PLoS ONE: Nombre Copy gains à 8q24 et 20q11-q13 dans le cancer gastrique sont plus fréquentes dans Intestinal-Type que Diffuse-Type

Résumé

La présente étude visait à découvrir des altérations du nombre de copies d'ADN (CNA) impliqués dans la carcinogenèse de l'estomac et à comprendre leurs significations clinicopathologiques dans la population coréenne. le nombre de copies d'ADN ont été analysées à l'aide Agilent 244K ou 400K réseau hybridation génomique comparative (aCGH) dans la tumeur frais congelé et les tissus normaux appariés de 40 patients atteints de cancer gastrique. Certaines régions de l'AIIC détectés ont été validés en utilisant la sonde d'amplification multiplex de ligature dépendant (MLPA) dans six des 40 patients et personnalisés Agilent 60K aCGH dans un ensemble indépendant de 48 cancers gastriques. Les taux d'ARNm de gènes dans des régions communes CNA ont été analysées en utilisant une PCR quantitative en temps réel. du nombre de copies gains étaient plus fréquents que les pertes sur l'ensemble du génome dans les tissus tumoraux par rapport aux tissus normaux appariés. Le nombre moyen de modifications par cas était de 64 pour les gains et 40 pour les pertes, et la durée médiane de l'aberration est 44016 pb pour les gains et 4732 pb pour pertes. du nombre de copies gains ont été fréquemment détectés à 7p22.1 (20%), 8q24.21 (27% -30%), 8q24.3 (22% -48%), 13q34 (20% -31%), et 20q11-q13 (25% -30%) et les pertes à 3p14.2 (43%), 4q35.2 (27%), 6q26 (23%) et 17p13.3 (20% -23%). CNAs à 7p22.1, 13q34 et 17p13.3 ont pas été signalés dans d'autres populations. La plupart des pertes de copies numériques ont été associés à une régulation négative des niveaux d'ARNm, mais la corrélation entre la copie des gains en nombre et le niveau d'expression d'ARNm varier d'une manière dépendante du gène. En outre, nombre de copies gains ont tendance à se produire plus fréquemment dans les cancers de type intestinal que dans les cancers de type diffus. En conclusion, la présente étude suggère que le nombre de copies des gains à 8q24 et 20q11-q13 et les pertes à 3p14.2 peuvent être des événements communs dans le cancer gastrique, mais CNAs à 7p22.1, 13q34 et 17p13.3 peut être coréenne spécifique.

Citation: Jin DH, Parc SE, Lee J, Kim KM, Kim S, Kim DH, et al. (2015) Nombre de copie gains à 8q24 et 20q11-q13 dans le cancer gastrique sont plus fréquents dans Intestinal-Type que Diffuse-Type. PLoS ONE 10 (9): e0137657. doi: 10.1371 /journal.pone.0137657

Editeur: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPON

Reçu: 8 Mars 2015; Accepté le 19 Août 2015; Publié: 11 Septembre 2015

Droit d'auteur: © 2015 Jin et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et. Les données aCGH-244k et aCGH-400K peuvent être téléchargés à partir de Gene Expression Omnibus portail du NCBI. (Www.ncbi.nlm.nih.gov/geo, numéro d'accession: GSE69318 et GSE69266, respectivement)

Financement: Ce travail a été soutenu par des subventions du national R & D Programme de lutte contre le cancer, le Ministère de la santé et du bien-être (p0270) et de l'Institut coréen de l'industrie de la santé pour le développement (KHIDI), financé par le ministère de la Santé & Bien-être (HI14C1979), République de Corée

Intérêts concurrents:. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Le cancer gastrique Introduction est la troisième principale cause de cancer. décès dans le monde. En dépit des progrès importants dans le diagnostic et le traitement du cancer gastrique, les taux de survie à cinq ans des patients atteints de cancer de l'estomac restent en dessous de 30% dans la plupart des pays [1]. En outre, environ la moitié des patients qui subissent une résection chirurgicale curative encore développer des métastases loco-régionales ou à distance, en dépit de l'approche thérapeutique multi-modalité et mourir de la maladie [2,3]. Bien que la plupart des cancers gastriques présentent des caractéristiques cliniques similaires, il existe une hétérogénéité considérable dans son histopathologie et les changements moléculaires associés [4]. Par conséquent, il est important d'identifier des biomarqueurs moléculaires impliqués dans la carcinogenèse du cancer gastrique pour la détection précoce et le traitement de la maladie ciblée.

