PLoS ONE: počet kópií Zisky v 8q24 a 20q11-q13 v rakoviny žalúdka sú častejšie v črevnej-Type ako difúzny Type

abstraktné

Táto štúdia bola zameraná na poznávanie čísel DNA kópie zmeny (CNAS) podieľajúce sa na karcinogenéze žalúdka a na pochopenie ich klinicko významy v kórejskej populácie. počty kópií DNA boli analyzované pomocou Agilent 244K alebo 400K array komparatívna genomická hybridizácia (aCGH) v čerstvom mrazené nádoru a uzavreté normálnych tkanív zo 40 pacientov s rakovinou žalúdka. Niektoré zistené CNA regióny boli validované za použitia multiplexové amplifikácie sondy ligační závislé (MLPA) v šiestich z 40 pacientov a prispôsobiť Agilent 60K aCGH v samostatnej sade 48 karcinómov žalúdka. Hladiny mRNA génov u bežných CNA regióny boli analyzované pomocou kvantitatívnej PCR v reálnom čase. Počtom kópií zisky boli častejšie než straty v celej genómu v nádorovom tkanive v porovnaní so zodpovedajúcimi normálnymi tkanivami. Priemerný počet zmien na veci bolo 64 pre zisky a 40 strát, a stredná dĺžka aberácie bolo 44.016 bp pre zisky a 4732 bp za straty. Počtu kópií zisky boli často zistené pri 7p22.1 (20%), 8q24.21 (27% -30%), 8q24.3 (22% -48%), 13q34 (20% -31%), a 20q11-q13 (25% -30%), a straty v 3p14.2 (43%), 4q35.2 (27%), 6q26 (23%), a 17p13.3 (20% -23%). CNAS na 7p22.1, 13q34 a 17p13.3 neboli hlásené u iných populácií. Väčšinu strát počtu kópií bolo spojené s down-regulácia hladín mRNA, ale korelácia medzi počtu kópií zisky a hladiny expresie mRNA meniť spôsobom, ktorý je závislý na génu. Okrem toho počtu kópií zisky tendenciu sa vyskytujú častejšie u rakoviny čriev typu ako u karcinómov difúzna typu. Na záver, táto štúdia naznačuje, že počet kópií zisky v 8q24 a 20q11-q13 a straty na 3p14.2 môžu byť spoločné akcie v žalúdku rakovinu, ale CNAS na 7p22.1, 13q34 a 17p13.3 môže byť kórejský-špecifické.

Citácia: Jin DH, Park SE, Lee J, Kim KM, Kim S, Kim DH, et al. (2015) Copy Number Získava v 8q24 a 20q11-q13 v rakoviny žalúdka sú častejšie v črevnej-Type ako Diffuse-Type. PLoS ONE 10 (9): e0137657. doi: 10,1371 /journal.pone.0137657

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN

prijatá: 8. marca 2015; Prijaté: 19 augusta 2015; Uverejnené: 11.09.2015

Copyright: © 2015 Jin et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje spadajú do papiera a jeho podporné informácie súbory. Údaje aCGH-244K a aCGH-400K možno stiahnuť z NCBI je Gene Expression Omnibus portálu. (Www.ncbi.nlm.nih.gov/geo, prístupové číslo: GSE69318 a GSE69266, v uvedenom poradí)

Financovanie: Táto práca bola podporená grantom z Národného R &D Program pre kontrolu rakoviny, ministerstvo zdravotníctva a sociálnej starostlivosti (p0270) a z Kórey Health Industry Development Institute (KHIDI), financovaného Ministerstvom zdravotníctva & Welfare (HI14C1979), Kórejská republika

Konflikt záujmov :. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Žalúdočné rakovina je treťou najčastejšou príčinou rakoviny. úmrtí na celom svete. Aj napriek významné pokroky v diagnostike a liečbe rakoviny žalúdka, päťročné prežitie pacientov s karcinómom žalúdka zostáva nižší ako 30% vo väčšine krajín [1]. Okrem toho približne polovica pacientov, ktorí prekonali kuratívne chirurgickú resekciu stále vyvíjať loco-regionálnej alebo vzdialené metastázy aj cez multi-modality terapeutického prístupu a úmrtí v dôsledku ochorenia [2,3]. Hoci väčšina karcinómov žalúdka vykazuje podobné klinické rysy, tam je značná rôznorodosť vo svojom histopatológie a súvisiace molekulárne zmeny [4]. V súlade s tým, že je dôležité identifikovať molekulárnej biomarkery podieľajúce sa na karcinogenéze žalúdka rakoviny pre včasnú detekciu a cielené terapiu ochorení.

