PLOS ONE: intra-tumorale de HER2 Hétérogénéité, FGFR2, ÉÉGC et ATM dans le cancer gastrique: Optimisation de soins de santé personnalisés par Innovative analyse anatomopathologique et statistique

Résumé

Les efforts actuels de développement de médicaments sur le cancer gastrique sont dirigés contre plusieurs cibles moléculaires qui déterminent la croissance de cette tumeur. Intra-tumorale biomarqueur hétérogénéité cependant couramment observé dans le cancer gastrique, pourrait conduire à la sélection biaisée des patients. MET, ATM, FGFR2 et HER2 ont été profilées sur des échantillons de biopsie de cancer gastrique. Une évaluation pathologique innovante a été réalisée grâce à la notation des biopsies individuelles contre des biopsies entières à partir d'un seul patient pour permettre l'évaluation de l'hétérogénéité. Suite à cela, les risques de faux négatifs pour chaque biomarqueur ont été estimés in silico
. 166 cas de cancer gastrique avec plusieurs biopsies de patients individuels ont été recueillies de l'hôpital de Shanghai Renji. Après critères préétablis, 56 ~ 78% des cas ont montré faible, 15 ~ 35% ont montré moyen et 0 ~ 11% ont montré une forte hétérogénéité dans les biomarqueurs profilées. Si 3 biopsies ont été recueillies à partir d'un seul patient, le risque de faux négatifs pour la détection des biomarqueurs était proche de 5% (exception pour FGFR2: 12,2%). Lorsque 6 biopsies ont été recueillies, le risque de faux négatif approché de 0%. Notre étude démontre l'avantage de biopsies multiples lors de l'examen stratégie de biomarqueur de soins de santé personnalisé, et fournit un exemple pour relever le défi de intratumorale biomarqueur hétérogénéité en utilisant l'évaluation pathologique des méthodes alternatives et statistiques

Citation:. Ye P, Zhang M, Fan S, Zhang T, Fu H, Su X, et al. (2015) intra-tumorale de HER2 Hétérogénéité, FGFR2, ÉÉGC et ATM dans le cancer gastrique: Optimisation de soins de santé personnalisés par Innovative analyse anatomopathologique et statistique. PLoS ONE 10 (11): e0143207. doi: 10.1371 /journal.pone.0143207

Editeur: Daniele Generali, Instituti Ospitalieri di Cremona, ITALIE

Reçu 30 Juillet 2015; Accepté 2 Novembre 2015; Publié: 20 Novembre 2015

Droit d'auteur: © 2015 Ye et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le papier

financement:. AstraZeneca a parrainé cette étude. Le bailleur de fonds a fourni un soutien sous la forme de salaires pour les auteurs [PY, MZ, SF, TZ, HF, XS, PG et XY] et a fourni l'installation et de ressources pour mener cette étude. Les rôles spécifiques de ces auteurs sont articulés dans la section «auteur de contributions"

Intérêts concurrents:. Les auteurs affiliés à AstraZeneca sont des employés et /ou les parties prenantes d'AstraZeneca à temps plein. Cette étude a été commanditée par AstraZeneca. Cela ne modifie pas l'adhésion des auteurs de PLoS ONE politiques sur les données et les matériaux de partage. Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'autres intérêts concurrents.

Le cancer gastrique Introduction (GC) est l'un des cancers les plus fréquents dans le monde, avec près de la moitié de tous les cas qui se produisent en Asie orientale (principalement Chine), et est la troisième principale cause de décès liés au cancer dans le monde [1]. Bien que l'incidence est en baisse, la plupart des cas de GC sont diagnostiqués à un stade avancé et le pronostic de la maladie reste faible [2]. La médiane de survie pour GC métastatique est inférieure à un an, alors que le taux global de survie à 5 ans est inférieure à 7% [3].