ADN nombre de copies de modification (CNA) définis comme des segments d'ADN 1 kb ou plus grandes en taille, est un type important de l'altération génétique observée dans les cellules cancéreuses [5]. CNAs peut influencer l'expression génique, la variation phénotypique et de l'adaptation en perturbant les régions régulatrices de l'ADN proximale ou à distance, ou en modifiant les niveaux de dosage génique [6,7]. En outre, la répartition du nombre de copies est significativement différente dans les populations ancestrales distinctes, ce qui peut entraîner une sensibilité différente aux maladies à travers les groupes ancestraux [8]. modifications Récemment, plusieurs groupes ont analysé l'ADN de nombre de copies dans le cancer gastrique en utilisant hybridation génomique comparative (aCGH) et ont identifié de nouveaux gènes importants dans la pathogenèse du cancer gastrique [9-14]. Par exemple, Tsukamoto et al. [10] ont étudié CNAs dans 30 cas de cancer de l'estomac en utilisant BAC ou des clones PAC, et identifié les régions les plus fréquentes de l'ADN nombre de copies gains en 20q13, 20q11, 8q24 et 20p12, et ceux des pertes en 4q34-qter, 5q12, 18q21 et 3p14. Fan et al. [11] détecté CNAs dans 64 tissus de cancer gastrique et 8 gastriques lignées cellulaires du cancer à l'aide de clones BAC, et a observé que 20q12-20q13 et 9p21 étaient les régions les plus fréquemment amplifiés et supprimés, respectivement. En outre, Cheng et al. [12] ont étudié CNAs dans 27 cancers gastriques par aCGH-244K et identifié 8p11-q24, 20q11-q13 et 7q21-q22 comme les régions les plus acquises et 4q34, 6p25, 18q12 et 18q22 comme les régions les plus perdues. Dans ces études antérieures, divers microarrays (BAC ou PAC clone, oligo) ont été appliquées pour enquêter sur CNAs dans le cancer gastrique, et les régions de l'AIIC rapportés étaient différentes pour les différentes populations étudiées.

Pour identifier CNAs important dans la pathogenèse du cancer gastrique dans la population coréenne, nous avons d'abord effectué une analyse du génome entier du nombre de copies d'ADN en utilisant aCGH-244K ou aCGH-400K dans 40 cancers gastriques puis validé les CNAs détectés en utilisant un aCGH-60K personnalisé dans un autre ensemble de 48 gastrique cancers. Les effets de CNAs sur l'expression des gènes ont été analysés dans certains des gènes avec CNAs.

Résultats

Découverte de CNAs impliqués dans la carcinogenèse de l'estomac

Pour découvrir CNAs impliqué dans la carcinogenèse de l'estomac, tumeur et les tissus normaux appariés à partir de 40 patients atteints d'un cancer de l'estomac ont été analysées à l'aide matrice hybridation génomique comparative (aCGH); 30 cas par aCGH-400K et 10 cas par aCGH-244K. CNAs ont été détectés sur l'ensemble du génome, et les gains en nombre de copies étaient plus fréquentes que les pertes du nombre de copies (figure 1A). Le nombre de CNAs était très différente entre les individus. Le nombre moyen de CNAs par cas était de 64 pour les gains et 40 pour les pertes (figure 1B), et la durée médiane de la région de l'AIIC a 44016 pb pour les gains et 4732 pb pour les pertes (figure 1C). Les CNAs communs ont été détectés en utilisant un algorithme de contexte corrigée avec un seuil de valeur p de 0,05 et le seuil de chevauchement de 0,9 (figure 1D). Les gains du nombre de copies ont été fréquemment détectés sur les régions chromosomiques 7p22.1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34 et 20q11-q13, et copier des pertes numériques ont été fréquemment observées sur 3p14.2, 6q26, 7q36.3, 13q34 et 18q23 . Les pertes ont été largement détectées aux extrémités des chromosomes, et la taille est relativement petite. Le CNAs étaient moins fréquentes sur les chromosomes 2 et 15. Les longueurs d'aberration communes avec une valeur p faible principalement relevait de 1 kb-10 kb (Fig 1E). aberrations communes autour de MYC
gène à 8q24.21 sont indiqués sur la figure 1F. Les données aCGH-244k et aCGH-400K peuvent être téléchargés à partir de Gene Expression Omnibus portail du NCBI (de www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). (Numéro d'accession: GSE69318 et GSE69266, respectivement)