DNA počet kópií zmena (CNA) je definovaný ako DNA segmenty 1 kb alebo väčšie veľkosti, je dôležitým typom genetickej zmeny pozorované v rakovinových bunkách [5]. CNAS môžu ovplyvňovať expresiu génov, fenotypovou variabilitu a prispôsobenie narušením bližšieho alebo vzdialených regulačných oblastí DNA alebo zmenou úrovne génovej dávkových [6,7]. Okrem toho je rozdelenie počtu kópií sa výrazne líšia v odlišných rodových populácií, ktoré môžu vyústiť v inom náchylnosťou na ochorenia po celej rodových skupín [8]. V poslednej dobe sa niekoľko skupín analyzovali zmeny počtu kópií génov u karcinómu žalúdka pomocou array komparatívna genomická hybridizácia (aCGH) a boli identifikované nové gény dôležité pre patogenéze rakoviny žalúdka [9-14]. Napríklad Tsukamoto et al. [10] skúmali CNAS v 30 prípadoch rakoviny žalúdka pomocou BAC alebo PAC klonov a identifikoval najčastejšou oblasťou DNA počtu kópií zisky ako 20q13, 20q11, 8q24 a 20p12, a tie straty sú 4q34-qter, 5q12, 18q21 a 3p14. Fan et al. [11] zistená CNAS v 64 žalúdočných rakovinových tkanív a 8 žalúdočných rakovinových bunkových línií pomocou BAC klonov, a poznamenal, že 20q12-20q13 a 9p21 boli najčastejšie zosilnený a odstránené regióny, resp. Okrem toho, Cheng et al. [12] skúmali CNAS v 27 karcinómov žalúdku podľa aCGH-244K a identifikovať 8p11-O24, 20q11-Q13 a Q22 a 7q21-ako najviac získaných regiónov a 4q34, 6p25, 18q12 a 18q22 ako väčšina stratených regiónov. V týchto predchádzajúcich štúdiách, rôzne microarrays (BAC alebo PAC klonu, oligo) boli použité pre vyšetrovanie CNAS v karcinómu žalúdka, a pozorované CNA regióny boli rôzne pre rôzne študijné populácie.

Na identifikáciu CNAS dôležitý v patogenéze žalúdočné rakoviny v kórejskej populácie, najprv vykonali analýzu celého genómu v počte kópií génov pomocou aCGH-244K alebo aCGH-400K v 40 karcinómov žalúdka a následne overené zistené CNAS pomocou upraveného aCGH-60K v ďalšej sade 48 žalúdočných rakoviny. Účinky CNAS na génovej expresie boli analyzované v niektorých génov s CNAS.

Výsledky

Objav CNAS zapojený do karcinogenéze žalúdočných

Ak chcete zistiť CNAS zapojiť do karcinogenity žalúdka, nádor a uzavreté normálneho tkaniva od 40 pacientov s karcinómom žalúdka boli analyzované za použitia poľa komparatívna genomická hybridizácia (aCGH); 30 prípadov podľa aCGH-400K a 10 prípadov aCGH-244K. CNAS boli detekované v celom genóme, a počet kópií zisky boli častejšie než počet kópií strát (obr 1A). Počet CNAS bola diametrálne odlišná medzi jednotlivcami. Priemerný počet CNAS na jeden prípad bolo 64 pre zisky a 40 strát (obr 1B), a stredná dĺžka regiónu CNA bolo 44.016 bp pre zisky a 4732 bp za straty (obrázok 1C). Spoločné CNAS boli detekované za použitia kontexte s opravenými algoritmus s prahom p-hodnota 0,05 a prahu presahom 0,9 (obr 1D). Kopírovať číslo zisky boli často zistené u chromozomálnych regiónoch 7p22.1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34 a 20q11-q13, a počet kópií straty boli často pozorované na 3p14.2, 6q26, 7q36.3, 13q34 a 18q23 , Tieto straty boli veľmi detekované na koncoch chromozómov, a veľkosť je relatívne malá. CNAS boli menej časté na chromozómoch 2 a 15. bežných dĺžok aberácie s nízkym p-hodnota klesla predovšetkým do 1 kb, 10 kb (Obr 1E). Bežné odchýlky okolo MYC
génu v 8q24.21 sú uvedené na obr 1F. Údaje aCGH-244K a aCGH-400K možno stiahnuť z Gene Expression Omnibus portálu NCBI je (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). (Prístupové číslo: GSE69318 a GSE69266, v uvedenom poradí)

