn voor het aantal winsten te kopiëren bij maagkanker zijn.

Discussie

De verandering van gen dosering door CNA wordt steeds meer erkend als een belangrijk onderdeel van het ontstaan ​​van tumoren. Om te ontdekken roman CNA's betrokken bij de pathogenese van maagkanker, we voerden een genoom-brede analyse van CNA's in de tumor en geëvenaard normale weefsels van 88 maagkanker patiënten en geïdentificeerd terugkerende (> 20%) aantal kopieën winsten op meerdere chromosomale regio's, waaronder 7p22 0,1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34, 20q11 ~ Q13 en een recurrente verliezen bij 3p14.2, 4q35.2, 6q26, en 17p13.3. De CNA's in 7p22.1, 13q34, en 17p13.3 zijn niet gemeld in andere populaties. De 7p22.1 regio's die in de huidige studie bevatten FBXL18, ACTB, ACTG1 en RNF216 genen. Hoewel CNA's bij 7p22.1 zijn niet gemeld bij maagkanker, verschillende studies verslag uit over hun invloed op de ontwikkeling van ovariële clear cell adenocarcinoom [15] en endometriose [16]. In deze studie, kopiëren aantal wijzigingen van de MYC
(8q24.21), FHIT
(3p14.2), en NCOA3
(20q12) werden gevalideerd met behulp van MLPA, maar het aantal kopieën verliezen ( WDR60
, COL4A2
, NFATC1
) van ongeveer 2000bp waren niet gevalideerd door MLPA. We gefaald uitgebreide computationele schatting van vals positieve tarieven van de array-gebaseerde gesprekken te voeren. In plaats daarvan hebben we de prevalentie van copy number verliezen tussen aCGH-244k &vergeleken; -400K En de aCGH-60K met zeer dichte probes volgens de afmetingen van copy number verliezen: 1 kb-5 kb, 5 kb-10kb, 10kb-50kb, 50kb-100kb en 100k-. Statistisch significante verschillen werden alleen in het aantal kopieën verliezen van kleine omvang (1kb-5 kb) (zie tabel E in S1 File) gevonden. Bovendien zijn significante verschillen gevonden chromosomale locus-specifieke wijze: geen verschillen gevonden in chromosomen 3, 6, 16, 17 en 20 (data niet getoond). Daarom is het mogelijk dat kopienummer verlies van kleine omvang gedetecteerd in aCGH-244K en 400K-aCGH kan valse sommige loci.

Verder hebben we onderzocht kleinste gemene gebieden van recidiverende (≥10%) amplificatie of deletie in 88 maagkanker (Tabel F S1 File) en vergeleken met de grote maagkanker TCGA (The Cancer Genome Atlas) studie (14) en drie eerdere studies (Tabel G in S1 File). De TCGA studie bestond uit 295 primaire maag adenocarcinomen en geïdentificeerd 30 focale versterkingen en 45 focale deleties. Amplificatie (≥ 5 exemplaren) op 8q24.21 ( MYC
), 17q12 ( ERBB2
etc.), 20q11.1-q13.33 (EYA2
, NCOA3
etc.), en verwijdering (0 exemplaren) op 3p14.2 ( FHIT
) werden waargenomen in onze gegevens, alsmede de gegevens van de TCGA en anderen 'studies (tabel G in S1 File). Echter, CNA's op 7p22.1, 13q34, en 17p13.3 zijn niet gemeld in de TCGA studie en andere populaties. Het nummer van de regio's van de CNA's die in de TCGA studie was groter dan de huidige studie, die zou kunnen voortvloeien uit de verschillende subgroepen van het monster leden. De studie bestaat TCGA grotere intestinale-type (66,4%) vergeleken met diffuse type kanker (23,4%).