Validation des ACGHS par MLPA analyse

Certains déséquilibres génomiques détectés par le aCGH ont été validées en utilisant multiplex sonde d'amplification par PCR ligature-dépendante (MLPA). Six des échantillons de tissus 40 analysés à l'aide aCGH étaient disponibles pour MLPA. numéro de la copie des modifications de MYC
(8q24.21), FHIT
(3p14.2), WDR60
(7q36.3), COL4A2
(13q34), NFATc1
(18q23), et NCOA3
(20q12) ont été analysées dans six tumeur appariés et des paires normales de tissus (268-1, 271-1, 272-2, 301 -1, 685-1 et 685-2). MYC
a été amplifié en 271-1T et 301-1T (figure 2A), NCOA3
a été acquise dans 301-1T et 685-2T (figure 2B), et FHIT
a été supprimé dans 271-1T, 301-1T et 685-1T (figure 2A). Ces résultats ont été très cohérents avec ceux détectés par aCGH. Cependant, les pertes de gènes tels que du nombre de copies (figure 2C)
WDR60, NFATc1
(figure 2D), et COL4A2
(figure 2E), qui ont été trouvés être perdu dans aCGH, ne sont pas détectés dans le MLPA. La longueur de la région de deletion dans le gène WDR60
détecté par aCGH était 2907 pb, et COL4A2
et NFATc1
étaient 1903 pb et 2596 pb, respectivement. Sur la base de ces observations, il est probable que les aberrations couvrant les petites régions observées par aCGH peuvent être faux.

validation supplémentaire des régions de l'AIIC par aCGH-60K

Pour valider et affiner les régions de l'AIIC de récidive (> 20%) des gains ou des pertes observées par aCGH dans les 40 échantillons nombre de copies, nous avons encore analysé leurs aberrations dans la tumeur et les tissus normaux appariés à partir de 48 autres patients atteints de cancer gastrique en utilisant une mesure aCGH-60K. Les régions de l'AIIC à 8q24, 20q11-q13, 3p14.2 et 18q23 ont montré des altérations coïncidents du nombre de copies dans le aCGH-60K, mais CNAs dans d'autres régions, comme 20p13-20p12 et 20q21.2, n'a pas montré les mêmes motifs comme dans le 244K et 400K, suggérant ainsi des résultats hétérogènes entre les plates-formes aCGH. Pour trouver des régions communes minimales (MCR) du nombre de copies des modifications entre les trois plates-formes, nous chevauchaient les régions de l'AIIC dans un total de 88 échantillons. La RCM du récurrent (> 20%) du nombre de copies des gains ont été détectés dans plusieurs régions chromosomiques incluant 7p22.1 (20%), 7q22.1 (31% ~ 44%), 8q24.21 (27% ~ 30%), 8q24.3 (22% ~ 48%), 13q34 (20% ~ 31%) et 20q11 ~ q13 (25% ~ 30%) (tableau 1 et le tableau A dans le fichier S1). Le MCR de récidive (> 20%) copie des pertes numériques ont également été trouvés dans sept régions chromosomiques, y compris 3p14.2 (43%) hébergeant FHIT
(tableau 1 et le tableau B en S1 Fichier)

association Gene-dépendante entre les niveaux d'ARNm et de CNAs

Pour étudier l'effet de CNAs sur l'expression des gènes, nous avons mesuré les niveaux d'ARNm de gènes multiples ( MYC
, SCRIB
, PUF60
, BOP1
, SNTA1
, E2F1
, CD40
, eya2
, NCOA3
, FHIT
, CRK
et SMAD2
) au niveau des régions d'aberration communes dans 48 tumeur et les tissus normaux appariés et analysé l'association avec le CNA. L'effet de CNAs sur l'expression du gène a été analysée en comparant le changement d'ARNm de pliage (CF) dans les cancers avec et sans CNAs. La corrélation entre la copie des modifications numériques et l'expression du gène correspondant a été différent selon les copier gains ou pertes numériques. La majorité des gènes avec des pertes du nombre de copies d'ARNm a montré une régulation négative: le niveau d'ARNm a été downregulated dans le FHIT
(tableau 2 et figure 3A), CRK
et SMAD2
gènes (voir le tableau 2). Cependant, nous avons trouvé la corrélation entre les gains du nombre de copies et la régulation positive de taux d'ARNm était spécifique du gène: les niveaux d'ARNm dans des gènes tels que MYC
, PUF60
, BOP1
(figure 3B), et E2F1
ont été positivement associée à des gains de nombre de copies. Cependant, aucune association n'a été trouvée entre les niveaux d'ARNm et de copier des gains de gènes tels que numéro SCRIB
, BCL2L1
, SNTA1
, CD40
, eya2
et (Table 2) de NCOA3 suggérant que la relation entre les gains du nombre de copies et l'expression peut être spécifique d'un gène.