Validation z aCGHs podľa MLPA analýzu

niektoré genomické nevyváženosti detekovaná aCGH boli overené s použitím multiplexové amplifikácie sondy na báze PCR ligačního závislé (MLPA). Šesť z tkanivových vzoriek 40 analyzované pomocou aCGH boli k dispozícii pre MLPA. Kopírovať číslo obmeny MYC
(8q24.21), FHIT
(3p14.2), WDR60
(7q36.3), COL4A2
(13q34), NFATC1
(18q23) a NCOA3
(20q12) boli analyzované v šiestich uzavreté nádorových a normálnych párov tkanív (268-1, 271-1, 272-2, 301 -1, 685-1 a 685-2). MYC
bol zosilnený v 271-1T a 301-1T (obr 2A), NCOA3
bola získaná v 301-1T a 685-2T (obr 2B), a FHIT
bol odstránený v 271-1T, 301-1T a 685-1T (obr 2A). Tieto výsledky boli veľmi konzistentné s tými, ktoré detekuje aCGH. Avšak, počet kópií straty génov, ako je napríklad WDR60
(Obr 2C), NFATC1
(obr 2D) a COL4A2
(obr 2E), ktoré boli nájdené byť stratený v aCGH, neboli zistené v MLPA. Dĺžka oblasti delécie v WDR60
génu detekovaný aCGH 2907 bp, a COL4A2 stroje a NFATC1
bola 1903 bp a 2596 bp, v danom poradí. Na základe týchto pozorovaní, je pravdepodobné, že aberácie klenout malej oblasti dodržiavali aCGH môžu byť falošné.

Ďalšie validácia CNA kraju podľa aCGH-60K

Ak chcete overiť a spresniť regióny CNA rekurentných (viac ako 20%) počet kópií ziskov a strát pozorovaných aCGH v 40 vzorkách, budeme ďalej analyzovať ich aberácií v nádore a spárované normálneho tkaniva z iného 48 pacientov s karcinómom žalúdka pomocou personalizovaného aCGH-60K. Regióny v 8q24, 20q11-q13, 3p14.2 a 18q23 CNA ukázal súhlasné zmeny počtu kópií v aCGH-60K, ale CNAS v iných regiónoch, ako je 20p13-20p12 a 20q21.2, neukázal rovnaké vzorce ako je tomu v 244K a 400K, čo naznačuje heterogénne výsledkov medzi platformami aCGH. Ak chcete zistiť minimálne spoločné oblasti (MCRs) o počte kópií zmeny medzi troma platformami, máme prekrývali regióny CNA v celkovo 88 vzoriek. MCRs rekurentných (viac ako 20%) počet kópií zisky boli detekované na viac chromozomálnych oblastiach vrátane 7p22.1 (20%), 7q22.1 (31% ~ 44%), 8q24.21 (27% ~ 30%), 8q24.3 (22% ~ 48%), 13q34 (20% ~ 31%), a 20q11 ~ Q13 (25% ~ 30%) (tabuľka 1 a tabuľka a S1 súboru). MCRs rekurentných (viac ako 20%) počet kópií straty boli tiež nájdené v siedmich chromozomálnych oblastiach, vrátane 3p14.2 (43%), nesúci FHIT
(tabuľka 1 a tabuľka B v S1 súboru)

Gene závislé na súvislosť medzi úrovňami CNAS a mRNA

Pre skúmanie účinku CNAS na génovej expresie sme merali hladiny mRNA niekoľkých génov ( MYC
Scribe
, PUF60
BOP1
SNTA1
E2F1
CD40
EYA2
NCOA3
FHIT
CRK stroje a
Smad2) na spoločných aberácie regiónov v 48 nádoru a uzavreté normálne tkanivá a analyzovali asociáciu s CNAS. Účinok CNAS na génovej expresie bola analyzovaná porovnaním zmeny mRNA násobné (FC) v nádorových ochorení s a bez CNAS. Korelácia medzi počtu kópií zmeny a zodpovedajúce génovej expresie sa líšiť v závislosti od počtu kópií zisky alebo straty. Väčšina génov s počtom kópií straty vykazovali znižujúce množstvo mRNA: hladina mRNA bola downregulated v FHIT
(tabuľka 2 a obr 3A), CRK stroje a Smad2
gény (tabuľka 2). Avšak sme zistili koreláciu medzi počtom kópií zisky a up-reguláciu hladiny mRNA bol gén špecifický: hladiny mRNA v génoch, ako je napríklad MYC
PUF60
BOP1
(obrázok 3B), a E2F1
boli pozitívne spojené s počtom kópií zisky. Avšak Neboli nájdené súvislosť medzi hladinou mRNA a počet kópií zisky génov, ako je napríklad Scribe
BCL2L1
SNTA1
CD40
EYA2 stroje a NCOA3
(tabuľka 2), čo naznačuje, že vzťah medzi počtom kópií zisky a expresie môže byť gén špecifický.