Onder de genen op 8q24.21, MYC is bekend dat de groei en proliferatie van normale bevorderen maag cellen en knockdown van MYC
weerhoudt de groei en proliferatie van maagkanker cellen [17]. MYC
codeert voor een transcriptiefactor die een verscheidenheid van genen betrokken bij proliferatie, differentiatie en apoptose [18] regelt. MYC
versterkt en tot overexpressie gebracht bij maagkanker [19], en de expressie ervan neemt toe naarmate er kanker [20]. MYC
amplificatie wordt geassocieerd met het agressieve gedrag van maagkanker cellen [21,22]. In deze studie, kopienummer versterkingen van MYC
gevonden bij een hoge prevalentie in de intestinale-type kankers in vergelijking met het diffuse type kanker, ondersteunt de waarneming dat MYC eiwitexpressie vaker waargenomen in darm- typen tumoren dan in de diffuse-type tumoren [23]. We hebben het effect van de MYC
CNA's op de totale overleving in elk geanalyseerd. Patiënten met een kopie aantal verworvenheden van MYC
had een slechte totale overleving in vergelijking met degenen zonder, maar het verschil was niet statistisch significant in diffuse type en intestinale soort kanker (S1 afb). De kopie aantal verworvenheden van de POU5F1B
(POU domein klasse 5 transcriptiefactor 1B) pseudogen op 8q24.21 werden gevonden in 27% van de geanalyseerde monsters. POU5F1B
is bekend geassocieerd te worden met mRNA overvloed en een agressieve fenotype bij maagkanker [24].

De 8q24.3 en 20q11-Q13 gebieden bevatten honderden genen (tabel A in S1 file), maar velen zijn waarschijnlijk betrokken bij de oncogenese. Onder de genen in deze regio's, analyseerden we het mRNA niveaus van de Scrib
, PUF60
en BOP1
8q24.3 en SNTA1
E2F1
, CD40
, EYA2
en NCOA3
bij 20q11-Q13 (tabel 2). In de huidige studie, aantal kopieën winsten van Scrib
, SNTA1
, CD40
, EYA2
en NCOA3
waren niet geassocieerd met een fold change in mRNA niveaus. Echter, de PUF60
, BOP1
en E2F1
genen bleken significant over-uitgedrukt in tumor weefsels met copy number winsten. PUF60
werd tot overexpressie gebracht in kankers CNA ( P
= 0,038), maar de expressie was niet significant verschillend tussen tumorweefsels en afgestemd normale weefsels in monsters zonder CNA ( P
= 0,111). PUF60 (poly-U bindende splicing factor 60 kDa), een FUSE-bindingseiwit interactie repressor (FIR), speelt een rol bij nucleaire processen zoals pre-mRNA splicing en transcriptionele regulatie. Bovendien onderdrukt PUF60 MYC
transcriptie op de P2-promoter door de kern-TFIIH basale transcriptiefactor [25]. Recentelijk Gumireddy et al. [26] PUF60 gemeld dat vereist is voor de regulator functie van translationele regulerende IncRNA (treRNA), dat betrokken is bij tumorinvasie en metastase. Kopie aantal verworvenheden van PUF60
laten een sterke positieve correlatie met expressie bij maagkanker [27] en bij eierstokkanker [28]. Deze waarnemingen suggereren dat kopieaantal versterkingen van PUF60
kan een belangrijk mechanisme dat ten grondslag als overexpressie van het gen bij maagkanker.