Association des CNAs avec des caractéristiques clinico

L'association entre la copie des modifications numériques et les variables clinicopathologiques a été analysé chez 88 patients atteints de cancer gastrique. Quinze gènes récurrent (> 20%) du nombre de copies des modifications ont été sélectionnées pour l'analyse. pertes de numéro de copie CRK
( P
= 0,07), SMAD2
( P
= 0,09), FHIT
( P
= 0,68), et NFATc1
( P
= 0,11) gènes ne varient pas significativement entre les cancers de type diffus et les cancers de type intestinal (figure 3C). Cependant, nombre de copies gains ont tendance à se produire à une prévalence élevée dans les cancers de type intestinal que dans les cancers de type diffus (Fig 3D et 3E, le tableau C dans S1 fichier). Pour SCRIB
( P
= 0,36), PUF60
( P
= 0,07), MAPK15
( P
= 0,08), E2F1
( P
= 0,14), SNTA1
( P
= 0,15), BCL2L1
( P
= 0,15), NCOA3
( P
= 0,22), et eya2
( P
= 0,06), du nombre de copies gains se sont produits à une forte prévalence dans les cancers de type intestinal que dans les cancers de type diffus, mais la différence n'a pas été statistiquement significative. gains de numéro de copie MYC
( P
= 0,03), BOP1
( P
= 0,03), et CD40
( P
= 0,01) ont été trouvés à une prévalence significativement élevée dans les cancers de type intestinal par rapport à diffuser de type cancers. Pour détecter CNAs liée à l'âge, nous avons analysé la corrélation entre l'âge du patient et la copie changement de numéro à l'aide des coefficients de corrélation de Pearson, mais trouvé aucune corrélation n'a été trouvée entre le changement du nombre de copies de 15 gènes et l'âge du patient (figure 4A). analyse de classification hiérarchique a été réalisée afin de patients du groupe avec similaire CNAs. La plupart des patients avec nombre de copies gains à 8q24 avaient aussi du nombre de copies des gains au 20q11.21 ou 20q13.12 (figure 4B). Les données ont été divisées en 4 clusters en fonction de la présence du nombre de copies des gains en 20q11.21 8q24 et (ou 20q13.12). du nombre de copies des gains à 8q24 était significativement associée à nombre de copies gains à 20q11.21 ou 20q13.12 ( P
= 0,005, test exact de Fisher, le tableau D dans S1 fichier). Ces observations suggèrent que les deux régions, 8q24 et 20q11.21 (ou 20q13.12), peuvent être tout aussi sensibles à copier les gains en nombre dans le cancer gastrique.

Discussion

Le changement de dosage génique par l'AIIC est de plus en plus reconnue comme un élément important de la tumorigenèse. Pour découvrir roman CNAs impliqué dans la pathogenèse du cancer gastrique, nous avons effectué une analyse du génome entier de CNAs dans la tumeur et apparié les tissus normaux à partir de 88 patients atteints de cancer gastrique et identifié récurrent (> 20%) copier gains numériques à de multiples régions chromosomiques dont 7p22 .1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34, 20q11 ~ q13 et a des pertes récurrentes à 3p14.2, 4q35.2, 6q26 et 17p13.3. Le CNA à 7p22.1, 13q34 et 17p13.3 ont pas été signalés dans d'autres populations. Les 7p22.1 régions identifiées dans la présente étude contiennent les gènes FBXL18, ACTB, ACTG1 et RNF216. Bien que CNAs à 7p22.1 n'a été signalé dans le cancer gastrique, plusieurs études ont rapporté leur impact sur le développement de l'ovaire adénocarcinome à cellules claires [15] et l'endométriose [16]. Dans cette étude, le nombre de copies des altérations de MYC
(8q24.21), FHIT
(3p14.2), et NCOA3
(20q12) ont été validés en utilisant MLPA, mais copier les pertes numériques ( WDR60
, COL4A2, NFATc1
) d'environ 2000bp n'a pas été validé par MLPA. Nous avons échoué pour effectuer une vaste estimation de calcul des taux de faux positifs de vocation basée sur la baie. Au lieu de cela, nous avons comparé la prévalence des pertes du nombre de copies entre aCGH-244k & -400K Et aCGH-60K avec des sondes très denses selon les tailles de copie des pertes numériques: 1kb-5 Ko, 5kb-10KB, 10kb-50kb, 50kb-100kb et 100k-. Des différences statistiquement significatives ont été trouvés seulement dans les pertes de petite taille (1kb-de 5kb) (Tableau E dans S1 Fichier) nombre de copies. En outre, des différences significatives ont été observées dans les chromosomes de manière spécifique au locus: aucune différence n'a été observée dans les chromosomes 3, 6, 16, 17 et 20 (données non présentées). Par conséquent, il est possible que la copie des pertes de petite taille détectée dans aCGH-244K et aCGH-400K nombre peut être faux dans certains loci.

