PLoS ONE: Tällä MicroRNA-217 toiminnot mahdollisena Kasvain vaimennin mahasyövän by Targeting GPC5

tiivistelmä

Mahasyöpää (GC) on yksi yleisimmistä syöpäsairauksia maailmanlaajuisesti. Kehittyvät näyttö on osoittanut, että poikkeava ilmentyminen MikroRNA (miRNA) näyttelee tärkeä rooli syövän etenemiseen. Kuitenkin tiedetään vähän mahdollisesta roolista miR-217 GC. Tässä tutkimuksessa selvitimme rooli miR-217 GC soluproliferaatioon ja invaasiota. Ilmaisu Mir-217 oli säädellä vähentävästi GC soluissa ja ihmisen GC kudoksiin. Pakotettu ilmentymä miR-217 esti GC solujen lisääntymistä ja invaasiota. Lisäksi Glypikaani-5 (GPC5), uusi ocncogene, tunnistettiin mahdolliset kohteena miR-217. Lisäksi yli-ilmentyminen miR-217 heikentynyt GPC5 aiheuttaman edistäminen leviämisen ja invaasion GC soluissa. Johtopäätöksenä nämä havainnot paljastivat, että miR-217 toimi tuumorisuppressorina ja inhiboivat ja invaasio GC-solujen kohdistamalla GPC5, joka saattaa näin ollen toimia terapeuttisena kohteena GC potilaille.

Citation: Wang H Dong X, Gu X, Qin R, Jia H, Gao J (2015) MicroRNA-217 toiminnot mahdollisena Kasvain vaimennin mahasyövän mukaan Targeting GPC5. PLoS ONE 10 (6): e0125474. doi: 10,1371 /journal.pone.0125474

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 10 lokakuu 2014; Hyväksytty: 24 maaliskuu 2015; Julkaistu: 22 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on neljänneksi yleisin ihmisen maligniteettien ja toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien ympäri maailmaa, ja arviolta miljoona uutta tapausta vuodessa [1-4]. Huolimatta viimeaikaisista edistysaskeleet diagnostisessa menetelmässä, kirurginen tekniikka ja uudet kemoterapiahoitojen, pitkän aikavälin eloonjäämisaste GC on edelleen varsin alhainen [5, 6]. Monilla potilailla, GC on diagnosoitu pitkälle edenneessä vaiheessa laajat invaasion ja imusuonten etäpesäke. Onnistuneet terapeuttiset strategiat ovat rajalliset ja kuolleisuus on korkea [7]. Siksi on kiireellisesti tutkia perustavanlaatuinen molekyylitason mekanismit lääkeresistenssin, histologiset heterogeenisyys, ja etäpesäkkeiden kehittymisessä tunnistaa uusia markkereita diagnosointiin ja hoitoon GC.

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, noin 22 -nucleotide, ei-koodaavat RNA: t, jotka toimivat negatiivisina säätelijöinä proteiinia koodaavan geenien posttranskriptionaalisella tasolla [8, 9]. Sitoutumalla komplementaaristen sekvenssien 3'-alueet (3'-UTR) niiden kohde-mRNA: iden, miRNA voi aiheuttaa suoraan mRNA: n hajoamisen tai translaation inhibition [10-13]. Lisääntyvä todistusaineisto on ilmoittanut, että miRNA ovat mukana monissa tärkeissä biologisissa prosesseissa, kuten solujen lisääntymisen, erilaistumisen, apoptoosin, angiogeneesi ja immuunivastetta. Vapauttaminen miRNA voi johtaa poikkeavaan geeniekspression erilaisia ​​sairauksia kuten mahasyövän [14-16]. Kuitenkin ymmärrystä rooli ja toiminta miRNA GC on vielä varhaisessa vaiheessa. Samoin roolit monien muiden poikkeuksellisesti ilmaistu miRNA GC kehitys ei vielä tunneta.

alassäätely miR-217 on yleinen tapahtuma erilaisiin syöpiin, mikä viittaa sen tärkeä rooli kasvainten synnyssä [17-19]. Kuitenkin tiedetään vähän mahdollisesta roolista miR-217 GC. Tässä tutkimuksessa, ekspressio miR-217 aleni GC solulinjoissa ja kudoksissa. Lisäksi pienempi ilmentyminen miR-217was liittyvät pTNM vaiheessa. Yli-ilmentymisen miR-217 tukahdutetaan GC soluinvaasiota ja lisääntymistä. Lisäksi lusiferaasireportterigeenin määritys ja western blot vahvisti, että miR-217might toimivat tuumorisuppressori GC by targetingGlypican-5 (GPC5).