hétérogénéité intra-tumorale est couramment observée dans GC. Dans les années 1980, de Aretxabala et al
évalué 222 échantillons provenant de 37 cas de GC et a trouvé un mélange de diploïdes et aneuploïdes échantillons ou différents stemlines aneuploïdes dans le même cas (le contenu que l'on appelle l'hétérogénéité de l'ADN) dans 33% des primaires Les tumeurs [4]. Une étude similaire réalisée par Yonemura et al
a montré une teneur en ADN hétérogénéité de 69% dans 65 échantillons de GC réséqués [5]. Récemment, Yang et al
échantillons GC évalués de 148 patients et a révélé un taux d'hétérogénéité de 79,3% dans le récepteur du facteur de croissance épithélial humain 2 (HER2) surexpression de protéines et 44% en l'amplification du gène
HER2 [6]. En conséquence, l'hétérogénéité intra-tumorale élevée observée dans GC est susceptible de contribuer à la résistance au traitement et le pronostic des patients les plus pauvres [7, 8], et représente finalement un problème sans réponse considérable face par des cliniciens, des pathologistes et des chercheurs
.

Plusieurs cibles moléculaires disposent actuellement soit des traitements médicamenteux approuvés ou thérapeutiques prometteurs en cours de développement clinique en GC. HER2 joue un rôle important dans la tumorigenèse du cancer du sein, le cancer de l'ovaire et le cancer gastrique [9] et le trastuzumab, un anticorps monoclonal dirigé contre HER2, a été approuvé pour le traitement de GC [10]. Le gène mésenchymateuse épithéliale facteur de transition (MET) code pour une protéine qui est le seul connu pour le récepteur du facteur de croissance des hépatocytes (HGF), le ligand [11]. L'amplification du gène de MET et surexpression de la protéine se sont révélés conduire à l'activation constante de la voie de signalisation de MET, qui contribue à la croissance tumorale, l'angiogenèse et les métastases [12]. Plusieurs inhibiteurs de MET sont actuellement en cours d'essais cliniques de GC, y compris Savolitinib (Phase 1 (NCT02252913) [13]) et AMG337 (Phase 2 (NCT02016534)). De la même façon, le récepteur de fibroblaste de facteur de croissance 2 (FGFR2) est également impliquée dans la prolifération cellulaire, la différenciation et la mobilité et l'amplification du gène FGFR2 de joue un rôle important dans la tumorigenèse du GC, soulignant ainsi l'attrait que le développement de médicaments cible [14-16]. Ataxie télangiectasie muté (ATM) est une protéine kinase appartenant à la phosphatidylinositol 3 'kinase (PI3K) famille, et dans des conditions normales est activé en réponse à des cassures double brin d'ADN [17]. déficience ATM est liée à une forte incidence de tumeurs malignes des tissus [18-20] et les tumeurs déficientes en cellules ATM sont sensibles à la poly (ADP-ribose) polymérase-1 (PARP), une inhibition, une cible potentielle qui a été proposé pour le traitement de GC dans plusieurs études antérieures [21-24]. Lynparza, le premier américain et européen approuvé par inhibiteur de PARP ciblant BRCA1 /2 cancer de l'ovaire mutant, est actuellement en cours d'un essai clinique de phase III en GC (NCT01924533) et en utilisant une approche patiente sélection de biomarqueurs en utilisant l'expression ATM par IHC (publication dans la presse) .

Dans l'ère actuelle du développement des médicaments moléculairement ciblés, les biomarqueurs devraient prédire précisément la réponse clinique [25]. hétérogénéité tumorale élevée cependant, peut conduire à un biais de détection de biomarqueurs si les échantillons sont obtenus à partir d'une région de la tumeur petite plutôt que le tissu tumoral entier (échantillons par exemple résection chirurgicale sont généralement 2 cm x 2 cm seulement). En revanche, les échantillons de biopsie sont généralement obtenus à partir de différentes régions de la totalité de la tumeur et sont susceptibles d'être plus représentatif de l'ensemble le statut d'expression de biomarqueurs des patients, plaidant pour leur potentiel de réduire l'impact de l'hétérogénéité intra-tumorale sur le biais de la sélection des patients.

dans notre étude, afin de mieux évaluer l'hétérogénéité intra-tumorale, nous avons utilisé une biopsie chirurgicale comme notre stratégie d'échantillonnage de la tumeur. En outre, nous avons effectué une évaluation pathologique novatrice à travers la notation des biopsies individuelles contre des biopsies entières de patients individuels. Ici, nous avons également utilisé des méthodes statistiques pour estimer les risques de détection de faux négatifs lors de l'analyse des nombres finis de biopsies afin de comprendre la relation entre le nombre de biopsies et le risque de sélectionner un patient faux positif pour un traitement ou d'inclusion particulier dans un essai clinique .