Nous en outre analysé les régions communes minimales de récidive (≥10%) l'amplification ou la suppression dans 88 cancers gastriques (Tableau F dans S1 fichier) et les a comparés avec le grand cancer gastrique TCGA (le cancer Genome Atlas) d'étude (14) et trois études précédentes (tableau G dans S1 fichier). L'étude TCGA était composé de 295 adénocarcinomes gastriques primaires et identifié 30 amplifications focaux et 45 suppressions focales. Amplification (≥ 5 copies) à 8q24.21 ( MYC
), 17q12 ( ERBB2
etc.), 20q11.1-q13.33 (eya2
, NCOA3
etc.), et la suppression (0 copies) à 3p14.2 ( FHIT
) ont été observées dans nos données, ainsi que les données de la TCGA et les études des autres (Tableau G File S1). Cependant, CNAs à 7p22.1, 13q34 et 17p13.3 n'a pas été rapporté dans l'étude TCGA et d'autres populations. Le nombre des régions du CNA identifiés dans l'étude TCGA était plus grande que la présente étude, ce qui pourrait résulter des différents sous-groupes de membres de l'échantillon. L'étude se compose de TCGA-type intestinal plus importante (66,4%) par rapport à diffuser de type cancers (23,4%).

Parmi les gènes situés sur 8q24.21, MYC est connu pour favoriser la croissance et la prolifération de la normale des cellules gastriques et knockdown de MYC
restreint la croissance et la prolifération de cellules de cancer gastrique [17]. MYC
code pour un facteur de transcription qui régule une variété de gènes liés à la prolifération, la différenciation et l'apoptose [18].
MYC est amplifié et surexprimé dans le cancer gastrique [19], et son expression augmente progressivement à mesure que le développement du cancer [20]. MYC
amplification est associée au comportement agressif des cellules de cancer gastrique [21,22]. Dans cette étude, la copie des gains de numéro MYC
ont été trouvés à une prévalence élevée dans les cancers de type intestinal par rapport aux cancers de type diffus, en soutenant l'observation que l'expression de la protéine MYC est plus fréquemment observée dans intestinal- tapez tumeurs que dans les tumeurs de type diffus [23]. Nous avons analysé l'effet de MYC
CNAs sur la survie globale dans chaque type. Les patients atteints du nombre de copies des gains de MYC
avaient la survie globale médiocre par rapport à ceux sans, mais la différence n'a pas été statistiquement significative de type diffus et les cancers de type intestinal (S1 Fig). Les gains du nombre de copies de la POU5F1B
(POU de classe de domaine 5 facteur de transcription 1B) pseudogène sur 8q24.21 ont été trouvés dans 27% des échantillons analysés. POU5F1B
est connu pour être associé à l'abondance de l'ARNm et un phénotype agressif dans le cancer gastrique [24].