In tegenstelling tot PUF60 de BOP1 en E2F1 bleken worden tot overexpressie gebracht in tumorweefsels met kopie aantal voordelen als in die zonder. Kopie aantal verworvenheden van BOP1 Kopen en E2F1
in dit onderzoek vond plaats in 23% en 25% van de monsters onderzocht, respectievelijk. Toegenomen mRNA voudige verandering van BOP1
was significant in tumorweefsels met copy number winsten ( P
= 0.024) als in die zonder ( P Restaurant < 0,001) . BOP1 (blok proliferatie 1) is een component van de PeBoW (Pes1, BOP1 en WDR12) complex, dat nodig is voor de rijping van 28S ribosomaal RNA en 5,8S en vorming van de 60S ribosomale [29]. BOP1 speelt een oncogene rol in hepatocellulaire carcinoom door het induceren van epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) en het bevorderen van actine cytoskelet remodeling [30]. De BOP1
gen bekend te worden over-uitgedrukt in rectale kanker met 8q winst [31], en de dosering verhoging van de BOP1
gen wordt geassocieerd met een toename van de BOP1
mRNA in darmkanker [32]. De E2F1 werd ook over-uitgedrukt in tumor weefsels met copy number winsten ( P Restaurant < 0,001) en in die zonder ( P
= 0,03). E2F1 speelt een cruciale rol in de controle van de celcyclus en de activiteit wordt gereguleerd door binding aan retinoblastoma eiwit in een cel-cyclus afhankelijke wijze. Overexpressie van E2F1 wordt geassocieerd met de ontwikkeling van een verscheidenheid aan tumoren, en het toegenomen aantal kopieën van E2F1
bekend is geassocieerd met overexpressie van het gen in melanoom [33] en baarmoederhalskanker [ ,,,0],34]. Op basis van deze waarnemingen is het waarschijnlijk dat het totale effect van kopieaantal winsten op genexpressie bij maagkanker varieert in een gen-afhankelijke wijze.

Hoewel kopieaantal winsten op 13q34 niet gemeld bij maagkanker, de winsten werden gevonden in 20-30% van de monsters onderzocht. Kopieaantal winsten op 13q34 is bekend dat ze geassocieerd met de progressie van cervicale intra-epitheliale neoplasie voor squameus celcarcinoom [35] en dunne darm adenocarcinoom [36]. Kopieer aantal winsten op 17q12 zijn frequent bij maagkanker. In de huidige studie, meerdere genen, met inbegrip van ERBB2
, GRB7
, STARD3
, PPP1R1B
, RARA
, en C17orf37 werden geamplificeerd in 15-20% van de 88 gevallen, in overeenstemming met andere studies [37,38]. Wij hebben de correlatie van kopieaantal en expressie van genen te evalueren, maar door verscheidene onderzoeksteams meldden dat de genen van belang in de ontwikkeling van maagkanker. Onder hen, ERBB2 (HER2)
vaak geamplificeerd en tot overexpressie gebracht in maagkanker [39-41], en amplificatie van HER2
was sterk geassocieerd met slechte overleving, met name in de intestinale type maagkanker [42]. Immunoreactiviteit van ERBB2 treedt ook een hogere prevalentie van intestinale soort dan in de diffuse subtypen [43]. Verder is de PPP1R1B-STARD3
fusie transcript in humane maagkanker verhoogt kolonievorming door de activering van phosphatidylinosil-3-kinase en AKT signalering [44]. Frequent versterking van de GRB7 Kopen en positieve veranderingen in expressie werden ook gemeld bij maagkanker [41,43].

De meest voorkomende verliezen in deze studie werden gedetecteerd op 3p14.2 (39% in diffuse-types en 37% van intestinale types), waarbij FHIT
ligt. FHIT
is een bekende tumor suppressor gen [45], en wordt vaak betrokken bij het verlies van heterozygositeit (LOH) en deleties in menselijke tumoren [46]. Primaire maagcarcinomen vertegenwoordigen een herschikking van de FHIT
-gen en 20 van de 30 (67%) monsters vertoonde een afwezigheid van FHIT
eiwitexpressie [47]. Verlies van FHIT
eiwit expressie correleert met de progressie van de ziekte en slechte differentiatie bij maagkanker [48]. In de onderhavige studie hebben we vastgesteld dat FHIT
expressie werd gereduceerd in maagkanker met of zonder CNA, wat suggereert dat gendosering en andere mechanismen reguleren FHIT
expressie bij maagkanker. Een somatische missense mutatie (exon 6, codon 61, ACG → ATG) van de FHIT
is ook geïdentificeerd in maagkanker [49]. Verder is een hoge frequentie van promotor hypermethylatie van FHIT
(62%) wordt waargenomen bij maagkanker [50]. Daarom integreren kopieaantal gegevens met extra genomische data essentieel is uitgebreid onderzoek naar de genetische controle van genexpressie [51].