Matériel et méthodes

l'information des patients

Archivé GC échantillons de biopsie ont été prélevés sur 166 patients qui ont reçu un examen gastroscopie avec biopsies multiples des zones de chaque patient de tumeurs entre 2007 et 2014 à l'hôpital Renji, Shanghai, Chine. Le consentement préalable éclairé écrit a été obtenu de tous les patients et le protocole d'étude a été approuvé par le comité d'examen institutionnel hôpital Renji. Tous les échantillons ont été examinés par deux pathologistes formés pour le diagnostic de GC et quarante échantillons ont été exclus de l'étude en raison de la qualité des tissus pauvres.

immunohistochimie (IHC)

paraffine (FFPE) échantillons fixés au formol et ont été sectionnés à une épaisseur de 4 um. Pour MET coloration, un anticorps monoclonal anti MET lapin-total (ÉÉGC SP44, Ventana Medical Systems, AZ, USA) a été utilisé et le test a été effectué sur une coloration automatique (Discovery XT, Ventana Medical Systems, AZ, USA). ATM coloration a été réalisée en utilisant un anticorps monoclonal de lapin anticorps anti-ATM (ab32420, Abcam, MA, USA) sur un Autostainer (Thermo Scientific, MA, USA). HER2 coloration a été réalisée en utilisant le kit de HercepTest (DAKO, Danemark) selon les instructions du fabricant sur une coloration automatique (Discovery XT, Ventana Medical Systems, AZ, USA).

Fluorescence hybridation in situ (FISH)

Le FISH test à double couleur a été réalisée comme décrit précédemment [26]. Les sondes de HER2 /CEP17 ont été achetés chez Vysis (IL, USA;. Cat-171060). MET
et Les sondes FGFR2 de marquage ont été préparés par BAC (CTD-2270N20 et RP11-62L18, respectivement) ADN avec Red-dUTP (Enzo Biochem, NY, USA;. CatN;23- 050), CEP10
-Spectrum vert et CEP7
-Spectrum sondes vertes ont été achetés auprès de Vysis (Cat. -112010 et 32-132007 #, respectivement) et utilisés comme contrôles internes pour FGFR2
et les sondes MET

évaluation de la pathologie sur des biopsies

sur la base de H &. E coloration, chaque biopsie avec des cellules tumorales adéquates (plus de 50 les cellules tumorales) a été tout d'abord marquées par un pathologiste. Ensuite, l'état de biomarqueurs dont IHC et FISH coloration du MET, ATM, FGFR2 et HER2 ont été évalués sur chaque biopsie. Les scores individuels pour chaque biomarqueur ont été donnés à chaque biopsie (figure 1)

Selon le procès MetMAb en GC (NCT01662869), pour MET IHC coloration, une biopsie montrant IHC 3+ est défini comme positif. MET FISH, biopsie montrant MET de copie moyen du gène numéro ≥ 5 est défini comme positif. Depuis le procès en cours pour un autre inhibiteur de MET, AZD6094 (NCT02449551), utilisations le nombre de copies moyen du gène de MET ≥ 4 comme coupé pour un seul groupe de traitement de l'agent sur les patients du GC, nous avons encore divisé le groupe négatif FISH MET en deux sous-groupes ( gène MET de copie nombre moyen ≥ 4 et < 5, et gène nombre moyen <copie du MET; 4). Pour ATM coloration IHC, biopsie montrant IHC 0 est défini comme négatif selon le procès Olaparib (NCT01063517). Pour FGFR2 FISH, biopsie montrant l'amplification du gène de FGFR2 (copie moyenne en nombre ≥ 6) est défini comme positif selon les essais de AZD4547 (NCT01457846) et dovitinib (NCT01719549). Pour HER2, biopsie montrant HER2 IHC 3+ ou HER2 IHC 2+ plus gene amplification de HER2 est définie comme positive selon ToGA essai (NCT01041404).