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki potilaat suostuivat osallistumaan tutkimukseen ja antoi kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Tutkimus ja suostumus hyväksyi eettinen hallituksen instituutin The Affiliated Yanan sairaala Kunming Medical University ja noudatetaan Helsingin julistuksen.

kudosnäytteitä

näytteitä ihmisen GC kudosten ja pariksi -adjacent ei-kasvain mahalaukun kudokset, jotka olivat kauempana kuin 5 cm kasvaimet saatiin 50 potilasta, joille tehtiin leikkaus resektion The Affiliated Yanan Hospital Kunming Medical University. Tuoreet näytteet jäädytettiin nopeasti inliquid typen heti kirurgisen poiston jälkeen ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Kaikki näytteet saatiin potilaiden tietoisen suostumuksen ja olivat histologiset vahvistettiin värjäämällä hematoksyliinillä-eosiinilla. Histologinen arvosana syöpien arvioitiin mukaisesti asettamat kriteerit Maailman terveysjärjestön. Kukaan potilaista ei saanut sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen leikkausta. Potilaiden ominaisuudet on kuvattu S1 taulukossa.

Solulinjat ja soluviljelmä

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 ja yksi tavallinen mahalaukun epiteelisolujen linja GES-1 (kontrollina) ostettiin Institute Biokemian ja solubiologian at Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 kasvatettiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja GES-1 kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (Invitrogen). Kaikki alustat täydennettiin with10% naudan sikiön seerumia. Solulinjoja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO 2.

RNA ja qRT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin jäädytetyistä näytteistä (tai solut) käyttäen Trizol ( Invitrogen) seuraten valmistajan oppaassa. 1 ml RNA käytettiin mittaamaan ilmentymisen miR-217 kvantitatiivisen RT-PCR (qRT-PCR) kanssa TaqMan miRNA käänteistranskriptio kit andtheTaqMan miRNA määritys-spesifisiä RT-alukkeita miR-217 ohjeiden mukaan valmistajan (Applied Biosystems, Foster City, CA). Ilmentyminen U6 on käytetty sisäisenä kontrollina. Reaaliaikainen PCR suoritettiin 1 ml kutakin cDNA on Step One Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) in kaksoiskappaleet. Ilmaisu Mir-217 määriteltiin perustuen kynnyksen (Ct), ja suhteelliset ekspressiotasot laskettiin as22 ^{- [(Ct Mir-217) - (Ct of U6)] normalisoinnin jälkeen viitaten ilmaus pieni nukleaarinen U6-RNA [20, 21] (S2 taulukko).}

Western blot

Yhteensä proteiini uutettiin jäädytetyistä näytteistä (tai solut) käyttäen Total Protein Extraction Kit (KeyGen, Nanjing , Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Mittaus proteiinikonsentraatio tehtiin käyttäen BCA Protein Assay Kit (KeyGen). Western blot -analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään western blot oli kanin polyklonaalinen anti-GPC5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), hiiren monoklonaalinen anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

Cell transfektio

miR-217 matkivat, matkivat ohjaus (ryntäily), miR-217 estäjä, estäjäkontrollia Pez-GPC5 ja kontrollivektorille ostettiin RiboBio (Guangzhou, Kiina). HGC-27-soluja siirrostettiin kuusi-kuoppalevyille 30% konfluenssiin yhtä vuorokautta ennen transfektiota. Iipofectamine2000 (Invitrogen) käytettiin transfektiota varten plasmidi yksin tai yhdessä RNA-oligonukleotideja.

Lusiferaasimäärityksiä

soluja 8 x 10 ^{3 maljattiin 96-kuoppaisille levyille. Sen jälkeen, kun 24-hincubation, seos 100 ng pLUC-3'-UTR: n, 5-pmol negatiivinen kontrolli, miR-217mimic transfektoitiin 20 ng Renilla soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 Kaksikymmentäneljä hoursafter transfektion, tulikärpäsen ja Renilla lusiferaasiaktiivisuudet olivat mitataan Dual-Luciferase Reporter System (Promega, Madison, WI, USA). Transfektiotehokkuus normalisoitiin kotransfektiolla kanssa Renilla-reportterivektoria.}

Solujen lisääntyminen

Soluja (3000 /kuoppa) kerättiin ja siirrostettiin 96-wellplates ja inkuboitiin 37 ° C: ssa transfektion jälkeen. Kun oli inkuboitu 1-5 päivää, median kunkin kuoppaan lisättiin 10% Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japani), ja levyjä inkuboitiin edelleen vielä 3 tuntia 37 ° C: ssa. Sitten elatusaine korvattiin 150 ml: lla dimetyylisulfoksidia (DMSO; Sigma-Aldrich), ja absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa (Sunrise). Määritys toistettiin 3 kertaa kuusi replikaattia.