Združenie CNAS s klinicko-charakteristikami

Spojenie medzi počtu kópií zmeny a klinicko-premenných bol analyzovaný v 88 pacientov s karcinómom žalúdka. Pätnásť gény s recidivujúcim (viac ako 20%) počet kópií zmeny boli vybrané na analýzu. Kopírovať číslo straty CRK
( P
= 0,07), Smad2
( P
= 0,09), FHIT
( P
= 0,68) a NFATC1
( P
= 0,11) génov nijako výrazne líšiť medzi difúzna rakovín typu a rakoviny čriev typu (obr 3C). Avšak počtu kópií zisky tendenciu nastať pri vysokou prevalenciou v rakoviny čriev typu ako u karcinómov difúznej typu (3D Obr a 3E, tabuľka C v S1 súboru). Pre Scribe
( P
= 0,36), PUF60
( P
= 0,07), MAPK15
( P
= 0,08), E2F1
( P
= 0,14), SNTA1
( P
= 0,15), BCL2L1
( P
= 0,15), NCOA3
( P
= 0,22) a EYA2
( P
= 0,06), počtu kópií zisky boli zistené pri vysokou prevalenciou v rakoviny čriev typu ako u rakovín difúzne typu, ale rozdiel nebol štatisticky významný. Kopírovať číslo zisky MYC
( P
= 0,03), BOP1
( P
= 0,03) a CD40
( P
= 0,01) boli nájdené na značne vysokú prevalenciou u rakovín čriev typu v porovnaní s difúznou typu rakoviny. Pre detekciu CNAS súvisiacich so starnutím obyvateľstva, sme analyzovali vzťah medzi vekom pacienta a kopírovať zmenu čísla za použitia Pearsonovho korelačné koeficienty, ale zistil, nebola nájdená žiadna korelácia medzi zmenou počtu kópií 15 génov a veku pacienta (obr 4A). Hierarchickej zoskupovanie analýza bola vykonaná, aby sa u pacientov v skupine s podobným CNAS. Väčšina pacientov s počtu kópií zisky v 8q24 tiež mal počet kópií zisky na 20q11.21 alebo 20q13.12 (obr 4B). Údaje boli rozdelené do 4 zhlukov podľa prítomnosti počtu kópií ziskov v 8q24 a 20q11.21 (alebo 20q13.12). Počtom kópií zisky v 8q24 bola významne spojená s počtu kópií zisky na 20q11.21 alebo 20q13.12 ( P
= 0,005, Fisherov presný test, Tabuľka D v S1 súboru). Tieto pozorovania naznačujú, že tieto dva regióny, 8q24 a 20q11.21 (alebo 20q13.12), môže byť podobne náchylné k počtu kópií zisky u karcinómu žalúdka.

Diskusia

Zmena génu dávkovanie od CNA je stále viac uznávaná ako dôležitá súčasť vzniku nádorového ochorenia. Ak chcete zistiť román CNAS zapojený v patogenéze rakoviny žalúdka, sme vykonali analýzu celého genómu z CNAS v nádoru a uzavreté normálneho tkaniva od 88 pacientov s karcinómom žalúdka a identifikovať opakujúce (> 20%) počet kópií zisky na viac chromozomálnych regiónov vrátane 7p22 0,1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34, 20q11 ~ Q13 a opakujúce sa straty na 3p14.2, 4q35.2, 6q26 a 17p13.3. CNAS na 7p22.1, 13q34 a 17p13.3 neboli hlásené u iných populácií. Tieto 7p22.1 regióny uvedené v tejto štúdii obsahujú gény FBXL18, ACTB, ACTG1 a RNF216. Hoci CNAS na 7p22.1 neboli hlásené u rakoviny žalúdka, niekoľko štúdií vykazujú ich vplyv na vývoj vaječníkov jasných buniek adenokarcinómu [15] a endometriózy [16]. V tejto štúdii, počet kópií úprav na MYC
(8q24.21), FHIT
(3p14.2) a NCOA3
(20q12) bol overený pomocou MLPA, ale počtom kópií straty ( WDR60
COL4A2
NFATC1
) vo výške približne 2000bp neboli potvrdené MLPA. Nepodarilo sa nám uskutočniť rozsiahle výpočtové odhad falošne pozitívnych sadzieb pole založené na volanie. Namiesto toho sme porovnávali prevalenciu počtu kópií strát medzi aCGH-244k & -400K A aCGH-60K s veľmi husté sondy v závislosti na veľkosti strát počtu kópií: 1 KB-5 KB, 5 kb-10KB, 10 kb-50KB, 50 KB-100KB, a 100k-. Štatisticky významné rozdiely boli nájdené len v počte kópií straty malej veľkosti (1kilobajt-5 KB) (tabuľka E v S1 súboru). Okrem toho, že významné rozdiely boli nájdené v chromozómové lokuse špecifickým spôsobom: neboli zistené rozdiely v chromozómoch 3, 6, 16, 17, a 20 (dáta nie sú uvedené). Z tohto dôvodu je možné, že počet kópií straty malej veľkosti detekovanej v aCGH-244K a 400K-aCGH môže byť falošný v nejakom loci.