Pour MET IHC, MET FISH, FGFR2 FISH et HER2, cas avec tout
des biopsies montrant positifs sont définis comme des cas positifs. Pour ATM coloration IHC, les cas avec toutes les biopsies montrant négatives sont définies comme des cas négatifs

Hétérogénéité degré d'évaluation

Après l'examen du pathologiste, le degré de biomarqueur hétérogénéité a été déterminée selon les critères suivants:.

Haute hétérogénéité: < 25% des biopsies avec MET IHC 3+, l'amplification du gène de MET, ATM IHC 0, L'amplification du gène de FGFR2 ou positivité HER2

hétérogénéité moyenne:. 25% ~ 50% des biopsies avec MET IHC 3+, l'amplification du gène de MET, ATM IHC 0, l'amplification du gène, ou HER2 de FGFR2 positivité

faible hétérogénéité:. ≥50% biopsies avec MET IHC 3+, l'amplification du gène de MET, ATM IHC 0, l'amplification du gène, ou HER2 de FGFR2 positivité.

Pour MET IHC, MET FISH, FGFR2 FISH et positivité HER2, les pourcentages moyens de biopsies positives dans un cas particulier parmi les cas positifs ont été calculés. Pour ATM IHC, le pourcentage moyen de l'ATM IHC biopsies négatives dans un cas particulier parmi les cas avec au moins un ATM biopsie négative a été calculée. Les intervalles de 95% de confiance des valeurs moyennes ci-dessus ont été évalués par bootstrapping.

risque de fausse détection négative évaluation

Pour chaque biomarqueur et un nombre prédéfini de biopsies n
(0 < n < nombre maximal de biopsies provenant d'un échantillon), tous les scénarios possibles de choisir n
biopsies de chaque échantillon et de faire une détermination du statut du biomarqueur de l'échantillon en fonction de la n
biopsies choisies ont été générées informatiquement.

sur la base des scénarios énumérés ci-dessus, les risques de détection de faux négatifs ont été évalués. Pour MET IHC, MET FISH, FGFR2 FISH et positivité HER2, le risque de détection de faux négatifs avec n
biopsies de chaque échantillon a été défini comme le nombre prévisible du ratio entre le nombre d'échantillons positifs qui ont négatif les résultats de la détection avec n
biopsies et le nombre total d'échantillons positifs. Pour ATM IHC, le risque de détection de faux négatifs avec n
biopsies de chaque échantillon a été défini comme la valeur attendue du rapport entre le nombre d'échantillons non-négatifs avec toutes les biopsies négatives avec n
biopsies de chaque échantillon, et le nombre total d'ATM échantillons non-négatifs.

Tous les calculs étaient exacts sauf ATM IHC avec une biopsie de chaque échantillon en raison du très grand nombre de scénarios possibles. Pour ATM IHC avec une biopsie de chaque échantillon, le risque de fausse détection négative a été estimée en prenant un sous-ensemble aléatoire de 30 échantillons non-négatifs sans remplacement à la fois, le calcul du risque de fausse détection négative dans le sous-ensemble, en répétant le processus 22.000 fois et en prenant une moyenne des risques de fausse détection négative des 22.000 sous-ensembles aléatoires. En outre, 95% Intervalle de confiance de ce risque estimé a été signalé.

Aperçu des numéros de biopsie du GC dans les échantillons cliniques

Dans cette cohorte, le nombre

Résultats de la biopsie échantillons à partir d'un seul patient variait de 1 à 9, avec la médiane des deux biopsies totales et positives (avec des cellules tumorales) à 4. le nombre de biopsies positives étaient un peu moins que le nombre de biopsies totales. Cas avec 3 ~ 4 et 5 ~ 6 biopsies positives ont représenté 47% et 25% respectivement de tous les échantillons prélevés (figure 2).

diplôme Hétérogénéité et évaluation négative faux

Dans le 18 cas positifs MET IHC (figure 3A), 61% des cas ont montré faible hétérogénéité, tandis que 33% ont montré moyen et 5,5% ont montré une forte hétérogénéité. Le pourcentage moyen de biopsies positives MET dans un cas particulier parmi ces 18 cas positifs était de 65,78% (IC à 95%: 52,14% -79,60%). Le taux de détection de faux négatifs MET a été estimé à environ 3,39% avec 4 biopsies et a approché 0% lors de l'échantillonnage 6 biopsies (figure 4A)
.