Northern blot

Kokonais-RNA eristettiin kustakin kudoksesta käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen Life Technologies), ja Northern-blottaus suoritettiin kuten edellisessä kuvattu [23] . Seuraavat Perfect Hyb Plus hybridisaatio 68 ° C: ssa, kalvot kehitettiin ja analysoitiin. Northern blotit hybridisoitiin 18S ribosomaalisen RNA: ta (rRNA) cDNA käytettiin kontrolleina.

Cell invasion

Invasion määritykset suoritettiin kolminkertaisina käyttäen TranswellTM invaasio kammiot päällystetään matrigeelin (BD, USA) kuvattu valmistajan protokollaa. Solut transfektoitiin withmiR-217 jäljittelee, estäjä eikä negatiivinen kontrolli oligonukleotidi, viljeltiin 48 tuntia, ja siirretään päälle Matrigel päällystettyjä invaasio kammiot seerumittomassa DMEM (1 x 10 ^{5 solua Transwell). DMEM, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia lisättiin alakammioissa. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, solut, jotka jäivät päälle suodattimen raaputettiin pois ja solut, jotka vaelsivat alapintaan kiinnitettiin in90% alkoholia ja tämän jälkeen kristalliviolettivärjäys.}

Histologia

Histologinen diagnoosi oli mukaan triple-site mahalaukun koepala menetelmällä. Kudokset kiinnitettiin yön yli puskuroituun formaliiniin, valettiin parafiiniin, leikattiin 3 um paksuus, ja värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla (H &E) värjäystä.

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS 17.0 tilastollinen ohjelmistopaketti. Kokeet toistettiin toisistaan ​​riippumatta vähintään kolme kertaa, ja tiedot esitetään keskiarvoja ± SD. Yhdistyksen välillä miR-217 ja GPC5 analysoitiin Spearmanin korrelaatiota testin. Vertailut ryhmien välillä tilastollisen merkitsevyyden tehtiin Studentin pariksi kaksi tailed t-testiä tai yksisuuntainen ANOVA. P < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

tulos

ilmentyminen miR-217 on vaimentua GC solulinjoissa

Ensinnäkin määrällisesti ilmentymistason miR-217 neljässä ihmisen GC solulinjoja (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) ja GES-1 käyttämällä northern blot (kuvio 1A). Ilmaisu taso miR-217 wasdecreased GC solulinjoissa verrattuna GES-1. QuantitativeRT-PCR osoitti myös, että ilmaus miR-217 aleni GC solulinjoissa (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) verrattuna GES-1, normaali mahan epiteelisolulinja (kuvio 1 B ).

miR-217 on vaimentua GC kudoksissa

kvantitatiivinen RT-PCR: ää käytettiin tutkimaan miR-217 ilmentymisen 50 GC kudosten ja niiden pariksi viereisen noncancerous kudoksiin. Edustaja histologiset ominaispiirteet GC ja sen pariksi viereisen noncancerous kudokset kuviossa 2A. Niistä 50 tuumorikudoksia, 44 tapausta ilmeni vähentynyt miR-217 ilmentymisen verrattuna viereisiin normaalien kudosten (88%, 44 50, kuvio 2B). Ilmaisu Mir-217 oli matalampi GC kudoksissa kuin viereisissä noncancerous kudoksissa (kuvio 2C). Lisäksi alhaisempi miR-217 ilmentyminen liittyy pTNM vaiheessa GC potilaista (kuvio 2D).