Ďalej analyzované minimálna spoločných oblastí opakujúcich sa (≥10%) amplifikácia alebo delécie v 88 karcinómov žalúdka (tabuľka F v S1 súbor) a porovnal ich s veľkým rakovinou žalúdka TCGA (Rak Genome Atlas) štúdie (14) a troch predchádzajúcich štúdiách (tabuľka G v S1 súboru). Štúdia TCGA tvorilo 295 primárnych adenokarcinómov žalúdka a určila 30 ohniskovej amplifikácie a 45 kontaktné odstránenie. Zosilnenie (≥ 5 kópií), na 8q24.21 ( MYC
), 17q12 ( ErbB2
atď.), 20q11.1-q13.33 (EYA2
NCOA3
atď.), a delécie (0 ks) na 3p14.2 ( FHIT
) boli pozorované u našich dát, ako aj dáta z TCGA a štúdií druhých (tabuľka G v S1 File). Avšak, CNAS na 7p22.1, 13q34 a 17p13.3 neboli hlásené v štúdii TCGA a iných zásob. Počet krajov CNAS zistených v štúdii TCGA bola väčšia ako súčasné štúdie, ktoré by mohli vyplývať z rôznych podskupín členov vzoriek. Štúdia TCGA sa skladá z väčšieho intestinálneho typu (66,4%) v porovnaní s nádormi (23,4%) typ difúzneho.

Medzi gény sa nachádzajú na 8q24.21, MYC je známe, že podporujú rast a proliferáciu normálnych žalúdočné bunky a Vyradenie MYC
obmedzuje rast a proliferáciu buniek karcinómu žalúdka [17]. MYC
kóduje transkripčný faktor, ktorý reguluje rad génov súvisiacich s proliferácie, diferenciácie a apoptózy [18]. MYC
je zosilnený a nadmerne exprimovaný u karcinómu žalúdka [19], a jej expresia sa zvyšuje postupne, ako sa rakovina vyvíja [20]. MYC
amplifikácia je spojená s agresívnym správaním buniek karcinómu žalúdka [21,22]. V tejto štúdii, počet kópií zisky MYC
boli nájdené na vysokú prevalenciou v nádorových ochorení črevné typu v porovnaní s rakovinou difúzneho typu, čo podporuje zistenie, že expresia MYC proteín častejšie pozorované v intestinal- typ nádorov než v difúznej typu nádorov [23]. Analyzovali sme účinok MYC
CNAS na celkové prežitie v rámci každého typu. Pacienti s počtu kópií zisky MYC
mal zlú celkové prežívanie v porovnaní s pacientmi bez, ale rozdiel nebol štatisticky významný v difúznym a typu rakoviny čriev (S1 Obr). Počtu kópií zisky na POU5F1B
(POU domény trieda 5 transkripčný faktor 1b) pseudogenu na 8q24.21 boli zistené u 27% analyzovaných vzoriek. POU5F1B
je známe, že sú spojené s množstvom mRNA a agresívne fenotypu rakoviny žalúdka [24].

8q24.3 a 20q11-Q13 spojí oblasti obsahujú stovky génov (tabuľky A S1 file), ale mnohé z nich sú pravdepodobne zapojení do onkogenézy. Medzi gény v týchto regiónoch, sme analyzovali hladiny mRNA Scribe
PUF60 stroje a BOP1
na 8q24.3 a SNTA1
E2F1
CD40
EYA2 stroje a NCOA3
na 20q11-q13 (tabuľka 2). V tejto štúdii, počet kópií zisky Scribe
SNTA1
CD40
EYA2 stroje a NCOA3
boli nie sú spojené s násobnou zmenu hladín mRNA. Avšak, PUF60
BOP1 stroje a boli nájdené E2F1
gény byť výrazne nadmerne exprimované v nádorových tkanivách s počtom kópií zisky. PUF60
bol nadmerne exprimovaný u rakovín s CNAS ( P
= 0,038), ale jeho expresia nebola významne odlišná medzi nádorových tkanivách a uzavreté normálnych tkanivách vo vzorkách bez CNAS ( P
= 0,111). PUF60 (poly-U viažuci faktor zostrihu 60 kDa), proteín interagujúce represorový poistka viažuci (FIR), hrá úlohu v jadrových procesov, ako je pre-mRNA zostrihu a reguláciu transkripcie. Okrem toho, PUF60 potláča MYC
transkripcie na P2 promótorom cez bazálny transkripčný faktor jadru TFIIH [25]. V poslednej dobe, Gumireddy et al. [26] uvádzajú, že PUF60 je nutná pre funkciu regulátora translačný regulačné IncRNA (treRNA), ktorý je zapojený do nádorovej invázie a metastáz. Počtom kópií zisky PUF60
vykazujú silnú pozitívnu koreláciu s expresiou u rakoviny žalúdka [27] a u rakoviny vaječníkov [28]. Tieto pozorovania naznačujú, že v počte kópií zisky PUF60
môže byť hlavný mechanizmus, z ktorého tento nadmernou expresiou génu u rakoviny žalúdka.