Dans les 13 MET FISH cas positifs (figure 3B), 77% de la des cas ont montré faible hétérogénéité, tandis que 15% ont montré moyen et 8% ont montré une forte hétérogénéité. Le pourcentage moyen de MET FISH biopsies positives dans un cas particulier parmi ces 13 cas positifs était de 74,05% (IC à 95%: 57,53% -89,10%). Le taux de détection de faux négatifs MET FISH a été estimé à environ 3,30% avec 4 biopsies et a approché 0% lors de l'échantillonnage 7 biopsies (figure 4B). En outre, la corrélation significative a été trouvée entre le score MET IHC et les résultats FISH MET (p < 0,01, κ = 0,62, test exact de Fisher)

Dans les 58 cas avec au moins un ATM biopsie négative (figure 3C) , 62% des cas montré une faible hétérogénéité, tandis que 35% ont montré moyen et 3,6% ont montré une forte hétérogénéité. Le pourcentage moyen de l'ATM IHC biopsies négatives dans un cas particulier parmi ces 58 cas était 63.07% (IC à 95%: 54,93% -71,39%). Le taux de détection de faux négatifs ATM IHC a été estimé à environ 0,19% avec 4 biopsies, et a approché 0% avec 5 biopsies (figure 4C).

Dans les cas positifs 9 FGFR2 FISH, 56% des cas ont montré faible hétérogénéité, tandis que 33% ont montré moyen et 11% ont montré une forte hétérogénéité (Fig 3D). Le pourcentage moyen de FGFR2 FISH biopsies positives dans un cas particulier parmi ces 9 cas positifs était 56.30% (IC à 95%: 36,85% -76,85%). Le FISH FGFR2 taux de détection de faux négatifs a été estimé à environ 3,70% avec 4 biopsies et a approché 0% avec 6 biopsies (figure 4D)
.

Dans les 32 cas positifs HER2, 78% des cas montré une faible hétérogénéité, tandis que 22% ont montré l'hétérogénéité moyenne et aucun des cas a montré une forte hétérogénéité (Fig 3E). Le pourcentage moyen de biopsies positives HER2 dans un cas particulier parmi ces 32 cas positifs était 75,16% (IC à 95%: 65,88% -85,11%). Le taux de détection de faux négatifs HER2 a été estimé à environ 0,21% avec 4 biopsies et a approché 0% avec 5 biopsies (figure 4E).

Discussion

intra-tumorale biomarqueur hétérogénéité a longtemps été un problème dans la sélection des patients pour les essais cliniques et, par conséquent, la compréhension de l'hétérogénéité de la tumeur est cruciale pour la réussite du déploiement d'un biomarqueur (PHB) stratégie des soins personnalisés. Cependant, peu d'études ont jusqu'ici abordé ce problème et il n'y a pas de stratégie standardisée pour mesurer le degré d'hétérogénéité de la tumeur. Dans cette étude, nous avons pris une nouvelle approche en marquant chaque biopsie individuelle et le calcul du niveau d'hétérogénéité au sein de chaque cas. Nos résultats ont montré que des niveaux élevés d'hétérogénéité ont été seulement trouvés dans 0 ~ 11% du positif (ou négatif pour ATM) des cas, alors que la plupart des cas positifs (56% ~ 78%) ont montré faible hétérogénéité, ce qui indique un niveau relativement faible de l'hétérogénéité des nos biomarqueurs choisis dans cette cohorte de cas de GC.