miR-217 inhiboi GC solujen lisääntymistä ja invaasiota

ilmentyminen miR-217was lisääntynyt transfektoiduissa HGC-27-soluissa käyttäen miR-217 matkii (kuvio 3A) ja väheni käyttäen miR-217 estäjä (kuvio 3B). Leviämisen pelkistettiin HGC-27-solut transfektoitiin withmiR-217 jäljittelee verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu hajotus- tai käsittelemättömiä (kuvio 3C). Samaan aikaan, leviämisen korotettiin HGC-27 transfektoitu withmiR-217inhibitor verrattuna soluihin transfektoitu ohjaus tai hoitamaton (kuvio 3D). Invasiivisuus transfektoitujen solujen miR-217 matkii oli vähenikin ryntäily ryhmän tai kontrolliryhmän solujen ja miR-217 estäjä lisääntynyt soluinvaasiota verrattuna ryntäily ryhmän tai kontrolliryhmään soluissa (kuvio 3E).

miR -217 posttranskriptionaalisella vähentää GPC5 ilmentyminen suoraan kohdentamalla sen 3'UTR

analyysi käyttäen saatavilla algoritmeja osoitti, että GPC5 oli teoreettinen tavoite geenin miR-217 (kuvio 4A) [24]. Sen todistamiseksi, että miR-217 välittömänä kohteena GPC53'UTR, suoritimme lusiferaasireportterigeenianalyysissä. Ektooppinen Mir-217 vähensi lusiferaasiaktiivisuuden GPC5 villityypin reportterigeenin, mutta ei mutantti GPC5 3'-UTR, joka osoittaa, että miR-217 suoraan suunnattu GPC5 3'UTR (kuvio 4B). MRNA taso GPC5 väheni transfektion jälkeen miR-217 matkii ja lisääntynyt transfektion jälkeen miR-217 estäjällä qRT-PCR (Kuva 4C). Tämän mukaisesti tulos, kyky miR-217 säätelemään ilmentymistä GPC5 proteiinin varmistettiin western blottauksella (kuvio 4D).

Palauttaminen miR-217 inhiboi GPC5 välittämä GC solujen lisääntymistä ja invaasiota

yli-ilmentäminen GPC5 edisti GC solujen lisääntymisen ja invaasiota. Kun miR-217 matkivat ja pez-GPC5 kotransfektoitiin HGC-27-solut, miR-217 ilmaisun vähensi GPC5 aiheuttaman GC soluproliferaatiota ja invaasiota (kuvio 5A ja 5C). Esto GPC5 vähensi GC solujen lisääntymisen ja invaasiota. Kun miR-217 estäjä ja shGPC5 kotransfektoitiin HGC-27-solut, miR-217 estäjä edisti shGPC5-esti solujen lisääntymistä ja invaasiota (kuvio 5B ja 5D).

GPC5 ylössäädellään GC solulinjoissa ja yksilöt

ilmentyminen GPC5 oli korkeampi GC solulinjoissa (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) verrattuna GES-1, normaali mahan epiteelisolulinja (kuvio 6A). Proteiini tasot GPC5 olivat myös korkeampia GC kudoksissa kuin viereisillä noncancerous kudoksiin käyttämällä western blot (kuvio 6B).

Keskustelu

GC aiheuttaa lähes miljoona kuolemantapausta maailmanlaajuisesti vuodessa [25] . Äskettäin, varaamiseen tutkimusten mukaan miRNA ratkaisevassa asemassa patogeneesissä GC kautta säätelevät solujen lisääntymistä, apoptoosin, muuttoliike, mainokset invaasio [26-28]. Tässä tutkimuksessa miR-217 oli usein vaimentua ihmisen GC solulinjoissa ja kudoksissa ja alemman tason miR-217 liittyi pTNM vaiheessa GC. Edelleen tutkimukset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-217 voi estää GC solujen vaeltamiseen ja invaasiota. GPC5 tunnistettiin suora ja toiminnallinen kohteena miR-217. Voimme päätellä, että miR-217 näyttää olevan uusi tuumorisuppressori GC ja vaimentua miR-217 voi myötävaikuttaa kasvaimen kehittymisen ja etenemisen GC potilailla. Downregulation miR-217 on yleinen tapahtuma erilaisiin syöpiin, mikä viittaa sen tärkeä rooli kasvainten synnyssä [17-19]. Li ja hänen kollegansa osoittivat, että miR-217 oli alassäädetty selvästi solussa munuaissyövän (ccRCC) verrattuna pariksi normaalia kudosta [29]. Ala miR-217 ekspressiotaso liittyi korkeampi kasvaimen ja vaihe. Tässä tutkimuksessa miR-217 oli usein vaimentua GC. Kiehtovan, potilailla, joilla on pienempi ilmentyminen miR-217 yleensä olla kehittyneempiä TNM, mikä viittaa siihen, että heikkoa ilmentymistä ofmiR-217was liittyvät GC etenemiseen. Lisätutkimukset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-217 tukahdutetaan GC soluinvaasiota ja lisääntymistä. Yhdessä aikaisempien tulosten kanssa, nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-217might on ratkaiseva merkitys GC kudoksessa homeostaasin ja deregulatedmiR-217 voisi edistää kehitystä mahalaukun kasvain.