Na rozdiel od PUF60 sa BOP1 a E2F1 bolo zistené, byť nadmerne exprimovaný v nádorových tkanivách s počtu kópií zisky, rovnako ako u tých bez neho. Počtu kópií zisky BOP1 stroje a E2F1
v tejto štúdii došlo u 23% a 25% vzoriek študoval, resp. Zvýšené mRNA zložiť zmeniť BOP1
bol významný v nádorových tkanivách s počtom kópií ziskov ( P
= 0,024), ako aj u pacientov bez ( P Hotel < 0,001) , BOP1 (blok proliferácie 1) je súčasťou PeBoW (pes1, Bop1 a WDR12) komplexu, ktorá je potrebná pre dozrievanie 28S ribozomálnej RNA a 5.8S a formovanie 60S ribozomálnu [29]. BOP1 hrá onkogénne úlohu v hepatocelulárneho karcinómu navodením epiteliálne-mezenchýmových prechod (EMT) a v podpore aktínu cytoskelet remodelácie [30]. BOP1
gén je známe, že je nadmerne vyjadrený v liečbe karcinómu rekta s 8Q zisk [31], a zvýšenie dávky z BOP1
gén je spojený s nárastom BOP1
mRNA v kolorektálneho karcinómu [32]. E2F1 bol tiež exprimovaný v nádorových tkanivách s počtom kópií zisky ( P Hotel &0,001) a u pacientov bez ( P
= 0,03). E2F1 hrá kľúčovú úlohu v regulácii bunkového cyklu a jeho aktivita je regulovaná prostredníctvom väzby na proteín retinoblastomem v závislosti na veľkosti bunkového cyklu závislé. Nadmerná expresia E2F1 je spojený s rozvojom rôznych nádorov, a zvýšenie počtu kópií E2F1
je známe, že sú spojené s nadmernou expresiou génu v melanómu [33] a rakoviny krčka maternice [ ,,,0],34]. Na základe týchto pozorovaní, je pravdepodobné, že celkový vplyv počtu kópií ziskov na génovú expresiu u rakoviny žalúdka sa líšia spôsobom génu závislá.

Aj keď počet kópií zisky v 13q34 neboli hlásené u karcinómu žalúdka sa zisky boli nájdené v 20-30% vzoriek študovaných. Počtu kópií zisky na 13q34 je známe, že sú spojené s progresiou cervikálna intraepiteliálna neoplázia do spinocelulárneho karcinómu [35] a tenkého čreva adenokarcinóme [36]. Počtom kópií zisky v 17q12 sú časté u karcinómu žalúdka. V tejto štúdii, niekoľko génov, vrátane ErbB2
GRB7
STARD3
PPP1R1B
RARA
, a C17orf37, boli zosilnené u 15-20% z 88 prípadov, v súlade s inými štúdiami [37,38]. My sme nehodnotí korelácii počtu kópií a expresie úrovni génov, ale niekoľko skupín, uvádzalo, že gény sú dôležité v rozvoji rakoviny žalúdka. Medzi nimi, ErbB2 (HER2)
je často zosilnený a nadmerne exprimovaný v karcinómov žalúdka [39-41], a amplifikácia HER2
silno spojené so zlou prežitie, a to najmä v črevnej typ rakoviny žalúdka [42]. Imunoreaktivita ErbB2 tiež vyskytuje vo vyššej miere prevalencie v črevnom druhu ako v difúznych podtypy [43]. Okrem toho je PPP1R1B-STARD3
transkriptov fúzneho do ľudského karcinómu žalúdka zvyšuje tvorbu kolónií prostredníctvom aktivácie phosphatidylinosil-3-kinázy a AKT signalizácie [44]. Častá zosilnenie GRB7 stroje a pozitívne zmeny v expresii boli hlásené aj u karcinómu žalúdka [41,43].