Les régions 8q24.3 et 20q11-q13 contiennent des centaines de gènes (tableau A en S1 fichier), mais beaucoup sont probablement impliqués dans l'oncogenèse. Parmi les gènes situés dans ces régions, nous avons analysé les taux d'ARNm de SCRIB
, PUF60
et BOP1
à 8q24.3 et SNTA1
, E2F1
, CD40
, eya2
et NCOA3
à 20q11-q13 (tableau 2). Dans la présente étude, copier gains de SCRIB
, SNTA1
, CD40
, eya2
et NCOA3
était numéro pas associé à un facteur de variation des taux d'ARNm. Cependant, le PUF60
, BOP1
et Les gènes E2F1 de se sont avérés significativement surexprimé dans les tissus tumoraux avec des gains de nombre de copies. PUF60
était surexprimée dans les cancers avec CNAs ( P
= 0,038), mais son expression était pas significativement différente entre les tissus tumoraux et les tissus normaux appariés dans les échantillons sans CNAs ( P
= 0,111). PUF60 (poly-U de liaison du facteur de raccordement 60 kDa), une protéine interagissant répresseur FUSE de liaison (FIR), joue un rôle dans les processus nucléaires, tels que l'ARNm de pré-épissage et de régulation de la transcription. En outre, supprime de PUF60 MYC
transcription au niveau du promoteur P2 à travers la base du facteur de transcription de base-TFIIH [25]. Récemment, Gumireddy et al. [26] ont rapporté que PUF60 est nécessaire pour la fonction de régulation de IncRNA de régulation traductionnelle (treRNA), qui est impliquée dans l'invasion tumorale et les métastases. du nombre de copies des gains de PUF60
montrent une forte corrélation positive avec l'expression dans le cancer gastrique [27] et dans le cancer de l'ovaire [28]. Ces observations suggèrent que le nombre de copies des gains de PUF60
peut être un important mécanisme qui sous-tend la surexpression du gène dans le cancer gastrique.

Contrairement à PUF60, l'BOP1 et E2F1 ont été jugées être surexprimé dans les tissus tumoraux avec nombre de copies gains ainsi que dans les autres. du nombre de copies des gains de BOP1
et E2F1
dans cette étude se sont produits dans 23% et 25% des échantillons étudiés, respectivement. ARNm Augmentation replient changement de BOP1
était significatif dans les tissus tumoraux avec des gains de nombre de copies ( P
= 0,024), ainsi que chez ceux sans ( P
< 0,001) . BOP1 (bloc de multiplication 1) est un composant du complexe PeBoW (PES1, BOP1 et WDR12), qui est nécessaire pour la maturation de 28S et 5,8 S ARN ribosomaux et la formation des ribosomes 60S [29]. BOP1 joue un rôle oncogène dans le carcinome hépatocellulaire en induisant la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) et la promotion de l'actine cytosquelette remodelage [30]. Le gène BOP1 de est connu pour être surexprimé dans le cancer du rectum avec un gain de 8q [31], et l'augmentation de la posologie du gène BOP1 de est associée à une augmentation de BOP1
ARNm dans le cancer colorectal [32]. Le E2F1 a également été surexprimé dans les tissus tumoraux avec des gains de nombre de copies ( P
< 0,001) et chez ceux sans ( P
= 0,03). E2F1 joue un rôle crucial dans le contrôle du cycle cellulaire et l'activité est régulée par la liaison à la protéine de rétinoblastome d'une manière cycle cellulaire dépendante. Surexpression de E2F1 est associée au développement d'une variété de tumeurs, et l'augmentation du nombre de copies E2F1
est connue pour être associée à la surexpression du gène dans le mélanome [33] et le cancer du col de l'utérus [ ,,,0],34]. Sur la base de ces observations, il est probable que l'impact global des gains en nombre de copies sur l'expression des gènes dans le cancer gastrique varie d'une manière génique dépendante.

Bien que les gains en nombre de copies à 13q34 ont pas été signalés dans le cancer gastrique, le Les gains ont été trouvés dans 20-30% des échantillons étudiés. du nombre de copies des gains à 13q34 sont connus pour être associés à la progression de la néoplasie intraépithéliale cervicale à un carcinome épidermoïde [35] et l'intestin grêle adénocarcinome [36]. du nombre de copies des gains à 17q12 sont fréquents dans le cancer gastrique. Dans la présente étude, plusieurs gènes, y compris ERBB2
, GRB7
, STARD3
, PPP1R1B
, RARA
et C17orf37, ont été amplifiés dans 15-20% des 88 cas, en accord avec d'autres études [37,38]. On n'a pas évalué la corrélation du nombre de copies et l'expression des gènes niveaux, mais plusieurs groupes ont rapporté que les gènes jouent un rôle important dans le développement du cancer gastrique. Parmi eux, ERBB2 (HER2)
est souvent amplifié et surexprimé dans les cancers gastriques [39-41], et l'amplification de HER2
était fortement associée à une faible survie, en particulier dans le intestinal type de cancer gastrique [42]. Immunoréactivité de ERBB2 se produit également à un taux de prévalence plus élevé dans le type intestinal que dans les sous-types diffuses [43]. En outre, le fusion transcription
PPP1R1B-STARD3 dans le cancer gastrique humain augmente la formation de colonies par l'activation de phosphatidylinosil-3-kinase et AKT signalisation [44]. amplification fréquente de GRB7
et des changements positifs dans l'expression ont également été signalés dans le cancer gastrique [41,43].