Exemplaarnummer verlies van verscheidene genen in deze studie waren niet significant verschillend tussen diffuse type kanker en intestinale-type kankers. De prevalentie van kopieaantal winsten verschilde tussen beide soorten van bepaalde genen, wat suggereert dat omgevingsfactoren meer invloed in kopieaantal winsten dan verliezen kunnen zijn. Bovendien, patiënten met een aantal kopieën winsten op 8q24.21 en 8q24.3 neiging om winsten op 20q11-Q13 te hebben, wat erop wijst beide regio's kan even vatbaar voor number variation te kopiëren. Deze studie werd ernstig beperkt vanwege het kleine aantal monsters en het gebrek aan overlevingsdata. Nader onderzoek in een groot cohort is vereist om de functionele betekenis van CNA in deze studie ontdekt begrijpen. Bovendien werden geen mRNA metingen uitgevoerd bij een genoomniveau. We analyseerden tussen mRNA niveaus van bepaalde genen waarvan het belang in de pathogenese van kanker bij de mens en de CNA's zijn. Een significante correlatie gevonden tussen de expressie van MYC
, PUF60
, BOP1
en E2F1
genen en hun CNA (tabel 2) . Een statistisch significante correlatie tussen CNA's van MYC
, PUF60
en E2F1
genen en hun expressie werd ook gevonden door Fan et al. (11). Echter, verder onderzoek nodig om duidelijk inzicht in de werking van CNAs op genexpressie. Kortom, de huidige studie suggereert dat DNA copy number wint bij 8q24.21, 8q24.3, 20q11-20q13 en verliezen aan 3p14.2 kunnen zijn gemeenschappelijke gebeurtenissen bij maagkanker. Echter, CNA's op 7p22.1, 13q34 en 17p13.3 kan Koreaanse-specifiek zijn. Bovendien, aantal kopieën winsten wellicht vaker in de darm-type zijn dan diffuse-type maagkanker.

Materialen en methoden

Studie bevolking en DNA-extractie

Een totaal van 88 patiënten, 35 vrouwen en 53 mannen, die curatieve chirurgische resectie voor maagkanker had ondergaan tussen november 2004 en oktober 2010 op de afdeling Chirurgie in de Samsung Medical Center, Seoul, Korea, namen deel aan deze studie. Operatief verwijderd tumor weefsels werden verzameld na verkregen schriftelijke toestemming van alle patiënten. Deze studie werd goedgekeurd door de Samsung Medisch Centrum (SMC) Institutional Review Board (IRB). De tumoren werden snel bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C totdat het nodig is. Voorafgaand aan DNA extractie uit de bevroren weefsels werden de coupes op objectglaasjes geplaatst en gekleurd met H &E voor de vermenging van tumoreuze en niet-tumor weefsels evalueren. Tumor en non-tumor gebieden werden zorgvuldig gemicrodissecteerde onder een microscoop. De gemicrodissecteerde weefsels werden gedigesteerd met proteinase K, en het genomische DNA werd geïsoleerd volgens de instructies van de fabrikant (DNeasy Tissue kit, Qiagen, Valencia, CA). Het monster bestond uit 43 diffuse type kanker, 41 intestinale-type en 4 mixed-type kankers.