Medzi najčastejšie straty v tejto štúdii boli detekované na 3p14.2 (39% v roku difúzna typy a 37% črevných typov), kde FHIT
leží. FHIT
je známy nádorový supresorové gén [45], a sú často zapojené do stratu heterozygotnosti (LOH) a delécií v ľudských nádoroch [46]. Primárne žalúdočné karcinómy predstavujú nové usporiadanie na FHIT
génu a 20 30 (67%) vzorky vykazovali absenciu FHIT
expresie proteínov [47]. Strata FHIT
expresie proteínu koreluje s progresiou ochorenia a zlou diferenciácie u rakoviny žalúdka [48]. V tejto štúdii sme pozorovali, že FHIT
expresie bola znížená v karcinómov žalúdka s alebo bez jeho CNA, čo naznačuje, že gén dávkovanie, ako aj ďalšie mechanizmy regulácia FHIT
expresie v karcinómu žalúdka. Somatická missense mutácie (exón 6, kodóne 61, ACG → ATG) zo FHIT
bol tiež identifikovaný v žalúdku rakoviny [49]. Navyše vysoká frekvencia promótor hypermetylace zo FHIT
(62%) je pozorovaná u karcinómov žalúdka [50]. Preto integrovať údaje Číslo kopírovanie s prídavným genomických dát je nevyhnutná pre komplexné pochopenie genetickú kontrolu génovej expresie [51].

počet kópií straty niekoľkých génov v tejto štúdii významne nelíšila medzi rakoviny difúzna typu a rakoviny čriev typu. Avšak, prevaha počtu kópií ziskov bol rozdiel medzi oboma typmi v niektorých génov, čo naznačuje, že faktory životného prostredia môžu byť vplyvnejší v počte kópií zisky než straty. Okrem toho pacienti s počtu kópií ziskov z 8q24.21 a 8q24.3 tendenciu mať zisk z 20q11-Q13, čo naznačuje, obe oblasti môžu byť rovnako tak náchylné k variácií v počte kópií. Táto štúdia bola výrazne obmedzená vzhľadom na malý počet vzoriek a nedostatok údajov o prežitie. je potrebné ďalšie štúdie vo veľkej skupine pochopiť funkčný význam CNAS objavené v tejto štúdii. Okrem toho, meranie mRNA neboli vykonávané na úrovni genómu. Analyzovali sme vzťah medzi hladinou mRNA niektorých génov je známe, že sú dôležité pri patogenéze ľudskej rakoviny a CNAS. Významná korelácia bola zistená medzi úrovňami expresie MYC
PUF60
BOP1 stroje a E2F1
gény a ich CNAS (tabuľka 2) , Štatisticky významná korelácia medzi CNAS zo MYC
PUF60 stroje a E2F1
gény a ich hladiny expresie bol tiež nájdený Fan et al. (11). Je však potrebné ďalšie štúdie jasne pochopiť dopad CNAS na génovej expresie. Na záver, táto štúdia ukazuje, že počet kópií DNA získava na 8q24.21, 8q24.3, 20q11-20q13 a straty na 3p14.2 môžu byť spoločné akcie v rakoviny žalúdka. Avšak, CNAS na 7p22.1, 13q34 a 17p13.3 môže byť kórejský-špecifické. Okrem toho, počet kópií zisky môžu byť častejšia u črevnej typu ako difúzny typu rakoviny žalúdka.

Materiály a metódy

Štúdium populácie a DNA extrakcie

Celkom 88 pacientov, 35 žien a 53 mužov, ktorí podstúpili kuratívne chirurgickej resekcii pre rakoviny žalúdka od novembra 2004 do októbra 2010 na oddelení chirurgie Samsung Medical Center, Soul, Kórea, sa zúčastnilo v tejto štúdii. Chirurgicky odstrániť nádorové tkanivá boli odobraté po získaní písomného informovaného súhlasu od všetkých pacientov. Táto štúdia bola schválená Samsung Medical Center (SMC) Institutional Review Board (IRB). Nádory boli snap-zmrazený v kvapalnom dusíku a skladované pri -80 ° C až do použitia. Pred extrakciou DNA z čerstvej mrazené tkaniva, rezy boli umiestnené na sklíčka a zafarbené H &E pre vyhodnotenie prímesou nádorových a non-nádorových tkanivách. Nádorových a nenádorových oblasti boli starostlivo microdissected pod mikroskopom. Tieto microdissected tkanivá boli štiepené proteinázy K, a genomická DNA bola izolovaná podľa inštrukcií výrobcu (Tissue súpravy DNeasy, Qiagen, Valencia, CA). Vzorka sa skladal z 43 difúzna typu rakoviny, 41 črevného typu a 4 zmiešané typu rakoviny.