Les pertes les plus fréquentes dans cette étude ont été détectées sur 3p14.2 (39% en diffus types et 37% des types intestinaux), où FHIT
est situé. FHIT
est un gène suppresseur de tumeur bien connue [45], et est souvent impliqué dans la perte d'hétérozygotie (LOH) et des suppressions dans les tumeurs humaines [46]. carcinomes gastriques primaires représentent un réarrangement de la FHIT
gène et 20 de 30 (67%) des échantillons présentait une absence de protéine expression de FHIT [47]. Perte de protéine expression de FHIT est en corrélation avec la progression de la maladie et une mauvaise différenciation dans le cancer gastrique [48]. Dans la présente étude, nous avons observé que FHIT de l'expression a été réduite dans les cancers gastriques, avec ou sans son CNA, ce qui suggère que le dosage du gène, ainsi que d'autres mécanismes régulent FHIT
expression dans le cancer gastrique. Une mutation faux-sens somatiques (exon 6, codon 61, ACG → ATG) de
FHIT a également été identifié dans les cancers gastriques [49]. En outre, une fréquence élevée de promoteur hypermethylation de FHIT
(62%) est observée dans les cancers gastriques [50]. Par conséquent, l'intégration des données de nombre de copies des données génomiques supplémentaires est essentielle pour comprendre globalement le contrôle génétique de l'expression des gènes [51].

du nombre de copies des pertes de plusieurs gènes dans cette étude ne sont pas significativement différents entre les cancers de type diffus et les cancers de type intestinal. Cependant, la prévalence du nombre de copies des gains était différent entre les deux types dans certains gènes, ce qui suggère que des facteurs environnementaux peuvent avoir plus d'influence dans le nombre de copies de gains que les pertes. En outre, les patients atteints du nombre de copies gains sur 8q24.21 et 8q24.3 ont tendance à avoir des gains sur 20q11-q13, suggérant les deux régions peuvent être également sensibles à copier variation du nombre. Cette étude a été sévèrement limitée en raison du faible nombre d'échantillons et le manque de données de survie. D'autres études dans une grande cohorte est nécessaire pour comprendre la signification fonctionnelle de CNAs découvert dans cette étude. En outre, les mesures d'ARNm ne sont pas réalisées au niveau du génome. Nous avons analysé la relation entre les niveaux d'ARNm de certains gènes connus pour être importants dans la pathogenèse du cancer chez l'homme et le CNA. Une corrélation significative a été trouvée entre les niveaux d'expression MYC
, PUF60
, BOP1
et Les gènes E2F1 de et leur CNAs (tableau 2) . Une corrélation statistiquement significative entre CNAs de MYC
, PUF60
et Les gènes E2F1 de et leurs niveaux d'expression a également été constaté par Fan et al. (11). Cependant, une étude plus approfondie est nécessaire pour comprendre clairement l'effet de CNAs sur l'expression génique. En conclusion, la présente étude suggère que le nombre de copies d'ADN gagne à 8q24.21, 8q24.3, 20q11-20q13 et les pertes à 3p14.2 peut être des événements communs dans le cancer gastrique. Cependant, CNAs à 7p22.1, 13q34 et 17p13.3 peut être coréenne spécifique. En outre, la copie des gains numériques peuvent être plus fréquents dans le type intestinal que le cancer gastrique de type diffus.

Matériel et méthodes

Population étudiée et extraction de l'ADN

Un total de 88 patients, 35 femmes et 53 hommes, qui avaient subi une exérèse chirurgicale pour le cancer gastrique entre Novembre 2004 et Octobre 2010 au Département de chirurgie dans le centre médical Samsung, Séoul, Corée, ont participé à cette étude. les tissus tumoraux enlevés chirurgicalement ont été recueillies après l'obtention du consentement éclairé de tous les patients. Cette étude a été approuvée par le Medical Center Samsung Conseil d'examen (SMC) Institutionnel (IRB). Les tumeurs ont été soumis à une congélation dans l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation. Avant l'extraction d'ADN à partir des tissus frais congelés, les sections ont été placées sur des lames et colorées avec H & E pour évaluer le mélange des tissus tumoraux et non tumorales. les zones tumorales et non tumorales ont été microdisséquées avec soin sous un microscope. Les tissus ont été digérés par microdissection avec la proteinase K et l'ADN génomique a été isolé selon les instructions du fabricant (kit DNeasy Tissue, Qiagen, Valencia, CA). L'échantillon se composait de 43 cancers de type diffus, 41 intestinal de type, et 4 cancers de type mixte.