CNA analyse met aCGH

De aCGH werd uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Na DNA-hybridisatie en wassen, werden objectglaasjes onmiddellijk gescand met behulp van een Agilent microarray scanner, en de ruwe data werden geëxtraheerd met behulp van Feature Extraction Software op de standaard CGH parameterinstellingen (Agilent Technologies). Vermeende CNA intervallen in elk monster werden geïdentificeerd met behulp van Agilent Genomic Workbench v7.0.4.0 software. Cy5 /Cy3 verhoudingen werden omgezet in log _{2-getransformeerde waarden. Centralisatie en fuzzy nul correcties zijn aangebracht op de microarray. De aberratie Detectiemethode 2 (ADM-2) algoritme bij de drempel 6,0 werd gebruikt voor de CNA in afzonderlijke monsters identificeren en aberratie frequenties in maagkanker monsters (figuur 5) te bepalen. De volgende filters werden gebruikt: minimum aantal sondes in het gebied > = 3, minimum absolute gemiddelde log verhouding van regio > = 0,25. Common afwijkingen werden gedetecteerd met behulp van de-context gecorrigeerde algoritme op p-waarde < 0,05 en een overlapping van 0,9. De CNAR (Copy Number Wijziging Regio) werd gedefinieerd als de vereniging van meer dan 90 procent overlappende afwijkende segmenten over meerdere monsters. De UCSC genoom samenstel hg19 werd gebruikt als referentie humane genoomsequentie. Voor elk platform (244K, 400K en 60K), werd de in serie globale Lowess normalisatiemethode toegepast om te corrigeren voor lokale ruimtelijke vertekening en continue ruimtelijke gradiënten. Na de binnen reeks normalisatie, werd een kwantiel tussen scala normalisatie toegepast op de aberratie resultaten in arrays te vergelijken. Deze normalisaties werden uitgevoerd met de limma verpakking R. De MCR (Minimal Common Regio) werd gedefinieerd als 100 procent overlapping gemeenschappelijke gebied tussen monsters in de CNAR. Er zijn verschillende MCRs de CNAR volgens de mogelijke overlapping frequentie. De MCR amplificatie en deletie werd geanalyseerd. Amplificatie en schrapping werd gedefinieerd als de genormaliseerde log2 ratio ≥0.8 en ≤-0,8, respectievelijk. Alle statistische methoden en visualisatie van de individuele afwijkende regio's werden uitgevoerd met R statistische taal v.3.0.2 (www.r-project.org).}

Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) Analyse

MLPA analyse werd uitgevoerd met de kit SALSA MLPA P200 (MRC-Holland, Amsterdam, Nederland) volgens de instructies van de fabrikant [52]. De P200 kit bevat 14 interne controle probes voor DNA denaturatie en DNA hoeveelheid en ook de X en Y-chromosoom beoordelen. DNA monsters werden verdund met TE tot 5 ul en werden gedurende 5 min bij PCR buisjes verwarmd bij 98 ° C in een thermocycler met een verwarmd deksel. Na de toevoeging van 1,5 ul MLPA buffer en 1,5 ul probe-mengsel, monsters werden verder verwarmd gedurende 1 min bij 95 ° C en vervolgens gedurende 16 uur bij 60 ° C. De probe sequenties voor genen gedetecteerd worden in tabel H S1 File. Ligatie van oligonucleotiden werd uitgevoerd door verdunning van de monsters 40 pl met een verdunning buffer die 1 U Ligase-65 enzym en het incuberen gedurende 15 minuten bij 54 ° C. Het ligase werd geïnactiveerd door verwarming bij 98 ° C gedurende 5 min en ligatie producten werden geamplificeerd met PCR. Terwijl bij 60 ° C, 10 pl van een gebufferde oplossing die de PCR primers, dNTP's en SALSA polymerase (MRC-Holland, Amsterdam, Nederland) toegevoegd. PCR werd gedurende 35 cycli (30 s bij 95 ° C, 30 s bij 60 ° C en 1 minuut bij 72 ° C). De MLPA PCR reacties werden gescheiden met capillaire elektroforese systeem, werd ABI-Prism 3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA), en de gegevens geanalyseerd met een GeneMaker 2.0.0 (SoftGenetics, State College, PA).

• PLoS ONE: Significante Vereniging van Interleukin4 Intron 3 VNTR Polymorfisme met Gevoeligheid voor maagkanker in een Zuid-Indiase bevolking van Telangana
• PLoS ONE: de apoptotische effect van HIF-1α Remming Gecombineerd met Glucose plus insulinebehandeling op maagkanker onder hypoxische condities