en outre, nous avons également procédé à des évaluations faux négatifs pour chaque biomarqueur pour estimer les taux de faux négatifs associés à la collecte de divers numéros de biopsies. Les résultats ont montré que, lorsque 3 ou plusieurs biopsies ont été recueillies, les risques de faux négatifs étaient près de 5% pour tous les biomarqueurs testés (7.14%, 5.16%, 0.86% et 1.41% respectivement pour MET IHC, MET FISH, ATM IHC et HER2 ). Ce nombre (3-4 biopsies) est à peu près équivalent au nombre moyen de biopsies recueillies dans la pratique clinique pour cette cohorte et en tant que telle, indique le risque relativement faible de faux négatifs associés à ces biomarqueurs dans notre cohorte. Une exception que FGFR2 FISH a montré un taux de faux négatifs plus élevé (12,2% de taux de faux négatifs pour 3 biopsies), pourrait être due à la taille de l'échantillon de FGFR2-positif limité (9 échantillons positifs). Quand un total de 6 biopsies ont été recueillies à partir d'un seul patient, le risque de faux négatif pour MET, ATM, FGFR2 et HER2 approché 0% dans cette cohorte. Ces résultats fournissent un exemple de la façon dont l'augmentation du nombre de biopsies pourrait être utilisé pour relever le défi de l'hétérogénéité des biomarqueurs dans le déploiement des approches cliniques de sélection des patients.

Compte tenu de l'importance de la sélection précise des patients dans les essais cliniques, nous croyons fermement que la lutte de manière adéquate biomarqueur hétérogénéité est essentielle au succès. Par exemple, MetMAb a montré une amélioration significative à la fois sans progression de la survie (2,9 vs 1,5 mois) et la survie globale (12,6 vs 3,8 mois) [27] dans une étude de phase 2 (NCT01590719) Toutefois, cette amélioration n'a pas transféré avec succès à la mise en phase 3 (NCT01662869). Notamment, MET surexpression de la protéine (par IHC) a été choisi comme un patient critères de sélection [28]. Bien qu'il soit encore un sujet de débat, il est possible que la promesse de MetMAb en phase 2, mais son échec dans la phase 3 était au moins en partie une conséquence de l'hétérogénéité de la tumeur, et une incapacité de la stratégie de sélection des patients (IHC) pour répondre vigoureusement la défi de l'hétérogénéité intra-tumorale en GC.

Enfin, nous avons également comparé le taux de positivité (ou taux de négativité pour ATM) des biomarqueurs détectés dans cette cohorte d'échantillons de biopsie avec les échantillons chirurgicaux de nos études précédentes ( Tableau 1). À l'exception de l'ATM, les deux biopsies chirurgicales et des échantillons ont été prélevés dans le même hôpital local. Les résultats ont montré que, bien que les taux de positivité sont plus élevés (pour l'ATM, les taux de négativité sont plus faibles) dans les échantillons de biopsie, les résultats globaux dans les échantillons de biopsie ont été similaires aux échantillons chirurgicaux. Cette augmentation du taux de positivité (ou diminution du taux de négativité pour ATM) est probablement expliquée par la détection de cas positifs en utilisant des biopsies multiples qui ont été manquées en utilisant des stratégies d'échantillonnage précédentes (ie. Résections chirurgicales).

Pris ensemble, cela étude a relevé le défi de l'hétérogénéité de la tumeur à partir d'un angle innovant en utilisant des biopsies à l'approche d'échantillonnage de la tumeur et donnant biomarqueurs scores individuels à chaque biopsie. Nos résultats montrent un niveau d'hétérogénéité entre les biomarqueurs analysés dans cette cohorte relativement faible. Néanmoins, le degré d'hétérogénéité au sein d'autres cohortes de patients peut être différent et doit être analysée au cas par cas. De plus, nos résultats ont montré une diminution du taux de détection de faux négatifs correspondant à une augmentation du nombre de biopsie pour tous les biomarqueurs testés ici, ce qui démontre l'avantage de biopsies multiples et servant, par exemple, de traiter l'hétérogénéité intra-tumorale à l'aide de méthodes statistiques.

Remerciements

Nous remercions AstraZeneca pour le parrainage de cette étude.

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