tutkimiseksi molekyylitason mekanismi tuumorisuppressorigeenin rooli Mir-217 GC, käytimme lusiferaasireportterista määritys ja western blot vahvistaa, että GPC5 oli tavoite miR-217 GC soluissa. Vahvista suoraa sääntelyä GPC5 by miR-217, käytimme GPC 3 'UTR reportteri vektori, jossa on potentiaalia miR-217 sitoutumiskohta valaisevassa reportteri. Lisäksi qRT-PCR ja western blot-määritys osoitti, että yli-ilmentyminen miR-217 esti GPC ilme. Glypicans ovat perheen proteoglykaanien, jotka liittyvät exocytoplasmic pinnan solukalvon kautta glukosylfosfatidyl inositoli ankkuri [30, 31]. Kuusi glypicans on todettu nisäkkäillä (GPC1 on GPC6) [32, 33]. GPC5 ilmentyy pääasiassa kehitysmaissa keskushermostossa, raajoissa, munuaisissa, keuhkoissa ja maksassa [34, 35]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että jotkut GPCs, erityisesti GPC3 andGPC5, saattaa olla tärkeä rooli säätelyssä syövän etenemisessä [35, 36]. Esimerkiksi Zhang
et al. osoittivat, että GPC5 oli hyvin ilmaistu SACC-M (high keuhko-metastaattinen solulinja) ja kliinisissä näytteissä syljen rauhasmainen kystisen karsinooma (SACC) tapaukset, joissa keuhkometastaasitestissä [36]. Yleinen ekspressiotaso GPC5 kliinisissä tapauksissa SACC keuhko etäpesäkkeitä oli suurempi. Williamson et ai. osoitti, että geeni, joka koodaa GPC5was amplifioitiin 20%: lla potilaista, joilla alveolaarinen rabdomyosarkooma (RMS), ja että tämä glypikaani yliekspressoitiin RMS potilailla. Lisäksi alas-säätely GPC5 ilmentymisen siRNA inhiboivat nopeudella RMS soluja. Toisessa tutkimuksessa havaittiin, että korkea GPC5 ilmaisun ennustettu huono postsurgical eloonjäämisajasta curatively noudatetaan pienisoluista keuhkosyöpää, mikä viittaa arvo GPC5 kuin molekyyli prognostinen indikaattori [35, 37]. Tutkimuksessamme ilmaus GPC5 oli korkeampi GC solulinjoissa ja proteiinin tasot GPC5 olivat myös korkeampia GC kudoksissa kuin viereisten noncancerous kudoksissa. Esto GPC5 vähensi GC solujen lisääntymisen ja invaasiota. Palauttaminen miR-217 esti GPC5 välittämä GC soluproliferaatiota ja invaasiota. Nämä tulokset osoittivat, että miR-217might toimii tuumorisuppressori mahasyövän kohdistamalla GPC5.

Yhteenvetona, esillä oleva tutkimus osoitti, että miR-217was vaimentua GC kudoksissa ja solulinjoissa. Alhainen miR-217 ilmentyminen liittyi pTNM vaiheessa potilaita. Kohdunulkoinen miR-217 ilmentyminen johti estoon GC solujen lisääntymisen ja invaasiota. Edelleen tutkimus osoitti, että GPC5 oli mahdollinen kohde miR-217. miR-217 voi toimia ennustaja ennuste ja terapeuttinen kohde GC potilaille.

tukeminen Information
S1 Taulukko. Yhteenveto kliinis parametrien potilaiden mahalaukun syöpä.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0125474.s001
(DOCX)
S2 Taulukko. Primer järjestyksessä.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0125474.s002
(DOCX) B

• PLoS ONE: MicroRNA-137 Auttaa Värinävaimennettu tuumorigeneesiä Human Mahalaukun Cancer by Targeting AKT2
• PLoS ONE: Survival Analysis of Potilaat Interval Cancer Undergoing mahasyövän Seulonta Endoscopy