Analyse CNA utilisant aCGH

Le aCGH a été effectuée selon les recommandations du fabricant. Après l'hybridation de l'ADN et le lavage, les lames ont été analysés immédiatement à l'aide d'un scanner de puces à ADN Agilent, et des données brutes ont été extraites à l'aide du logiciel d'extraction d'entité aux paramètres par défaut des paramètres CGH (Agilent Technologies). intervalles putative de l'AIIC dans chaque échantillon ont été identifiés en utilisant un logiciel de v7.0.4.0 Agilent Genomic Workbench. Cy5 ratios /Cy3 ont été converties en valeurs log _{2 transformées. Centralisation et floue zéro corrections ont été appliquées à la puce. La méthode de détection Aberration 2 (ADM-2) algorithme au seuil de 6,0 a été utilisé pour identifier le CNA dans des échantillons individuels et de déterminer les fréquences d'aberrations dans les échantillons de cancer gastrique (Fig 5). Les filtres suivants ont été utilisés: nombre minimum de sondes dans la région > = 3, minimum rapport logarithmique moyenne absolue de la région > = 0,25. aberrations ordinaires ont été détectés en utilisant l'algorithme de contexte corrigé à la p-valeur < 0,05 et un seuil de recouvrement de 0,9. Le CNAR (Copy Number Altération Région) a été défini comme l'union de plus de 90 pour cent de chevauchement des segments aberrants sur plusieurs échantillons. L'ensemble du génome UCSC hg19 a été utilisé comme séquence du génome humain de référence. Pour chaque plate-forme (244K, 400K et 60K), la méthode de normalisation de Lowess globale dans tableau a été appliqué pour corriger le biais spatiale locale et gradients spatiaux continus. Après la normalisation au sein de tableau, un quantile entre matrice de normalisation a été appliqué pour comparer les résultats d'aberration à travers des tableaux. Ces normalisations ont été effectuées en utilisant le paquet limma R. Le MCR (Minimal Région commune) a été définie comme 100 pour cent chevauchement région commune entre les échantillons dans la CNAR. Il y a plusieurs MCR dans le CNAR en fonction de la fréquence possible chevauchement. Le MCR d'amplification et de suppression a été analysée. Amplification et de suppression a été définie lorsque le rapport log2 normalisé était ≥0.8 et ≤-0,8, respectivement. Toutes les méthodes statistiques et la visualisation des régions aberrantes individuelles ont été effectuées en utilisant v.3.0.2 R statistique du langage (www.r-project.org).}

Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) Analyse

MLPA a été réalisée en utilisant le kit SALSA MLPA P200 (MRC-Holland, Amsterdam, Pays-Bas) selon les instructions du fabricant [52]. Le kit contient 14 P200 sondes de contrôle interne afin de déterminer la dénaturation de l'ADN et de la quantité d'ADN, et également pour le chromosome X et Y. les échantillons d'ADN ont été dilués avec 5 pl de TE et on a chauffé à 98 ° C pendant 5 mn dans des tubes de PCR dans un thermocycleur avec un couvercle chauffé. Après l'addition de 1,5 pi de tampon MLPA et 1,5 pi de sonde mélange, les échantillons ont été encore chauffé pendant 1 min à 95 ° C, puis incubé pendant 16 h à 60 ° C. Les séquences de sondes pour les gènes détectés sont répertoriés dans le tableau H S1 Fichier. Ligation d'oligonucléotides hybridées a été réalisée en diluant les échantillons à 40 ul avec un tampon de dilution contenant 1 U-65 Ligase enzyme, et incubation pendant 15 min à 54 ° C. L'enzyme ligase a été inactivée par chauffage à 98 ° C pendant 5 minutes et on ligature les produits ont été amplifiés par PCR. Alors à 60 ° C, 10 ul d'une solution tamponnée contenant la PCR amorces, dNTPs et SALSA polymérase (MRC-Holland, Amsterdam, Pays-Bas) ont été ajoutés. La PCR a été réalisée pendant 35 cycles (30 s à 95 ° C, 30 s à 60 ° C et 1 min à 72 ° C). Les réactions MLPA PCR ont été séparés en utilisant le système d'électrophorèse capillaire, ABI-Prism 3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA), et les données ont été analysées à l'aide d'un GeneMaker 2.0.0 (SoftGenetics, State College, PA).

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