CNA analýza pomocou aCGH

aCGH bola vykonaná podľa odporúčania výrobcu. Po DNA hybridizácia a premývanie, šmykľavky, ktoré boli skontrolované bezprostredne za použitia Agilent microarray skener a surové dáta boli získané pomocou Feature Extraction Softvér na východiskové nastavenie parametrov CGH (Agilent Technologies). Domnelý CNA intervaly v každej vzorke boli identifikované s použitím Agilent genómovej Workbench v7.0.4.0 softvér. Cy5 /pomery Cy3 boli prevedené do protokolu _{2 transformovaných hodnôt. Centralizácia a fuzzy nula opravy boli aplikované na mikročipu. Aberácie Detekčná metóda 2 (ADM-2) algoritmu na prahu 6,0 bola použitá na identifikáciu CNAS v jednotlivých vzorkách a stanoviť aberácie frekvencií vo vzorkách s karcinómom žalúdka (obrázok 5). Boli použité nasledujúce filtre: minimálny počet sond v regióne > = 3, minimálny absolútny priemerný pomer log regiónu > = 0,25. Bežné aberácie boli detekované pomocou kontextového korigovaný algoritmu pri hodnota p < 0,05 a prah prekrytie 0,9. CNAR (Copy Number Zmeny región) bola definovaná ako spojenie viac ako 90 percent prekrývajúce sa aberantne segmenty naprieč viac vzoriek. UCSC zostava genómu hg19 bol použitý ako referenčný ľudskej genómovej sekvencie. Pre každú platformu (244K, 400K a 60K) bola použitá v poli globálnej LOWESS metóda normalizácie ku korekcii lokálnej priestorovú predpojatosti a súvislé priestorové gradienty. Po vnútri poli normalizácie, je kvantilová medzi poľami normalizácia bola použitá na porovnanie výsledkov aberácie v celom poli. Tieto normalizáciou vykonávali s použitím balíčka Limmat v R. MCR (minimálny spoločný región) bola definovaná ako 100 percent prekrývajúce sa spoločné oblasti medzi vzorkami v CNAR. Existuje niekoľko MCRs v CNAR podľa možného prekrývajúce frekvenciu. MCR amplifikácie a delécie bola analyzovaná. Amplifikácia a delécie bol definovaný pri normalizovaný pomer log2 bol ≥0.8 a ≤-0,8, v danom poradí. Všetky štatistické metódy a vizualizácie jednotlivých aberantne regiónov boli vykonávané za použitia R štatistického jazyka v.3.0.2 (www.r-project.org).}

Multiplex Väzba závislá Probe Amplification (MLPA) Analýza

MLPA analýza bola vykonaná s použitím SALSA MLPA kit P200 (MRC-Holland, Amsterdam, Netherlands) podľa inštrukcií výrobcu [52]. Notebook P200 Sada obsahuje 14 kontrolnej sondy vnútorný cieľom posúdiť DNA denaturáciu a množstvo DNA, ale aj pre X a Y chromozómu. DNA vzorky boli nariedia na 5 ul TE a bola zahrievaná na teplotu 98 ° C po dobu 5 minút v PCR skúmaviek v termocykléri s vyhrievaným vekom. Po pridaní 1,5 ul MLPA pufra a 1,5 ul zmesi sondy, vzorky boli ďalej zahrieva po dobu 1 min pri 95 ° C a potom sa 16 hodín inkubuje pri 60 ° C. Sekvencia sondy pre odhalených génov sú uvedené v tabuľke H v S1 súbore. Ligácia žíhaných oligonukleotidov bola vykonaná zriedením vzoriek na 40 ul s riediacim pufrom, ktorý obsahuje 1 U Ligase-65 enzýmu a inkubáciou počas 15 minút pri teplote 54 ° C. Ligázu bol enzým inaktivovaný zahriatím na 98 ° C počas 5 min a Produkty ligácia boli amplifikovanej pomocou PCR. Pri teplote 60 ° C, bolo pridané 10 ul pufrovaného roztoku, ktorý obsahuje PCR priméry, dNTP a Salsa polymerázy (MRC-Holland, Amsterdam, Holandsko). PCR bola vykonávaná po dobu 35 cyklov (30 s pri 95 ° C, 30 s pri 60 ° C a 1 min pri 72 ° C). V MLPA PCR reakcie boli oddelené pomocou elektroforézy systému kapilárnej ABI-Prism 3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA) a dáta boli analyzujú za použitia GeneMaker 2.0.0 (SoftGenetics, State College, PA).

• Ploche ONE: Významná Asociácie Interleukin4 IntronA 3 VNTR polymorfizmus s náchylnosťou k rakoviny žalúdka v Južnej indickej populácie z Telangana
• Ploche ONE: proapoptotický Vplyv HIF-1α inhibícia kombinovaná s glukózou a navyše liečbu inzulínom o rakoviny žalúdka za hypoxických podmienok